Seta Film per la cultura del sistema In vitro Analisi e Progettazione Biomaterial

Summary

Film di seta sono una nuova classe di biomateriali facilmente personalizzabili per una serie di applicazioni biomediche. Il sistema presentato pellicola sericoltura è altamente adattabile ad una varietà di

Abstract

Pellicole seta sono promettenti biomateriali a base di proteine ​​che possono essere fabbricate con alta fedeltà ed economico in un ambiente di ^1,2 ricerche di laboratorio. Questi materiali sono desiderabili perché possiedono caratteristiche dimensionali e materiale altamente controllabile, sono biocompatibili e promuovere l'adesione cellulare, possono essere modificate attraverso patterning topografico o chimicamente alterare la superficie, e può essere utilizzato come un deposito di molecole biologicamente attive per applicazioni di consegna droga ^3-8. Inoltre, i film di seta sono relativamente facili da design personalizzato, può essere progettato per sciogliere in pochi minuti o degradare anni in vitro o in vivo, e si produce con il vantaggio di essere trasparente in natura e quindi particolarmente adatto per applicazioni di imaging ^{9 - 13.} La metodologia sistema di coltura qui presentato rappresenta un approccio scalabile per la rapida valutazione della cella-seta superficie del filminterazioni. Di particolare interesse è l'uso di pellicole superficie seta fantasia per studiare le differenze nella proliferazione cellulare e le risposte di cellule per l'allineamento ^12,14. Le colture seminate sono state coltivate su entrambi i micro-fantasia e il fondo piatto substrati di film di seta, e quindi valutate attraverso time-lapse a contrasto di fase imaging, microscopia elettronica a scansione, e la valutazione biochimica di attività metabolica e contenuto di acido nucleico. In sintesi, il film seta sistema di coltura in vitro offre una configurazione sperimentale personalizzabile adatto allo studio di interazioni di superficie cellulare su un substrato biomateriale, che possono poi essere ottimizzati e poi tradotto in modelli in vivo. Osservazioni che utilizzano il sistema cultura qui presentate sono attualmente utilizzate per aiutare in applicazioni che vanno dalle interazioni cellulari di base per la progettazione di dispositivi medici, e quindi sono rilevanti per una vasta gamma di settori biomedici.

Protocol

1. Fabbricazione di stampi in gomma silicone

1. Produrre o acquistare una superficie topografica desiderata per la fusione. Per questa pubblicazione un wafer di silicio standard 100 millimetri inciso verrà descritto (Figura 1).
2. Pesare polidimetilsilossano (PDMS) potting (componente A) e catalizzatore (componente B) soluzione in un rapporto 1:9 (9 g potting ed 1 g di catalizzatore), come fornito nel kit acquistato.
3. Mescolare accuratamente soluzioni per avviare il processo di polimerizzazione.
4. Posizionare wafer di silicio di superficie di un piatto di colata.
5. Pesare 4,5 g di soluzione PDMS su wafer di silicio.
6. Diffusione soluzione PDMS da coprire un'area di 100 mm di diametro della superficie del wafer.
7. Inclinare wafer per diffondere la soluzione PDMS in modo uniforme.
8. Coprire wafer da 100 millimetri coperchio diametro del disco di Petri.
9. Luogo colata di installazione in forno a 60 ° C durante la notte, facendo attenzione che la cura si svolge su una superficie piana.
10. Luogo curato PDMS / wafer di silicio in etanolo al 70%bagno prima della rimozione.
11. Inizia la rimozione PDMS dal wafer utilizzando lama di rasoio per sollevare bordo (intera circonferenza) prima.
12. Estrarre delicatamente PDMS off con pinza all'interno di un bagno di etanolo al 70% facendo attenzione a non strappare fusione in gomma siliconica.
13. Punch out singoli stampi di PDMS con 14 foratura mm. Questo diametro è progettato per adattarsi in un 24 e piastra di installazione.

