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Bioengineering

रेशम फिल्म संस्कृति के लिए सिस्टम इन विट्रो में विश्लेषण और biomaterial डिजाइन

Published: April 24, 2012 doi: 10.3791/3646
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Margaret M. Dyson Vision Research Institute, Weill Cornell Medical College, 2Department of Biomedical Engineering, Tufts University

Summary

रेशम फिल्मों जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के एक सरणी के लिए आसानी से अनुकूलन biomaterials के एक उपन्यास वर्ग के हैं. प्रस्तुत रेशम फिल्म संस्कृति प्रणाली अत्यधिक की एक किस्म के लिए अनुकूलनीय है

Abstract

रेशम फिल्मों प्रोटीन आधारित biomaterials कि उच्च विश्वस्तता और आर्थिक के साथ एक अनुसंधान प्रयोगशाला वातावरण 1,2 भीतर निर्मित किया जा सकता का वादा कर रहे हैं. इन सामग्रियों वांछनीय हैं क्योंकि वे अत्यधिक नियंत्रणीय आयामी और सामग्री विशेषताओं के अधिकारी, biocompatible और कोशिका आसंजन को बढ़ावा देने, स्थलाकृतिक patterning के माध्यम से या रासायनिक सतह बदलकर संशोधित किया जा सकता है, और दवा वितरण से संबंधित अनुप्रयोगों के लिए biologically सक्रिय अणुओं के लिए एक डिपो के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है 3-8. इसके अलावा, रेशम फिल्मों अपेक्षाकृत कस्टम डिजाइन करने के लिए सरल कर रहे हैं, मिनट के भीतर भंग करने के लिए या इन विट्रो में vivo में वर्षों से अधिक नीचा करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, कर रहे हैं और प्रकृति में पारदर्शी और इसलिए उच्च इमेजिंग 9 अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त होने का जोड़ा लाभ के साथ उत्पादन 13. संस्कृति प्रणाली यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रणाली सेल रेशम फिल्म सतह के तेजी से आकलन के लिए एक स्केलेबल दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता हैबातचीत. विशेष ब्याज की सतह के नमूनों रेशम फिल्मों का उपयोग करने के लिए सेल प्रसार और कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं के में 12,14 संरेखण के लिए मतभेद का अध्ययन है. वरीय संस्कृतियों दोनों सूक्ष्म नमूनों और फ्लैट रेशम फिल्म substrates पर संवर्धित किया गया है, और फिर समय चूक चरण विपरीत इमेजिंग, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग, और चयापचय गतिविधि और न्यूक्लिक एसिड सामग्री के जैव रासायनिक मूल्यांकन के माध्यम से मूल्यांकन. सारांश में, इन विट्रो संस्कृति प्रणाली में रेशम फिल्म एक अनुकूलन प्रयोगात्मक सेटअप सेल सतह बातचीत एक biomaterial के सब्सट्रेट पर, जो तब तो और अनुकूलित कर सकते हैं vivo मॉडल में लिए अनुवाद किया जा के अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रदान करता है. यहाँ प्रस्तुत संस्कृति प्रणाली का उपयोग टिप्पणियों वर्तमान में चिकित्सा उपकरण डिजाइन करने के लिए बुनियादी सेल बातचीत से लेकर अनुप्रयोगों में सहायता कर रहे हैं प्रयोग किया जा रहा है, और इस प्रकार जैव चिकित्सा क्षेत्रों का एक व्यापक रेंज के लिए प्रासंगिक हैं.

