Silk Film Kultur System for In vitro Analyse og biomateriale Design

Summary

Silke filmene er en roman klasse av biomaterialer lett tilpasses for en rekke biomedisinske applikasjoner. Den presenterte silke filmkultur system er svært tilpasningsdyktig til en rekke

Abstract

Silke filmer er lovende protein-baserte biomaterialer som kan fabrikkert med high fidelity og økonomisk innenfor et forskningslaboratorium miljø ^1,2. Disse materialene er ønskelig fordi de besitter svært kontrollerbare dimensjonale og materielle egenskaper, er biokompatibelt og fremme celle adhesjon, kan endres gjennom topografisk mønster eller ved kjemisk endre overflaten, og kan brukes som et depot for biologisk aktive molekyler for levering av legemidler relaterte programmer ^3-8. I tillegg silke filmer er relativt enkelt å spesialtilpasse, kan være konstruert for å løse opp i løpet av minutter eller brytes ned over år i vitro eller in vivo, og produserer med den ekstra fordelen av å være gjennomsiktig i naturen og derfor godt egnet for bildebehandlingsprogrammer ^{9 - 13.} Kulturen Systemet metodikken presenteres her representerer en skalerbar tilnærming for raske vurderinger av celle-silke film overflateinteraksjoner. Av spesiell interesse er bruk av overflaten mønstrede silke filmer å studere forskjeller i celleproliferasjon og svarene av celler for justering ^12,14. De seeded kulturer ble dyrket på både mikro-mønstrede og flate silke film underlag, og deretter vurderes gjennom tid-lapse fase-kontrast bildebehandling, scanning elektron mikroskopi, og biokjemiske vurdering av metabolsk aktivitet og nukleinsyre innhold. I sammendraget, tilbyr silke filmen in vitro kultur systemet en passelig eksperimentell oppsett egnet til studier av celle-overflate interaksjoner på en biomateriale underlaget, som deretter kan optimaliseres, og deretter oversatt til in vivo modeller. Observasjoner ved hjelp av kultur-systemet presenteres her blir for tiden brukt til å hjelpe i applikasjoner som spenner fra grunnleggende celle interaksjoner til medisinsk apparat design, og dermed er relevant for et bredt spekter av biomedisinske områder.

Protocol

1. Fabrikasjon av silikongummi muggsopp

1. Produsere eller kjøpe en ønsket topografisk underlag for casting. For denne publikasjonen en standard 100 mm etset silisium wafer vil bli beskrevet (figur 1).
2. Vei ut polydimetylsiloksan (PDMS) potting (komponent A) og katalysator (komponent B) løsning i en 1:09 ratio (9 g potting og 1 g katalysator) som forutsatt i den kjøpte settet.
3. Bland løsningene grundig for å initiere herding prosessen.
4. Place silisium wafer overflaten innenfor en avstøpning parabolen.
5. Vei ut 4,5 g av PDMS løsning på silisium wafer.
6. Spre PDMS løsning som skal dekke en 100 mm diameter område av wafer overflaten.
7. Vipp wafer å spre PDMS løsning jevnt.
8. Dekk wafer med 100 mm diameter petriskål lokk.
9. Plasser kaste oppsett til 60 ° C ovn over natten, noe som gjør sikkert at herdingen foregår på en flat overflate.
10. Place herdet PDMS / silisium wafer til 70% etanolbad før fjerning.
11. Begynn å fjerne PDMS fra wafer ved å bruke barberblad til å løfte kanten (hele omkretsen) først.
12. Trekk forsiktig PDMS av ved hjelp av tang innenfor en 70% etanol bad være forsiktig med å rive silikongummi casting.
13. Punch ut enkelte PDMS muggsopp bruker 14 mm hull. Dette diameter er laget for å passe inn i en 24-brønns plate oppsett.

