Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro Yaklaşım

Summary

Ile bitki hücreleri için birden fazla viral bileşenlerinin teslim senkronize etmek için basit, verimli ve sağlam bir yol

Abstract

Insan, hayvan ve bitkiler, yavrulama encapsidation olgun ve kararlı virionlar içine kadar pozitif polariteli RNA genomu patojen olan virüsler belirli bir konak enfeksiyon kurulması sırasında bir kardinal aşamasıdır. Sonuç olarak, encapsidation çalışma know-how bulaşıcı virionlar oluşturmak için virüs montaj düzenleyen mekanizmasının ilişkin bilgileri tercümesini. Bu bilgiler, virüs yaymak ve hastalık kontrolü düşürücü yeni yöntemler oluşturulmasında hayati önem taşımaktadır. Virüs encapsidation in vivo ve in vitro olarak ele alınabilir. In vivo Genom encapsidation makromoleküler etkileşimleri ve hücre içi kompartımanlara içeren oldukça düzenli bir seçici bir süreçtir. Bu nedenle, in vivo virüs encapsidation kapsayan olaylar virüsler çoğalır ve montajı nasıl anlamak için temel bilgi sağlayacaktır incelemek önde gelen eğitim. Son zamanlarda in vitro encapsidation biyomedikal ima alanında araştırma için istismar edilmiştirging ve terapötik uygulamalar. Zarfsız bitki virüslerinin negatif yüklü yabancı madde in vitro encapsidation içinde bir girişim çok daha önde duruyor. Brom mozaik virüsü (BMV), bitkiler için bir zarfsız çok bileşenli bir RNA virüsünün patojenik, in vivo ve in vitro paketleme genomunun çalışmak için bir model olarak sistemi kullanılmıştır. Nicotiana benthamiana bitkilerde encapsidation testlerde, Agrobacterium geçici ifadesi, agroinfiltration dediğimiz aynı hücreye birden çok bileşenden senkronize teslimat ve ifade için verimli ve güçlü bir tekniktir. Bu yaklaşımda, desiredviral mRNA'ların cDNAlarının taşıyan ikili plazmid vektörler taşıyan Agrobacterium tumefaciens bir hücre süspansiyonu 1 ml tek kullanımlık şırınga (iğne olmadan) daha karmaşık bir şey kullanarak hücrelerarası boşluk withina kanadı içine sızmış edilir. Bitki hücrelerine DNA ekleme devri içinde Bu işlem sonucu; T-DNAinsert çekirdeğinde geçici olarak kalır ve daha sonra ev sahibi polimeraz II transkripsiyonu olduğunu, geçici ekspresyonunu. Çıkan mRNA transkript (kep ve polyadenylated) sonra çeviri için sitoplazma ihraç edilmektedir. Inkübasyon yaklaşık 24 ila 48 saat sonra, infiltre yaprakların bölümleri microscopyor biyokimyasal analizler yapılabilir. Agroinfiltration eşzamanlı olarak transfekte edilmesi için hücreler, çok sayıda (yüz binlerce) verir. In vitro encapsidation içinde için, BMV arındırılmış virionlar santrifüjle RNA ve un-ayrışmış virionlar uzaklaştırılması ile devam ayrışma tampon içeren kalsiyum klorür karşı diyaliz tarafından kapsid proteini içine ayrışmış bulunmaktadır. Genom tüketilmiş kapsid proteini alt birimden daha sonra arzu edilen viral genom bileşenleri veya bu tür boya indosiyanin gibi viral olmayan bileşenleri ile yeniden birleştirilen edilir.

Protocol

1. Bitki materyali

1. Encapsidation deneyinde kullanılacak Nicotiana benthamiana bitkilerin yapraklı 4 aşama (yaklaşık 3-4 hafta yaşında bitkiler) olmalıdır.