Protocol

1. सिलिकॉन रबड़ molds का निर्माण

  1. उत्पादन या एक कास्टिंग के लिए इच्छित स्थलाकृतिक सतह खरीद. इस प्रकाशन के लिए एक मानक 100 मिमी etched सिलिकॉन वफ़र (चित्रा 1) में वर्णित किया जाएगा.
  2. Polydimethylsiloxane (PDMS) के एक घटक के रूप में खरीदा किट में दिए 01:09 अनुपात (9 जी potting और 1 ग्राम उत्प्रेरक) में potting और उत्प्रेरक समाधान घटक (बी) तौलना.
  3. समाधान मिश्रण अच्छी तरह से इलाज की प्रक्रिया आरंभ करने के लिए.
  4. एक कास्टिंग पकवान के भीतर जगह सिलिकॉन वफ़र सतह.
  5. सिलिकॉन वफ़र पर PDMS समाधान की 4.5 ग्राम वजन.
  6. प्रसार के रूप में वफ़र सतह के 100 मिमी व्यास क्षेत्र को कवर PDMS समाधान.
  7. वफ़र झुकाव PDMS समाधान समान रूप से फैला.
  8. 100 मिमी व्यास पेट्री डिश ढक्कन के साथ कवर वफ़र.
  9. जगह रात से अधिक 60 डिग्री सी ओवन में सेटअप कास्टिंग, कुछ है कि इलाज एक सपाट सतह पर जगह ले जा रहा है.
  10. जगह 70% इथेनॉल में PDMS / सिलिकॉन वफ़र ठीकहटाने से पहले स्नान.
  11. धार का उपयोग बढ़त (पूरे परिधि) पहले लिफ्ट द्वारा वफ़र से PDMS हटाने शुरू करो.
  12. धीरे से एक 70% इथेनॉल के लिए सिलिकॉन रबर कास्टिंग आंसू नहीं सावधान किया जा रहा स्नान के भीतर संदंश का उपयोग बंद PDMS खींच.
  13. व्यक्ति PDMS 14 मिमी छेद पंच का उपयोग कर molds के बाहर पंच. यह व्यास 24 अच्छी तरह से एक थाली सेटअप में फिट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है.