2. Produzione di soluzione di seta

1. Portare 2 L di acqua distillata (DH ₂ O) a ebollizione all'interno di un bicchiere di vetro ^7.
2. Tagliare 5 g di bozzoli di bachi da seta Bombyx mori in tre parti.
3. Smaltire bozzoli estesamente contaminati come indicato dal rivestimento eccessiva particolato insetti la superficie interna bozzolo.
4. Misurare 4,24 g di carbonato di sodio.
5. Aggiungi carbonato di sodio lentamente ad ebollizione dH ₂ volume O per evitare traboccamenti di acqua, e lasciare completa dissoluzione prima di continuare.
6. Aggiungere i pezzi di bozzolo ad ebollizione dH
7. Dopo la bollitura, scolare con cura dH ₂ O nel lavandino e risuonare l'estratto di seta a mano per rimuovere l'acqua in eccesso.
8. Lavare seta estratto tre volte per 20 min. ciascuna in 1 L di dH ₂ O in un bicchiere di laboratorio, e utilizzare una barra di agitazione a circolare volume entro beaker.
9. Dopo il lavaggio, gridate, l'estratto di seta a mano e seta estratto posto in fibra all'interno di una cappa chimica per consentire l'essiccazione per un hr 12. periodo.
10. Il giorno dopo, pesare le fibre di seta secchi, che in genere è ~ 3,5 g: ___________-g
11. Preparare una soluzione 9,3 M di LiBr 20% w / v soluzione di seta. Utilizzare le seguenti equazioni per calcolare il peso necessario e volumi:
    1. (Estratto di seta peso dal punto 10) x (4) = ___________-mL di soluzione totale di 9,3 M LiBr
    2. [(807,705) x (volume LiBr da parte 11.a)] / 1000 = ___________ g di LiBr da aggiungere a dH ₂ O
    </ Li>
12. Aggiungere peso LiBr misurato in un bicchiere di vetro delle seguenti dH O ₂ Volume:
    1. (0,8) x (volume calcolato dal punto 11.a) = ___________ ml di dH ₂ O
13. Versare questa soluzione in un cilindro graduato di dimensioni appropriate, e portare la soluzione a volume finale calcolata in parte 11.a.
14. Posizionare l'estratto di seta in bicchiere e versare la soluzione LiBr negli fibre di seta assicurandosi che le fibre di seta sono immersi nella soluzione di bromuro di litio con una spatola di laboratorio.
15. Posizionare la seta disciolto in forno a 60 ° C per 4 ore:
    Ora di inizio: ___________
    Ora di scadenza: ___________
16. Utilizzando una siringa di dimensioni adeguate elaborare 12 mL della soluzione di seta. Inserire un ago 18G sull'estremità della siringa, e poi iniettare la soluzione in un casette dialisi (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Dopo aver riempito la cassetta, disegnare l'aria residua fuori la cassetta con la siringa svuotata.
17. Luogo fidialisi cassette lled entro 1 L di dH ₂ O.
18. Modificare dH ₂ volume O dopo 1 ora, 4 ore, 8 ore e poi ogni 12 ore 3 volte per un totale di 6 modifiche:
    1. Inizio: ___________
    2. 1 ora: ___________
    3. 4 ore: ___________
    4. 8 ore: ___________
    5. 12 ore: ___________
    6. 12 ore: ___________
    7. 12 ore: ___________
    8. Fine: ___________
19. Dopo la dialisi, lentamente raccogliere la soluzione di seta da cassette con la siringa. Soluzione Luogo in 10.000 g di provette nominali.
20. Centrifugare la soluzione per due volte a 10.000 g a 4 ° C per 20 minuti ciascuna. Dopo ogni supernatante centrifugazione posto in una nuova provetta.
21. Conservare thr soluzione di seta in 4 ° C frigorifero.
22. Pipettare 2 campioni di 0,5 ml di soluzione di seta in piccoli pesano piatto, e il luogo pesano i piatti all'interno di un forno a 60 ° C a secco per 12 ore o fino a quando si asciuga la soluzione di seta.
23. Pesare il film restante seta solido da both campioni per misurare soluzione seta percento in peso di concentrazione in volume di proteine:
    1. Peso dei campioni di seta combinate 2 pellicole: ___________ mg
    2. (Peso da 23.A) x (100) = seta ___________%