2. Fonksiyonel viral genomun bileşenlerinin Teslimat ve ifade agroinfiltration tarafından hücreleri bitki

1. 1. Gün: Agrobacterium suşu (örn. EH 105 veya GV 3101) pCass-BMV RNA 1, BMV RNA 2 ve RNA 3 BMV ^1,2 barındıran 50 kanamisin mg / ml ile desteklenmiş LB agar yetiştirilmektedir (için seçer pCASS vektör) ve rifampisin 100mg/ml () Agrobacterium için seçer. Kuluçka, iki gün süre ile 28 ° C sıcaklıkta yapılmaktadır.
2. 3. Gün: 50 mg / kanamisin ve 28 az 1 gün boyunca 100 mg / rifampisin ml ° 250 RPM hızında ayarlanmış orbital karıştırıcıda C ml'lik LB suyu 2 ml'lik LB agar plakadan İnokülasyon tek koloni.
3. 4. Gün: LB suyu takviyesi 50 ml inoküleed 50 ile mg / kanamisin ve rifampicin ve 100 mg / ml, 10 mM MES pH 5.6 ml ve 100 mM 28 azından 16 saat boyunca Erlenmeyer şişesinde bir 250 ml'lik kültür biri ml acetosyringone çalkalamalı ° C'de 250 RPM'de .
4. 5. Gün: 4 ° C'de 5000 rpm'de 10 dakika boyunca bir meşe sırtı tüp veya steril Falcon tüpü ve santrifüj (OD ₆₀₀ 1.0 ulaştığında) kültür aktarın
5. Bu aşama, bir antibiyotik tamamen çıkarılması sağlamak üzere bir kez daha tekrarlama, 4 ° C'de 5.000 rpm'de 10 dakika boyunca 10 mM _MgCl2 ve santrifüj 10 ml pelet içinde çözülür.
6. 10 mM _MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6) ihtiva eden 10 ml tampon içinde askıya pelet.
7. BMV RNA 1, RNA 2 ve RNA 3 her kültür için OD ₆₀₀ ölçün ve 10 mM _MgCl2 ve 10mM MES (pH 5.6) kullanılarak 0.1 OD ₆₀₀ ayarlayın.
8. 1 ml her üç 0.1 OD ₆₀₀ kültür süspansiyonlar karıştırın.
9. Acetosyringone 100 mM, mix gent eklely ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında karışıma bozulmamış tutmak.
10. 1 mL kültür süspansiyon çizin. İğne olmadan şırınga.
11. N. 2-3 iyi genişletilmiş yaprak eksen dışı tarafına yukarıda kültür süspansiyon Infiltrate yavaşça yaprak eksen dışı yüzeyinin yarısına şırınga basarak benthamiana (evre 5 yaprak, 3-4 haftalık bir bitki).
12. Diğer yaprakları için bu sızma işlemi tekrarlayın.
13. 24 ° C ile yeşil evde infiltre bitkiler tutun
14. Hasat 4 gün sonrası infiltrasyon (dpi) yaprakları 3 sızmış.

3. BMV virionlar saflaştırılması

1. N. toplayın benthamiana üç vahşi tip BMV agrotransformants ihtiva eden bir karışım ile agroinfiltrated bırakır.
2. 0,08 M ​​MgAc, pH 4.5 ve kullanılmadan önce ilave edilir β-mercaptoethanol ile 1/100 hacim; BMV ekstraksiyon tamponu (0.5 M NaAc arasında eşit hacimde (w / v) içeren bir steril havaneli ve havanda yapraklar öğütmek) ^3. Virüs verimi en üst düzeye çıkarmak için, taşlama kolay ve verimli hücre parçalama kolaylaştırır asit yıkanmış kum (~ 0.5-1 gr) eklenmesi önerilir.
3. Muslin kumaş 2-3 katmanları üzerinden yaprak süzülür ve telaş toplamak.
4. Yine yaprak malzemenin ilk ağırlığına BMV ekstraksiyon tamponu eşit hacmi ile muslin kumaş üzerine tutulan kısmı eziyet.
5. Muslin kumaş kullanılarak filtrasyon işlemi tekrarlayın. Bu adımlar, 4 ° C de yapılmalıdır
6. Bir santrifüj tüpüne aktarılır ve süzüntü çözeltinin süspansiyon renk açık yeşil olana dek oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ön-soğutulmuş ve kloroform vorteks ile eşit hacimde (veya titreme) ilave edilir.
7. 4 at 12,000 RPM 15 dakika emülsifiye çözüm santrifüjleyin ° C
8. Sulu faz, toplamak ve kalan kloroform kaldırmak için manyetik bir karıştırma düzeni üzerinde 30 dakika boyunca karıştırılır.
9. Steril bir ultrasantrifüjdeki tüpüne süspansiyon aktarın.
3 olarak% 10 sukroz (virüsü ekstraksiyon tampon içinde hazırlanmıştır).
10. 4 de, bir Beckman ultrasantrifüjdeki 3 saat süreyle 30,000 rpm'de santrifüje ° C.
11. Süpernatant atın ve (steril saf su ile 1/10 süspansiyon tampon seyreltik BMV ekstraksiyon tamponu hazırlamak için) BMV süspansiyon tamponu istenilen hacimde pelet askıya.
12. Yukarıda adım ikinci kısmen saflaştırılmış virion hazırlanması 4 ° C'de 28.000 rpm'de 150 dakika için% 10-40 sukroz yoğunluk gradyanı santrifüje tabi tutulur
13. El ile veya bir parçalama tarafından virüs bant toplayın. Virüs bantlı beyaz ışık aydınlatması altında mavi görünecektir.
14. Virüs süspansiyon tamponu ile en azından% 50 virüsü Örnek içeren sukroz çözeltinin.
15. 4 bir Beckman ultrasantrifüjdeki 30,000 rpm'de 3 saat boyunca seyreltilmiş virüs içeren sakaroz çözeltisini santrifüjleyin ° C
16. Son olarak Vir istenen bir hacmi yüksek oranda saflaştırılmış virüs pelet askıyabize süspansiyon tampon.
17. OD ₂₆₀ spektrofotometre kullanılarak virion (mg / ml) konsantrasyonu ölçülür.