2. सिल्क समाधान का उत्पादन

  1. एक फोड़ा करने के लिए एक गिलास 7 बीकर के भीतर आसुत पानी (DH 2 हे) के एल 2 लाओ.
  2. कटौती तिहाई में 5 Bombyx मोरी रेशमकीट कोकून जी.
  3. बड़े पैमाने पर दूषित कोकून के निपटान के रूप में अत्यधिक कीट particulates भीतर कोकून की सतह कोटिंग ने संकेत दिया है.
  4. सोडियम कार्बोनेट की 4.24 ग्राम उपाय.
  5. धीरे धीरे सोडियम कार्बोनेट, DH 2 हे मात्रा उबलते पानी के ऊपर उबलते रोकने के लिए, जोड़ें और आगे बढ़ने से पहले पूरा विघटन की अनुमति.
  6. उबलते DH कोकून टुकड़े जोड़ें
  7. उबलते के बाद, ध्यान से हाथ से रेशम निकालने बाहर सिंक और रिंग में DH 2 हे अतिरिक्त पानी निकालने के निकास.
  8. धो रेशम तीन बार 20 मिनट के लिए निकालें. एक प्रयोगशाला बीकर में 1 DH 2 हे एल में प्रत्येक, और हलचल पट्टी का उपयोग बीकर के भीतर मात्रा प्रसारित.
  9. धोने, रेशम निकालने के बाहर हाथ से और एक रासायनिक हुड के अंदर जगह रेशम फाइबर निकालने अंगूठी के बाद एक 12 घंटे के लिए सुखाने के लिए अनुमति देने के लिए. अवधि.
  10. अगले दिन, सूखे रेशम फाइबर, जो आम तौर पर है ~ 3.5 ग्राम वजन: ___________ जी
  11. रेशम की एक 20% w / वी समाधान के लिए 9.3 एम LiBr समाधान तैयार. निम्न समीकरण का उपयोग करने के लिए आवश्यक वजन और मात्रा की गणना:
    1. (सिल्क चरण 10 से निकालने वजन) x (4) = कुल 9.3 एम LiBr है समाधान के ___________ - एमएल
    2. (807.705) एक्स (भाग 11.a से LiBr मात्रा)] 1000 / = ___________ LiBr की छ DH 2 हे जोड़ने के लिए
    </ Li>
  12. निम्नलिखित DH 2 हे मात्रा का एक गिलास बीकर में मापा LiBr के वजन जोड़ें:
    1. (0.8) (x 11.a कदम से गणना की मात्रा) = ___________ DH का एमएल 2 हे
  13. सिलेंडर स्नातक की उपाधि प्राप्त की एक उपयुक्त आकार में इस समाधान डालो, और समाधान लाने के अंतिम मात्रा के रूप में गणना 11.a. भाग में
  14. बीकर में रेशम निकालने प्लेस और रेशम रेशम फाइबर LiBr समाधान का उपयोग कर एक प्रयोगशाला रंग के भीतर डूब रहे हैं सुनिश्चित करने के तंतुओं से अधिक LiBr समाधान डालना.
  15. 60 में भंग रेशम प्लेस ° सी 4 घंटे के लिए ओवन:
    प्रारंभ समय: ___________
    समय समाप्ति: ___________
  16. एक उचित आकार सिरिंज का उपयोग रेशम समाधान के 12 एमएल आकर्षित. सिरिंज के अंत पर एक 18G सुई रखें, और फिर एक डायलिसिस कैसेट (३५०० मेगावाट coutoff, स्लाइड एक Lyzer, थर्मो वैज्ञानिक) में समाधान इंजेक्षन. कैसेट भरने के बाद, कैसेट के बाहर खाली सिरिंज के साथ शेष हवा आकर्षित.
  17. जगह इंटरनेटDH 2 ओ के 1 एल के भीतर lled डायलिसिस कैसेट
  18. 1 घंटे, 4 घंटे, 8 घंटा और फिर हर 12 घंटा 6 परिवर्तन की कुल के लिए 3x के बाद DH 2 हे मात्रा बदलने के लिए:
    1. शुरू: ___________
    2. 1hr: ___________
    3. 4hr: ___________
    4. 8 घंटा: ___________
    5. 12 घंटे: ___________
    6. 12 घंटे: ___________
    7. 12 घंटे: ___________
    8. अंत: ___________
  19. डायलिसिस के बाद, धीरे धीरे सिरिंज के साथ कैसेट से रेशम समाधान इकट्ठा. 10,000 जी रेटेड अपकेंद्रित्र ट्यूबों में जगह समाधान.
  20. समाधान दो बार 10,000 जी में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट प्रत्येक के लिए अपकेंद्रित्र. एक नया ट्यूब में प्रत्येक centrifugation जगह सतह पर तैरनेवाला के बाद.
  21. 4 ° सी फ्रिज में स्टोर thr रेशम समाधान.
  22. है विंदुक छोटे पकवान तौलना, और जगह में 0.5 एमएल रेशम समाधान के 2 नमूने अंदर व्यंजन वजन एक 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 12 घंटे के या रेशमी समाधान dries के जब तक सूखी ओवन.
  23. बीओटी से शेष ठोस रेशम फिल्म का वजनघंटे मात्रा प्रोटीन एकाग्रता रेशम समाधान प्रतिशत वजन को मापने के नमूने:
    1. मिलीग्राम ___________: संयुक्त 2 रेशम फ़िल्म के नमूनों का वजन
    2. (वजन 23.a से) (100) x = ___________% रेशम