3. Preparazione di film Seta e sistema cultura

1. Preparare le superfici di colata PDMS pulendo con del nastro adesivo trasparente per rimuovere la polvere.
2. Clean PDMS substrati immergendo nel 70% EtOH e lavare tre volte con dH ₂ O.
3. Luogo 14 mm stampi PDMS sulla piastra di supporto, che è tipicamente un coperchio piatto ben 24.
4. Per produrre un film spesso 50 micron, si sviluppa 70 μls di soluzione di seta 8% su stampi PDMS utilizzando uno strumento di diffusione di liquido che è tipicamente una siringa da 1 ml punta ^2.
5. Lasciare le pellicole di seta ad asciugare scoperti su un banco pulito esegue un flusso di aria pressione di 150 Pa per un periodo di 90 minuti o fino pellicole siano asciutte.
6. Una volta che i film sono luogo asciutto intero set di film, tra cui PDMS molds, in una camera d'acqua-> ricottura per 4 ore per produrre una pellicola insolubile in acqua. Questo è tipicamente una camera vuota essiccatore con acqua sul fondo del bacino tirato a vuoto 25 kPa ^15.
7. Rimuovere film di seta da acqua ricottura camera e posto su un banco pulito.
8. Preparare un bagno di EtOH 70% entro una capsula Petri 35 millimetri, e substrati di controllo posto (cioè vetro o superfici in plastica) e gli anelli in acciaio inox all'interno di pozzetti per almeno 10 minuti per sterilizzare.
9. Rimuovere film di seta dalle muffe PDMS con una pinzetta, immergerli in 70% EtOH, e campione posto in piastra da 24 pozzetti pre-riempita con 1 ml di EtOH 70% assicurandosi lato modellato è rivolto verso l'alto per consentire l'adesione delle cellule.
10. Dopo aver posizionato ciascun campione di pellicola di seta in un corrispondente e pesi in acciaio inox ad anello posto (11,65 mm di diametro interno, 15,45 mm di diametro esterno e spessore 1,18 mm) sulla parte superiore.
11. Lasciare che i campioni con anelli ad incubare per 10 minuti per garantire la sterilità.
12. Remove EtOH e lavare ciascun campione 3x con 1 ml di PBS. Lasciate ogni lavaggio riposare per 5 minuti per consentire la diffusione completa.
13. Rimuovere PBS utilizzando pipetta di vetro aspirazione, facendo attenzione a rimuovere la maggioranza di bolle sotto campioni di film di seta.
14. Preparare linea cellulare per la semina. Come esempio, Tripsinizzare umano corneale-limbare epiteliale (HCLE) linea cellulare con tripsina 0,25% e di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) soluzione 7-min. Disattivare tripsina usando 01:01 volume di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) con mezzi passaggio 10% FBS aggiunto. Centrifugare tripsinizzate cellule HCLE, aggiungere 8 mL di media liberi cheratinociti-siero (K-SFM) a pellet, agitare delicatamente per disperdere HCLEs, e generare conta delle cellule.
15. Campione 500 microlitri di sospensione HCLE per pozzetto in genere utilizzando un 10.000 cellule / cm ² densità.
16. Luogo culture all'interno incubatore a 37 ° C e 5% CO ₂ ed eseguire desiderato protocollo sperimentale.

4. Risultati rappresentativi

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Figura 1. Diagramma di flusso illustrante sintesi 10-fasi della produzione della seta film e sistema di preparazione della cultura.

Figura 2. (A) 21-colorante array di topografie linea superficie modellata prodotte su un wafer di silicio diametro 90 mm ​​impiegando normali tecniche di incisione fotolitografiche e secca. (B), film di seta mantenere le caratteristiche originali linee parallele modellate dopo la fusione sulle superfici di stampaggio PDMS. (C) Schema dimostrando di progettazione dimensione del tratto scelto per promuovere l'allineamento cellulare. (D) Sezione di film seta illustrare mantenuto superficie parallela foderato fantasia.

Figura 3. Scansione micrografie elettroniche di linea cellulare HCLE aderendo (A) modellatoe (B) film di seta piatte giorno 2 nella cultura. Culture HCLE continuano a proliferare a confluenza in (C) decorato e (D), superfici piane in 8 giorni in coltura.

Figura 4. (A, D, G) Patterned e (B, E, H) piatti film sericoltura HCLE cellule relativamente a (C, F, I) substrati di vetro a controllo (AC) giorno 1, (DF) il giorno 4, e (GI) 8 giorno in cultura. (J) contenuti CyQuant acido nucleico e (K) (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) attività metabolica dati del saggio dimostrano vitalità HCLE sia modellato e substrati piatti pellicola seta rispetto alle superfici vetrose di controllo nel corso del tempo (barre di scala = 100 micron).

Video 1. Dopo un po 'di imaging a contrasto di fase di cellule HCLE migrazione su una superficie di seta fantasia del film durante un hr 18. periodo di tempo. Le cellule sono state seminate a 10k/cm ² densità e coltivate per 2 h. prima della creazione dell'immagine. Clicca qui per vedere il film .

Video 2. Dopo un po 'di imaging a contrasto di fase di cellule HCLE migrazione su una superficie piana di controllo TCP durante un hr 18. periodo di tempo. Le cellule sono state seminate a 10k/cm ² densità e coltivate per 2 h. prima della creazione dell'immagine. Clicca qui per vedere il film .