2. Produksjon av Silk Solution

1. Ta med to L av destillert vann (dH ₂ O) til en byll i et glass begerglass ^7.
2. Skjær 5 g Bombyx Mori SilkWorm kokonger inn tredjedeler.
3. Kast omfattende forurenset kokonger som indikert av overdreven insekt partikler belegg den indre kokong overflaten.
4. Mål 4,24 g natrium karbonat.
5. Legg natriumkarbonat langsomt til kokepunktet dH ₂ O volum for å forhindre kokte over av vann, og la fullstendig oppløsning før du fortsetter.
6. Legg Cocoon stykker til koking dH
7. Etter koking, nøye avløp dH ₂ O til vask og ring ut silke ekstrakt hånd for å fjerne overflødig vann.
8. Vask silke trekke tre ganger i 20 min. hver i en L av dH ₂ O i en lab begerglass, og bruke en bevegelse bar å sirkulere volum innenfor begerglass.
9. Etter vask, ring ut silke ekstrakt hånd og sted silke fiber ekstrakt inne i en kjemisk hette for å gi tørke for en 12 hr. perioden.
10. Neste dag, veie de tørkede silke fiber, noe som er typisk ~ 3,5 g: ___________-g
11. Forbered 9,3 M LiBr løsning for en 20% w / v løsning av silke. Utnytte følgende ligninger for å beregne nødvendig vekt og volum:
    1. (Silk utdrag vekt fra trinn 10) x (4) = ___________-ml totalt 9,3 M LiBr løsning
    2. [(807.705) x (LiBr volum fra del 11.a)] / 1000 = ___________ g LiBr legge til dH ₂ O
    </ Li>
12. Legg målt LiBr vekt i et glass beger av følgende dH ₂ O volum:
    1. (0,8) x (beregnet volum fra trinn 11.a) = ___________ ml dH ₂ O
13. Hell denne løsningen inn i en passende størrelse uteksaminert sylinder, og få løsningen opp til endelig volum som beregnet i del 11.a.
14. Plasser silke pakke inn begerglass og hell LiBr løsning over silke fiber som gjør at silke fiber er nedsenket i LiBr løsning ved hjelp av en lab slikkepott.
15. Plasser oppløst silke til 60 ° C ovn for 4 timer:
    Starttid: ___________
    Sluttid: ___________
16. Bruk en passende størrelse sprøyte utarbeide 12 mL av silke løsningen. Plasser en 18G nål på enden av sprøyten, og deretter injisere løsningen i en dialyse kasett (3500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Etter påfylling kassetten, trekker den resterende luften ut av kassetten med tømt sprøyten.
17. Place filled dialyse kassett innen 1 L av dH ₂ O.
18. Endre dH ₂ O volum etter 1 time, 4 timer, 8 timer og deretter hver 12. time 3x for totalt 6 endringer:
    1. Begin: ___________
    2. 1t: ___________
    3. 4 timers: ___________
    4. 8 timer: ___________
    5. 12 timer: ___________
    6. 12 timer: ___________
    7. 12 timer: ___________
    8. Slutt: ___________
19. Etter dialyse, sakte samle silke løsningen fra kassetter med sprøyte. Plasser løsning inn 10.000 g rangerte sentrifugerør.
20. Sentrifuger løsningen to ganger på 10 000 g ved 4 ° C i 20-min hver. Etter hver sentrifugering sted supernatanten til et nytt rør.
21. Oppbevares thr silke løsning i 4 ° C kjøleskap.
22. Pipette 2 prøver av 0,5 ml silke løsning i små veier tallerken, og plasser veie retter i et 60 ° C tørr ovnen i 12 timer eller inntil silke løsningen tørker.
23. Vei gjenværende solid silke film fra both prøver å måle silke løsning prosent vekt til volum protein konsentrasjon:
    1. Vekt av kombinerte 2 silke film prøver: ___________ mg
    2. (Vekt fra 23.a) x (100) = ___________% silke