Not: RNA içeriğine dayanılarak, BMV için yok olma katsayısı 5 ^{4 olur.}

19. TEM ile görüntüleyerek virionlar saflığını (Şekil A) doğrulayın

4. In vitro montaj için kapsid protein alt biriminin hazırlanması

1. ⁵ 1x virüsü ayrışma tamponu (; 50 mM Tris HCI, pH 7.5;; 1.0 mM EDTA 1.0 mM DTT ve 0.5 mM PMSF 0.5 M _CaCI2), 1 litre hazırlayın.
2. Sambrook et al ^6'ya göre diyaliz membran hazırlayın.
3. Bir diyaliz torbasına virüs saflaştırılmış gerekli konsantrasyonu dağılır.
4. 1x virüs ayrışma tampon içeren behere virüs içeren diyaliz çantası yerleştirin.
5. 4 ° C de 24 saat whil Dialyzee karıştırma.
6. 4 azından 15 dakika süreyle 12,000 x g'de 24 saat ve sonra santrifüj diyaliz torbasından çözeltisi Collect ° C. Bu ayrışmış virionlar gelen BMV RNA ayıracaktır.
7. 4 pelet ° C herhangi bir un-ayrışmış virüs parçacık 3 saat Beckman santrifüj 35,000 rpm süpernatan ve santrifüj toplayın.
8. Süpernatant toplayın.
9. Bu aşamada ayrışmış kapsid protein alt biriminin herhangi bir tehlike virion RNA alınması zorunludur. Bunu yapmak için, adım 8 yüzen bir yüksek hızlı santrifüj (3 saat az 30.000 rpm ardından herhangi bir RNA (RNA 1x montaj tampon, aşağıya bakınız) eklemeden kapsid protein alt biriminin reassembly gece boyunca bir tur tabi tutulmalıdır 4 ° C) pelet bir araya virionlar için. Bu reassembly adımdan sonra, süpernatant içeren kat protein alt biriminin herhangi bir kalıntı kirletici RNA ücretsiz olacaktır. Bununla birlikte, bu sağlamak için, bu v ek bir gerçekleştirmek için tavsiye edilirreassembly RNA 1x montaj tampon kullanarak tek kat protein alt birimleri ile itro. Reassembly gece boyunca sonra, hazırlık (TEM kullanarak doğrulamak) monte virionlar arındırılmış olmalıdır.
10. OD 254 ve 280 nm'de ölçerek veya Bradford deneyi gibi diğer yöntemler ile kapsid proteini alt birimlerinin konsantrasyonunu belirlemek.
11. % 12-15 disosiye kapsid protein alt biriminin bütünlüğünü belirlemek için western blot takip SDS-PAGE gerçekleştirin.

5. RNA in vitro montajında ​​virionlar içeren

1. Virionlar içine tekrar monte edilmesi RNA transkript hazırlayın ve konsantrasyonu ⁷ hesaplayabilirsiniz.
2. Kapsid protein alt biriminin karıştırın ve 1:5 (ağırlık / ağırlık) ⁵ oranında transkript RNA.
3. Bir diyaliz torbasına yukarıdaki karışımı dağıtın ve doğru bir sızıntıları önlemek için güvenli.
4. 1.000 ml hazırlayın. ⁵ RNA 1x montaj tamponu (; 50 mM Tris-HCl, pH 7.2;; 10 mM KCl 5 mM _MgCl2, 1.0 mM DTT, 50 mM NaCl).
5. Behere 1x montaj tampon karşı reaksiyon karışımını içeren diyaliz torbası koyun ve karıştırın.
6. Nazik karıştırılarak 24 saat boyunca 4 ° C'de yeniden birleştirme reaksiyonu Dialyze.
7. 24 saat sonra diyaliz torbasından karışımı toplayın ve RNA montaj tamponu 1.5 ml ekleyin.
8. 30 dakika daha düşük hızda (2000 x g) santrifüj edilerek bir Centricon-100 sütunu üzerinden bu karışım geçmektedir.
9. 30 dakika süre ile 4 ° C'de montaj tamponu ile bir kez 1.5 ml kolon yıkanır.
10. Iki kez yukarıdaki yıkama adımı tekrarlayın.
11. Son olarak, 4 azından 10.000 g'de santrifüje edilerek yeniden monte virionlar elüt edilmesi ° C'de 5 dakika için.
12. OD 260 nm virion konsantrasyonu tahmin.