Discussion

L'uso di pellicole di seta rigenerata come substrato per la coltura cellulare ha guadagnato in popolarità nel corso degli ultimi due decenni a causa di caratterizzazione estensiva delle proprietà del materiale di questa proteina e una maggiore comprensione della sua utilità biomateriale ^3,8. Il sistema di coltura qui descritto rappresenta un nuovo sistema di test in vitro per valutare le interazioni cellulari di superficie su seta fantasia film di biomateriale substrati ^7. Il sistema permette di analisi in profondità di interazioni cellulari nel tempo che può essere facilmente adottati per l'alta velocità di raccolta dati. Questo è in gran parte attivata perché i film di seta in possesso di un certo numero di sintonizzabili proprietà biomateriale che può essere modificato per incidere direttamente la funzione delle cellule ^8,9,12, tra cui: il controllo della superficie micro / nano-topografia di superficie ^7; chimiche superficiali diversi attraverso la modificazione covalente o adsorbimento di molecole biologicamente attive ^13; robusta mechproprietà anical ^15,16: controllo delle idrofilia materiale / idrofobicità ^16; caricamento di massa di composti biologici per il rilascio ^4,8,17, e dissoluzione controllata / tassi di degradazione enzimatica attraverso il controllo della struttura secondaria (contenuto foglietto beta) ^11,18,19 .

La trasparenza dei film di seta viene raggiunto attraverso ricottura dei film per un periodo di tempo sotto vuoto in presenza di vapore acqueo ^7,15. Questo approccio consente di elaborazione per la formazione di β-sheet struttura secondaria, favorendo l'insolubilità del materiale in acqua pur consentendo diffrazione minimo di luce ^15. La trasparenza dei film è fondamentale per consentire la diretta live-cell imaging che può essere assunto con un certo numero di modalità di imaging (cioè wide-field e fluorescenza) con qualsiasi numero di sistemi microscopio ^12,20. Oltre a live-cella di imaging, seta film può essere facilmente rimosso dal thcultura del sistema e per consentire fissaggio e analisi supplementari. Così, la grande varietà di diretti valutazioni sperimentali che possono essere eseguiti su questo sistema sono applicabili ad un'ampia varietà di cellule / tessuti fonti per molti settori tecnici ^{3,8,9,12,13,21.} I time lapse risultati delle immagini illustrano come dati in tempo reale di coltura possono essere raccolti, e come esempio sono stati utilizzati per illustrare come la topografia delle superfici sulle interazioni cellulari. I risultati rappresentativi dimostrano come biomateriali pellicola seta può essere utilizzato per sostenere la crescita HCLE cultura, e sono modificabili a un certo numero di standard di proliferazione cellulare e saggi metabolici (Fig. 4). Inoltre, le colture sono fissati e trattati per la scansione di immagini di elettroni o altri protocolli (Fig. 3).

Substrati di film di seta sono prodotte in laboratorio con l'alta fedeltà, coerenza, e con costi relativamente bassi (Fig. 1). Ciò consente riproducibilitàlità sia configurazione cultura del sistema e dei risultati sperimentali. È stato dimostrato che l'acqua-ricottura elaborazione produce un materiale stabile seta cinematografico all'interno di coltura che ha definito velocità di degradazione in attesa della concentrazione di proteasi in soluzione ^2,15,22. Come risultato di questi materiali possono essere utilizzati per lunghi periodi di tempo a lungo termine di coltura cellulare, o restare impiantato per mesi o anni a seconda della posizione fisiologica ^8. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che sia la struttura della proteina e delle proprietà materiali di acqua ricotto film di seta sono coerenti da lotto a lotto che consente risultati della coltura riproducibili, come mostrato attraverso vari metodi di prova meccanici e biofisici ^15,16. Inoltre, la superficie del materiale ha dimostrato grande fedeltà tra i lotti di film come indicato dalla SEM, micrscopy a forza atomica (AFM), e studi su colture cellulari {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} ^7,23,24. Materiale stabillità e coerenza è un fattore importante per come la cellula rileverà il substrato coltura attraverso i percorsi meccanotrasduzione varie, e infine produrre un desiderato / indesiderato risposta cellulare ^25,26.

Standard Storiche substrati di coltura, come la plastica di coltura di tessuti trattati o di vetro, di fornire adeguati supporti per il fissaggio delle cellule. Tuttavia, questi materiali non sono modificabili per l'ulteriore utilità in vivo. Può essere previsto che una seta cinematografico biomateriale potrebbe essere adattato in vitro, e una volta aspettative sperimentali sono stati raggiunti il film può essere personalizzato direttamente tradotto in un modello in vivo. Tale disegno accoppiamento tra in vitro e in vivo sperimentazione offre un grande vantaggio per tali biomateriali seta impiantabili oltre altri substrati che vengono abitualmente utilizzati in vitro.