3. सिल्क फिल्में और संस्कृति सिस्टम सेटअप की तैयारी

  1. स्पष्ट टेप के साथ सफाई धूल हटाने के द्वारा PDMS कास्टिंग सतहों की तैयारी.
  2. 70% EtOH में भिगोने से साफ PDMS substrates और DH 2 ओ के साथ तीन बार धोना
  3. 14 मिमी PDMS molds के धारक थाली है, जो आम तौर पर एक 24 अच्छी तरह से थाली ढक्कन पर रखें.
  4. एक 50 माइक्रोन मोटी फिल्म उत्पादन, PDMS तरल फैल उपकरण है कि आम तौर पर एक 1 एमएल सिरिंज 2 टिप का उपयोग कर molds पर 8% रेशम समाधान की 70 μls फैला.
  5. रेशम फिल्मों सूखी एक साफ 90 मिनट की अवधि के लिए या फिल्मों तक 150 फोनों की एक हवा का प्रवाह दबाव चल बेंच पर खुला अनुमति सूख रहे हैं.
  6. एक बार फिल्मों सूखी जगह PDMS मीटर सहित फिल्मों का पूरा सेट कर रहे हैंबच्चों,> 4 बजे एक पानी अघुलनशील फिल्म उत्पादन के लिए पानी annealing के चेंबर में. यह आमतौर पर बेसिन के तल में पानी के साथ एक खाली desiccator कक्ष एक 25 kPa 15 निर्वात में खींच लिया है.
  7. पानी annealing और बेंच पर एक स्वच्छ कक्ष जगह से रेशम फिल्मों निकालें.
  8. कुओं के भीतर कम से कम 10 मिनट के लिए बाँझ के लिए एक 35 मिमी पेट्री डिश के भीतर 70% EtOH स्नान, और जगह नियंत्रण (यानी कांच या प्लास्टिक की सतहों) substrates और स्टेनलेस स्टील के छल्ले तैयार.
  9. रेशम फिल्मों PDMS संदंश का उपयोग कर molds से निकालें, उन्हें 70% EtOH में डुबकी, और 24 EtOH 70% यकीन है कि नमूनों की ओर बनाने के 1 एमएल के साथ अच्छी तरह से प्रीफिल्ड थाली में जगह नमूना का सामना करना पड़ रहा है कोशिका आसंजन के लिए अनुमति देते हैं.
  10. एक इसी अच्छी तरह से जगह स्टेनलेस स्टील अंगूठी वजन (11.65 मिमी भीतरी व्यास 15.45 मिमी की बाहरी व्यास और 1.18 मिमी मोटाई) में शीर्ष पर प्रत्येक रेशम फिल्म नमूना रखने के बाद.
  11. के छल्ले के साथ नमूने बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए 10 मिनट के लिए सेते हैं करने के लिए अनुमति देते हैं.
  12. रेमोEtOH दिया है और प्रत्येक नमूना पीबीएस के 1 एमएल के साथ 3x धो. प्रत्येक धोने के 5 मिनट के लिए बैठते हैं पूरा करने के लिए प्रसार के लिए अनुमति देते हैं.
  13. पीबीएस निकालें, aspirating कांच विंदुक का उपयोग, जबकि रेशम फिल्म नमूनों के नीचे बुलबुले के बहुमत को दूर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है.
  14. बोने के लिए सेल लाइन तैयार करते हैं. एक उदाहरण के रूप में 0.25% और 7 मिनट के लिए ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान trypsin के साथ मानव corneal उपकला अंगीय (HCLE) सेल लाइन trypsinize करें. Trypsin 10% FBS साथ है Dulbecco बार संशोधित ईगल (DMEM) के माध्यम बीतने मीडिया 1:1 मात्रा का उपयोग कर निष्क्रिय करने के लिए जोड़ा गया. Trypsinized HCLE कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, सेल गोली keratinocyte सीरम मुक्त मीडिया की 8 एमएल (कश्मीर SFM) जोड़ने के लिए, धीरे HCLEs फैलाने आंदोलन, और सेल गिनती उत्पन्न.
  15. नमूना अच्छी तरह से आम तौर पर 10,000 कोशिकाओं / सेमी 2 घनत्व का उपयोग के प्रति HCLE निलंबन के 500 μL.
  16. इनक्यूबेटर भीतर 37 जगह संस्कृतियों डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 और वांछित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल चलाते हैं.

4. प्रतिनिधि परिणाम

<पी वर्ग = "jove_content"> चित्रा 1
चित्रा फ्लो 1. संक्षेप illustrating के चार्ट रेशम फिल्म निर्माण और संस्कृति प्रणाली तैयार करने की प्रक्रिया 10 कदम.