6. Optik Viral Ghosts of Fabrikasyon (OVGs)

1. Bir istenilen konsantrasyon oranı (bu raporda kullanılan yeşil ve kapsid protein İndosiyanin ağırlık oranı 1:10 idi) az saflaştırılmış kapsid protein green (ICG) ⁸ İndosiyanin ekle d pipetleme ile iyice karıştırın.
2. 24 saat boyunca 4 ° C'de OVG montaj tamponu (ve 1 mM DTT, pH4.8, 50 mM NaAc;; 1 mM EDTA 1 M NaCl) karşı kapsid protein ve ICG solüsyonu Dialyze.
3. 24 saat sonra, 4 'de 1 saat için 90,000 rpm'de diyaliz torbası (12 kDa gözenek boyutu) ve santrifüj gelen çözelti toplamak ° C (Şema B)
4. 4 ° C'de vorteks veya bir gecede BMV süspansiyon tampon kendisi tarafından askıya izin vererek Süpernatantı ve BMV süspansiyon tampon pelet askıya
5. TEM (Şekil C) OVGs morfolojisini doğrulayın.
6. 240 nm spektrofotometre (Cary 50, Varian Inc) kullanarak 950 nm absorbansı ölçülür; ICG varlığı 700 nm ve 790 nm ⁸ civarında imza absorbans pikleri ile teyit edilir. (Şekil D)
7. ~ 700 nm ve 800 nm '~ tipik ICG floresans zirveleri spectrofluorometer kullanılarak OVG çözeltisinin 620 nm eksitasyon (Şekil D) (Fluorolog 3, Jobin-Yvon) üzerine görülebilir.

_title "> 7. Temsilcisi Sonuçlar

N. arınmış olumsuz lekeli BMV virionlar Şekil A. TEM görüntüsü benthamiana bitkiler üç vahşi tip BMV agroconstructs (ölçekli bar = 100 nm) oluşan bir karışım ile agroinfiltrated.

In vitro Şekil B. Pelet yüksek hızda santrfüj uygulanmıştır ihtiva OVGs ICG toplandı.

Olumsuz lekeli ICG içeren OVGs Şekil C. TEM görüntüsü (scale bar = 100 nm).

OVGs Şekil D. Absorbans (Üst) ve floresan (alt) spektrumları. OVG emisyon w için kullanılan dalgaboyu620 nm olarak.

Discussion

Burada sunulan Agroinfiltration yaklaşımı yaygın olarak bitki virüsleri, geniş bir aralık uygulanabilir olabilir. Bu yaklaşımın bir işaretidir özelliği aynı hücre-sık bitki virüsleri rutin olarak kullanılan mekanik inokulasyon ile ilişkili büyük dezavantajı birden çok agroconstruct teslim eşitlenir. In vivo ve bir model olarak brom mozaik virüsü kullanılarak in vitro montaj çalışmaları ile verimli bir şekilde yapılabilir Aşağıdaki birkaç ipucu. (i) N. başarılı infiltrasyonu için benthamiana infiltrasyonu 24 saat önce su, bitkiler yok bırakır; infiltrasyon 4-5 saatleri arasında yapıldı if (ii) Agrobacterium süspansiyon kültürü, kolaylıkla hücre içi alanlara yayılacak, (iii) kültürün optik yoğunluğu geçmemelidir OD ₆₀₀ 1.0. Yüksek hücre yoğunluğu ile agrocultures infiltrasyonu ciddi viral replikasyon ve sonraki virion etkileyebilir hücre toksisite ve yaprak yaşlanması ^9,10 uyardığı bilinmektediroluşumu, (iv) infiltrasyonu hafif basınç sırasında bitki bağışıklık yanıtı tetikleyebilir yaprak büyük zararlar önlemek için yaprak eksen dışı tarafında uygulanmalıdır;% 10 den% 40 (v) Sakkaroz yoğunluk gradiyenti yapılabilir derhal ve 2 için -80 ° C 'de dondurma (en yüksek ve en düşük konsantrasyonda konsantrasyonu ekleyerek ve örneğin,% 10 +% 40/2 = 25% 2 bölünerek) BMV süspansiyon sükroz tampon içinde% 25 yaparak bir tüp içinde -4 saat ve daha da sakaroz, bir düz bir konuma 4 ° C de bir gece boyunca yavaşça tutarak çözünmesi için izin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES Sodium salts	Sigma-Aldrich	M2993
Indocyanine green	Sigma-Aldrich	I2633
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Centricon-100 column	EMD Millipore	YM-100
Spectrophotometer	Varian, Inc.	Part number 10068900
Spectrofluorometer	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Part number FL3-21