3. Utarbeidelse av Silke Film og kultur System Setup

1. Forbered PDMS casting overflater ved å rense med klar tape for å fjerne støv.
2. Clean PDMS substrater ved bløtlegging i 70% EtOH og vask tre ganger med dH ₂ O.
3. Place 14 mm PDMS muggsopp på holderen plate, noe som er typisk en 24 vel plate lokk.
4. For å produsere en 50 mikrometer tykk film, spre 70 μls på 8% silke løsning på PDMS former ved hjelp av et flytende spredning verktøy som er typisk en 1 ml sprøyte spissen ^to.
5. La silke filmene til tørk avdekket på en ren benk kjører en luftstrøm trykk på 150 Pa for en periode på 90 min eller til filmer er tørre.
6. Når filmene er tørt sted helt sett av filmer, inkludert PDMS måringer, i en vann-annealing kammer for> 4 timer å produsere et vann uløselig film. Dette er typisk en tom eksikkator kammer med vann i bunnen av bassenget strammes inn på 25 kPa vakuum ^15.
7. Fjern silke filmer fra vann-annealing kammer og sted på en ren benk.
8. Forbered en 70% EtOH bad innenfor en 35 mm petriskål, og at kontroll substrater (dvs. glass eller plast overflater) og rustfritt stål ringer innenfor brønner i minst 10 min å sterilisere.
9. Fjern silke filmer fra PDMS muggsopp ved hjelp av tang, dyppe dem i 70% EtOH, og plasser prøven i 24-brønns plate fylt med 1 ml 70% EtOH å sørge mønstret side er vendt opp for å gi celle adhesjon.
10. Etter å ha satt hver silke film prøven i en tilsvarende vel sted rustfritt stål ring vekter (11,65 mm innvendig diameter, 15,45 mm ytre diameter, og 1,18 mm tykkelse) på toppen.
11. Tillat prøver med ringer å ruge i 10 minutter for å sikre sterilitet.
12. Remove EtOH og vask hver prøve 3x med 1 mL PBS. La hver vask sitte i 5 min for å tillate full spredning.
13. Fjern PBS bruker aspirasjonsdetektor glass pipette, mens pass på å fjerne mesteparten av bobler under silke film prøver.
14. Forbered cellelinje for seeding. Som et eksempel, trypsinize human cornea-limbal epitelial (HCLE) cellelinje med 0,25% trypsin og ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning for 7-min. Deaktiver trypsin hjelp 01:01 volumet av Dulbecco modifiserte Eagle medium (DMEM) passasje media med 10% FBS lagt. Sentrifuger trypsinized HCLE celler, legge 8-ml keratinocyte-serum frie medier (K-SFM) til cellepelleten, forsiktig agitere for å spre HCLEs, og generere celletall.
15. Eksempel 500 mL av HCLE suspensjon per brønn vanligvis ved hjelp av en 10.000 celler / cm ² tetthet.
16. Plasser kulturer innenfor inkubator ved 37 ° C og 5% CO ₂ og kjøre ønsket forsøksprotokoll.

4. Representative Resultater

<p class = "jove_content">
Figur 1. Flytskjema illustrerer oppsummert 10-trinns prosess av silke filmproduksjon og kultur system forberedelse.

Figur 2. (A) 21-dye utvalg av mønstrede linjer overflaten topografier produsert på en 90 mm ​​diameter silisiumskive bruke standard fotolitografiske og tørr etsing teknikker. (B) Silke filmer beholde opprinnelige parallell linje mønstrede funksjoner etter casting på PDMS molding overflater. (C) Skjematisk demonstrere funksjonen størrelse utforming valgt å fremme mobilnettet justering. (D) Tverrsnitt av silke film illustrere beholdt parallelt foret mønstret overflate.

Figur 3. Scanning elektronmikroskop mikrografer av HCLE cellelinje man følger (A) mønstredeog (B) flate silke filmer på dag 2 i kulturen. HCLE kulturer fortsetter å spre seg til samløpet på (C) mønstret og (D) overflatene av dagen 8 i kulturen.

Figur 4. (A, D, G) Mønstret og (B, E, H) flate silke filmer kultur HCLE cellene relativt til (C, F, I) glass kontroll underlag på (AC) dag 1, (DF) dag 4, og (GI) dag 8 i kulturen. (J) CyQuant nukleinsyre innhold og (K) (3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) metabolsk aktivitet analyseverdier data som viser HCLE levedyktighet på både mønstret og flate silke film underlag sammenlignet med glass kontroll overflater over tid (skala barer = 100 mikrometer).

Video 1. Tidsforløp fase-kontrast avbildning av HCLE celler migrere over en mønstret silke film overflaten under en 18 hr. tidsperiode. Celler ble sådd ved 10k/cm ^to tetthet og kultiveres for 2 hr. før bildebehandling. Klikk her for å vise film .

Video 2. Tidsforløp fase-kontrast avbildning av HCLE celler migrere over en flat TCP kontroll overflaten under en 18 hr. tidsperiode. Celler ble sådd ved 10k/cm ^to tetthet og kultiveres for 2 hr. før bildebehandling. Klikk her for å vise film .