चित्रा 2
चित्रा 2 (ए) नमूनों लाइन सतह पर उत्पादन topographies एक 90 मिमी व्यास सिलिकॉन वफ़र मानक photolithographic और शुष्क नक़्क़ाशी तकनीक को रोजगार के 21 डाई सरणी. (बी) सिल्क फिल्मों PDMS ढलाई सतहों पर कास्टिंग के बाद मूल समानांतर लाइन नमूनों सुविधाओं को बनाए रखने. (सी) योजनाबद्ध प्रदर्शन सुविधा आकार डिजाइन करने के लिए सेलुलर संरेखण को बढ़ावा देने के लिए चुना. (डी) रेशम बनाए रखा समानांतर लाइन में खड़ा नमूनों सतह illustrating के फिल्म की क्रॉस अनुभाग.

चित्रा 3
चित्रा 3 (ए) नमूनों का पालन HCLE सेल लाइन की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs.और (ख) संस्कृति में दिन में 2 फ्लैट रेशम फिल्मों. HCLE संस्कृतियों के लिए (सी) नमूनों और (डी) फ्लैट सतहों पर संस्कृति में 8 दिन से संगम के लिए पैदा जारी है.

चित्रा 4
चित्रा 4 (ए, डी, जी). नमूनों और (बी ई, एच) फ्लैट रेशम फिल्मों संस्कृति अपेक्षाकृत करने के लिए HCLE कोशिकाओं (सी, एफ, मैं) (एसी) 1 दिन, (लोमो) 4 दिन में कांच substrates के नियंत्रण, और (सैनिक) संस्कृति में 8 दिन. (जम्मू) CyQuant के न्यूक्लिक एसिड सामग्री और (कश्मीर) (3 - (4,5 - Dimethylthiazol-2-YL) -2,5 - diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) चयापचय गतिविधि परख दोनों नमूनों और फ्लैट रेशम फिल्म substrates पर HCLE व्यवहार्यता का प्रदर्शन डेटा जब गिलास समय पर नियंत्रण सतहों (पैमाने पर सलाखों = 100 माइक्रोन) की तुलना में.

वीडियो 1. HCLE एक 18 घंटे के दौरान एक नमूनों रेशम फिल्म सतह पर पलायन कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग चरण विपरीत. समय की अवधि. कोशिकाओं 10k/cm 2 घनत्व वरीयता प्राप्त कर रहे थे और 2 घंटे के लिए संवर्धित. इमेजिंग से पहले फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

वीडियो 2 HCLE एक 18 घंटे के दौरान एक फ्लैट TCP नियंत्रण सतह पर पलायन कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग चरण विपरीत. समय की अवधि. कोशिकाओं 10k/cm 2 घनत्व वरीयता प्राप्त थे और 2 घंटे के लिए सभ्य. इमेजिंग से पहले फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

Discussion

उपयोग सेल संस्कृति के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में पुनर्जीवित रेशम फिल्मों की लोकप्रियता में पिछले दो दशकों से अधिक इस प्रोटीन की सामग्री के गुणों की व्यापक लक्षण वर्णन के कारण प्राप्त की है और इसके biomaterial 3,8 उपयोगिता की समझ में वृद्धि हुई. संस्कृति यहाँ वर्णित प्रणाली के नमूनों रेशम फिल्म biomaterial 7 substrates के कोशिका की सतह पर बातचीत का आकलन करने के लिए इन विट्रो में परीक्षण प्रणाली में एक उपन्यास का प्रतिनिधित्व करता है. प्रणाली है कि आसानी से उच्च throughput डेटा संग्रह के लिए अपनाया जा सकता है समय के साथ सेलुलर बातचीत का गहराई से विश्लेषण में के लिए अनुमति देता है. सहसंयोजक संशोधन या सोखना के माध्यम से विभिन्न सतह chemistries, सतह के नियंत्रण माइक्रो / नैनो सतह 7 स्थलाकृति: यह काफी हद तक क्योंकि रेशम फिल्मों tunable के biomaterial के गुण के एक नंबर, कि सीधे सेल 8,9,12 समारोह को प्रभावित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है सहित के अधिकारी सक्षम है मजबूत यांत्रिक, biologically सक्रिय 13 अणुओं कीanical 15,16 गुण, सामग्री hydrophilicity / hydrophobicity 16 के नियंत्रण, 4,8,17 रिहाई के लिए जैविक यौगिकों के थोक लोड हो रहा है, और नियंत्रित विघटन / माध्यमिक संरचना के नियंत्रण के माध्यम से enzymatic गिरावट की दर (बीटा चादर सामग्री) 11,18,19 .

रेशम फिल्मों की पारदर्शिता पानी 7,15 वाष्प की उपस्थिति में वैक्यूम के अंतर्गत समय की एक अवधि के लिए annealing के फिल्मों के माध्यम से हासिल की है. यह प्रसंस्करण दृष्टिकोण β पत्र माध्यमिक संरचना के गठन के लिए अनुमति देता है, जबकि 15 प्रकाश की अनुमति न्यूनतम विवर्तन पानी में सामग्री की अविलेयता को बढ़ावा देने. फिल्मों की इस पारदर्शिता प्रत्यक्ष इमेजिंग रहते सेल इमेजिंग रूपात्मकता (यानी व्यापक क्षेत्र और प्रतिदीप्ति) खुर्दबीन 12,20 प्रणाली के किसी भी संख्या का उपयोग कर के एक नंबर के तहत नियोजित किया जा सकता है सक्षम करने में महत्वपूर्ण है. - जीना सेल इमेजिंग के अलावा, रेशम फिल्मों को आसानी वें से हटाया जा सकता हैई संस्कृति प्रणाली अतिरिक्त निर्धारण और विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए. इस प्रकार, प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक आकलन की बड़ी विविधता है कि इस सिस्टम पर निष्पादित किया जा सकता है कई तकनीकी 3,8,9,12,13,21 क्षेत्रों के लिए एक सेल / ऊतक स्रोतों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू कर रहे हैं. समय चूक इमेजिंग परिणाम वर्णन कैसे वास्तविक समय संस्कृति डेटा, एकत्र किया जा सकता है और एक उदाहरण के रूप में वर्णन कैसे सतह स्थलाकृति सेल बातचीत को प्रभावित करता है का उपयोग किया गया है. प्रतिनिधि परिणाम दिखाना कैसे रेशम फिल्म biomaterials के HCLE संस्कृति के विकास का समर्थन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, और मानक सेलुलर प्रसार और चयापचय assays के छवि (4) के एक नंबर के लिए संशोधनीय हैं. इसके अलावा, संस्कृतियों और तय कर रहे हैं स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन इमेजिंग या अन्य प्रोटोकॉल (छवि 3) के लिए संसाधित.

सिल्क फिल्म substrates के उच्च विश्वस्तता, स्थिरता के साथ प्रयोगशाला में उत्पादित कर रहे हैं, और अपेक्षाकृत कम लागत (1 छवि) के साथ. यह reproduci सक्षम बनाता हैदोनों संस्कृति प्रणाली सेटअप और प्रायोगिक परिणामों में साख. यह दिखा दिया है कि पानी - पानी रखना प्रसंस्करण संस्कृति के भीतर एक स्थिर रेशम फिल्म सामग्री है कि गिरावट दर 2,15,22 समाधान में proteases की एकाग्रता लंबित परिभाषित किया गया है का उत्पादन. एक परिणाम के रूप में इन सामग्रियों को लंबी अवधि के सेल संस्कृति के लिए समय की विस्तारित अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या शारीरिक 8 स्थान के आधार पर महीनों या वर्षों के लिए प्रत्यारोपित कर रह है. इसके अलावा, हाल ही में काम दिखाया गया है कि दोनों प्रोटीन संरचना और पानी annealed रेशम फिल्मों की सामग्री गुण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संस्कृति परिणाम के लिए अनुमति देता है के रूप में विभिन्न यांत्रिक और biophysical परीक्षण 15,16 तरीकों के माध्यम से दिखाया गया बैच बैच से संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, सामग्री की सतह फिल्म बैचों के बीच महान निष्ठा से पता चला है के रूप में SEM, परमाणु बल (AFM) micrscopy, सेल और संस्कृति अध्ययन {लॉरेंस: 2008wr, Omenetto: 2008tc, ब्रे: 2011kq के} ने संकेत दिया 7,23,24. सामग्री stabilअल्पसंख्यक और स्थिरता के कैसे विभिन्न mechanotransduction रास्ते के माध्यम से सेल संस्कृति सब्सट्रेट भावना, और अंत में वांछित / अवांछित सेलुलर प्रतिक्रिया 25,26 उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है.