Discussion

Bruken av regenerert silke filmer som underlag for cellekultur har fått i popularitet de siste to tiårene på grunn av omfattende karakterisering av materialegenskaper av dette proteinet og økt forståelse av dens biomateriale nytte ^3,8. Kulturen systemet beskrevet her representerer en roman in vitro testing system for vurdering av celleoverflaten interaksjoner på mønstret silke film biomateriale underlag ^7. Systemet gir mulighet for grundig analyse av cellulære interaksjoner over tid som kan være lett vedtatt for høy gjennomstrømning datainnsamling. Dette er i stor grad aktivert, fordi silke filmer har en rekke tunbare biomateriale egenskaper som kan endres for å direkte påvirke celle funksjon ^8,9,12, inkludert: kontroll av overflate mikro / nano-overflatetopografi ^7; ulike overflate kjemi gjennom kovalent modifisering eller adsorpsjon av biologisk aktive molekyler ^13; robust mechanical eiendommer ^15,16; kontroll av materiale hydrophilicity / hydrofobisitet ^16; ilegging av biologiske forbindelser for utgivelse ^4,8,17, og kontrollert oppløsning / enzymatisk nedbrytning priser gjennom kontroll av den sekundære struktur (beta ark innhold) ^11,18,19 .

Gjennomsiktigheten av silke filmer oppnås gjennom annealing filmene for en periode under vakuum i nærvær av vanndamp ^7,15. Denne behandlingen tilnærmingen åpner for dannelsen av β-ark sekundær struktur, fremme insolubility av materialet i vannet samtidig som minimal diffraksjon av lys ^15. Denne åpenhet filmer er nøkkelen i muliggjør direkte live-celle bildebehandling som kan være ansatt under en rekke bildediagnostikk (dvs. bredt felt og fluorescens) ved hjelp av en rekke av mikroskop systemer ^12,20. I tillegg til live-celle bildebehandling, kan silke filmer enkelt fjernes fra the kultur system for å tillate ytterligere fiksering og analyse. Dermed blir stort utvalg av direkte eksperimentelle vurderinger som kan utføres på dette systemet gjelder for et bredt spekter av celle / vev kilder for mange tekniske felt ^{3,8,9,12,13,21.} De time-lapse imaging resultater illustrere hvordan sanntidsdata kultur data kan samles, og som et eksempel ble utnyttet for å illustrere hvordan overflatetopografi påvirker celle interaksjoner. De representative Resultatene viser hvordan silke film biomaterialer kan brukes til å støtte HCLE kultur vekst, og er amendable til en rekke standard celleproliferasjonstest og metabolske analyser (Fig. 4). I tillegg er kulturen fast og behandlet for scanning elektronmikroskop avbildning eller andre protokoller (Fig. 3).

Silke film substrater er produsert i laboratoriet med high fidelity, konsistens, og med relativt lave kostnader (Fig. 1). Dette gjør reproduciansvar i både kultur systemoppsettet og eksperimentelle resultater. Det er vist at vann-anneal prosessering gir et stabilt silke filmmateriale innenfor kultur som har definert Nedbrytingshastigheten påvente konsentrasjonen av proteaser i løsning ^2,15,22. Som et resultat av disse materialene kan brukes i lengre perioder for langsiktig cellekultur, eller forbli implantert i måneder eller år, avhengig av fysiologisk plassering ^åtte. I tillegg har nyere arbeid vist at både protein struktur og materialegenskaper av vann-glødet silke filmer er konsistent fra parti til parti som åpner for reproduserbare kultur resultater som vist gjennom ulike mekaniske og biofysisk testmetoder ^15,16. I tillegg har materialet overflate vist stor trofasthet blant film batcher som indikert av SEM, atomic force micrscopy (AFM), og cellekultur studier {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} ^7,23,24. Materiale stabilligheten og konsistens er en viktig faktor for hvordan cellen vil kjenne kulturen underlaget gjennom de ulike mechanotransduction veier, og til slutt produsere en ønsket / uønsket cellulær respons ^25,26.

Historiske standarder for kultur underlag, for eksempel vev kultur behandlet plast eller glass, gir tilstrekkelige underlag for celle vedlegg. Men disse materialene er ikke amendable for ytterligere nytte in vivo. Det kan så for seg at en silke film biomateriale kunne tilpasses in vitro, og en gang eksperimentelle forventninger har oppnådd den tilpassede filmen kan være direkte oversatt til en in vivo modell. Slik paret utforming mellom in vitro og in vivo eksperimenter tilbyr en stor fordel for slike implanterbare silke biomaterialer over andre underlag som rutinemessig brukes in vitro.