संस्कृति substrates के लिए टिशू कल्चर का इलाज प्लास्टिक या कांच के रूप में ऐतिहासिक मानकों,, सेल लगाव के लिए पर्याप्त substrates के प्रदान करते हैं. हालांकि, इन सामग्रियों vivo में आगे उपयोगिता के लिए सुधारने योग्य नहीं हैं. यह अनुरूप किया जा सकता है कि इन विट्रो में एक रेशम फिल्म biomaterial अनुकूलित किया जा सकता है, और एक बार प्रयोगात्मक उम्मीदों को हासिल किया गया है अनुकूलित फिल्म सीधे vivo मॉडल में एक अनुवाद किया जा सकता है. के बीच इन विट्रो में और vivo प्रयोग में इस तरह बनती डिजाइन में अन्य substrates कि नियमित रूप से इन विट्रो में उपयोग किया जाता है पर प्रत्यारोपण रेशम biomaterials के लिए एक महान लाभ प्रदान करता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

एनआईएच K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, EB002520 P41, और R01 EY020856 को दृष्टिहीनता कैरियर विकास पुरस्कार, और सप्ताह में तीन संस्थागत स्टेम सेल पहल को रोकने के अनुसंधान से अनुदान. HCLE सेल लाइन डॉ. Ilene Gipson के सौजन्य से प्रदान की है. लेखकों के सेल संस्कृति, SEM इमेजिंग, ऊतक इंजीनियरिंग संसाधन केंद्र (TERC) के साथ उसे तकनीकी सहायता के लिए विशेष सर्जरी के लिए अस्पताल में एंथोनी Labissiere साथ वेल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज में डॉ. Aihong लियू उसे तकनीकी सहायता और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं सामग्री विकास के साथ तकनीकी सहायता, और कॉर्नेल nanoscale विज्ञान और प्रौद्योगिकी सुविधा के लिए सिलिकॉन वफ़र निर्माण में सहायता के लिए (CNF) के लिए Tufts विश्वविद्यालय.

References

  1. Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin. Nature protocols. , Forthcoming (2011).
  2. Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features. Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).
  3. Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 24, 401-416 (2003).
  4. Hofmann, S., Wong, P. o, Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery. Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).
  5. Demura, M., Asakura, T. Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor. Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).
  6. Cebe, P., Kaplan, D. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals. Biomaterials. , (2010).
  7. Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices. Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).
  8. Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo. Biomaterials. 26, 147-155 (2005).
  9. Vepari, C., Kaplan, D. Silk as a biomaterial. Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).
  10. Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets. Biomaterials. 24, 357-365 (2003).
  11. Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films. Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).
  12. Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  13. Ma, X., Cao, C., Zhu, H. The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).
  14. Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues. Biomedical. , (2010).
  15. Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. Water-Stable Silk Films with Reduced β-Sheet Content. Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).
  16. Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. Effect of Hydration on Silk Film Material Properties. Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).
  17. Zhang, Y. Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization. Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).
  18. Cebe, P., Kaplan, D. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals. Biomaterials. , (2010).
  19. Shaw, J. Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin. Biochemical Journal. 93, 45 (1964).
  20. Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
  21. Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders. Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).
  22. Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -S., Park, S. -H., Cebe, P. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  23. Omenetto, F., Kaplan, D. A new route for silk. Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).
  24. Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes. Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).
  25. Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
  26. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 62 रेशम फ़ाइब्राइन फिल्म biomaterial सतह patterning के, उपकला सेल संस्कृति
रेशम फिल्म संस्कृति के लिए सिस्टम<em> इन विट्रो में</em> विश्लेषण और biomaterial डिजाइन
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Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M.… More

Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design. J. Vis. Exp. (62), e3646, doi:10.3791/3646 (2012).

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