Шелковый Фильм культуры система В пробирке Анализ и Дизайн биоматериала

Summary

Шелковый фильмы нового класса биоматериалов легко настраиваемый для массива биомедицинских приложений. Представлены шелковые фильм культуры система легко адаптируется к различным

Abstract

Шелковый фильмов обещают на основе белков биоматериалов, которые могут быть изготовлены с высокой точностью и экономически в среде ^1,2 лабораторных исследований. Эти материалы являются желательными, поскольку они обладают высокой управляемых размеров и характеристик материалов, биосовместимых и способствовать адгезии клеток, может быть изменен с помощью топографических паттерна или химического воздействия на поверхность, и может быть использован как склад для биологически активных молекул для доставки лекарств в соответствующие приложения ^3-8. Кроме того, шелк фильмов относительно просто по дизайну заказчика, могут быть разработаны для растворения в течение нескольких минут или ухудшить течение многих лет в пробирке или в естественных условиях, и произвести с дополнительным преимуществом является прозрачным по своему характеру и поэтому отлично подходит для работы с изображениями приложения ^{9 - 13.} Методология системы культуры, представленные здесь представляет собой масштабируемый подход для быстрой оценки клеточного шелка поверхности пленкивзаимодействий. Особый интерес представляет использование поверхностных пленок узорный шелк для изучения различий в клеточной пролиферации и ответы клеток для выравнивания ^12,14. Семенами культур культивировали как на микро-рисунком и плоские подложки фильм шелк, а затем оценивается с помощью покадровой фазового контраста изображения, растровой электронной микроскопии и биохимические оценки метаболической активности и нуклеиновых кислот. Таким образом, шелк фильм в системе культуры пробирке предлагает настраиваемую экспериментальной установки подходят для изучения клеточной поверхности взаимодействия на подложке биоматериала, который может быть оптимизирован, а затем переведен в естественных моделей. Наблюдения использованием системе культуры представлены здесь в настоящее время используются для оказания помощи в приложениях, начиная от базовых взаимодействий клетки медицинский дизайн устройства, и, следовательно, относятся к широкому спектру медико-биологических полей.

Protocol

1. Изготовление пресс-форм силиконовой резины

1. Производить или приобретать желаемые топографическая поверхность литья. Для этой публикации стандартных 100 мм травления кремниевой пластины будут описаны (рис. 1).
2. Взвесить полидиметилсилоксана (PDMS) заливки (компонент А) и катализатор (компонент Б) решение в отношении 1:09 (9 г заливки и 1 г катализатора), как это предусмотрено в купленном комплекте.
3. Смешайте решения тщательно инициировать процесс отверждения.
4. Место поверхности кремниевой пластины в литье блюдо.
5. Взвесить 4,5 г решение PDMS на кремниевой пластине.
6. Распространение PDMS решение как для покрытия диаметром 100 мм, площадь поверхности пластины.
7. Наклон пластин распространяться PDMS решение равномерно.
8. Крышка пластины с диаметром 100 мм крышка чашке Петри.
9. Место установки литья на 60 ° C духовку на ночь, убедившись, что лечение проходит на ровной поверхности.
10. Место вылечить PDMS / кремниевой пластины на 70% этанолаванна перед удалением.
11. Начните снимать PDMS от пластины с помощью лезвия, чтобы поднять край (всей окружности) в первую очередь.
12. Осторожно потяните PDMS с помощью щипцов в 70% этанола ванны стараясь не оторвать силиконовой резины литья.
13. Удар из отдельных форм PDMS с использованием 14 мм дырокол. Этот диаметр предназначен для установки в 24-луночного планшета установки.

2. Производство шелка решения

1. Возьмите 2 л дистиллированной воды (DH ₂ O) до кипения в стеклянный стакан, ^7.
2. Отрежьте 5 г Bombyx Мори коконов тутового шелкопряда в трети.
3. Утилизировать загрязненную широко коконов, как указано чрезмерной насекомых частицы покрытия внутренней поверхности кокона.
4. Измерьте 4,24 г карбоната натрия.
5. Добавить карбонат натрия медленно до кипения дН ₂ O том, чтобы предотвратить кипит воды и позволяют полного растворения, прежде чем продолжить.
6. Добавить кокон части до кипения дН
7. После кипения, осторожно слить дН ₂ O в раковину и кольцо из шелка экстракт вручную, чтобы удалить лишнюю воду.
8. Вымойте шелка выделить три раза в течение 20 мин. каждый на 1 л дН ₂ O в лаборатории стакан, а также использовать мешалкой распространить объем в стакан.
9. После мытья, кольцо из шелка экстракт вручную и место шелковых волокон экстракт внутрь химических капот, чтобы для сушки в течение 12 часов. период.
10. На следующий день, взвесить сухой волокна шелка, которые, как правило, ~ 3,5 г: ___________ г-
11. Подготовить 9,3 М LiBr решение для 20% вес / объем решение шелка. Используйте следующие уравнения для расчета необходимого веса и объема:
    1. (Шелковый экстракт веса, начиная с шага 10) х (4) = ___________ мл, от общего числа 9,3 М раствора LiBr
    2. [(807,705) х (LiBr объемом от части 11.а)] / 1000 = ___________ г LiBr добавить к дН ₂ O
    </ LI>
12. Добавить измеряется LiBr вес в стеклянный стакан из следующих дН объемом ₂ O:
    1. (0,8) х (расчетный объем, начиная с шага 11.а) = ___________ мл дН ₂ O
13. Залить это решение в соответствующих размеров мерный цилиндр и довести решение до конечного объема, рассчитанные на участие 11.a.
14. Поместите экстракт шелка в стакан и залить раствор LiBr в шелковых волокон убедившись, что шелковые волокна погружены в LiBr решения с использованием лаборатории шпателем.
15. Поместите растворенного шелка на 60 ° C духовку на 4 часа:
    Начало: ___________
    Время окончания: ___________
16. Использование соответствующего размера шприца составляет 12 мл шелка решение. Поместите 18G иглу на конец шприца, а затем вводят раствор в диализе кассета (3500 МВт coutoff, слайд-A-анализатор,, Thermo Scientific). После заполнения кассет, нарисуйте остальные воздуха из кассеты с опорожнить шприц.
17. Место Filled кассеты диализа в течение 1 л дН ₂ O.
18. Изменение дН ₂ O объем через 1 час, 4 часа, 8 часов, а затем каждые 12 ч 3 раза в общей сложности 6 изменения:
    1. Начало: ___________
    2. 1 час: ___________
    3. 4 ч: ___________
    4. 8 часов: ___________
    5. 12 часов: ___________
    6. 12 часов: ___________
    7. 12 часов: ___________
    8. Окончание: ___________
19. После диализа, медленно собирают шелк решение от кассет с шприца. Место решения в тубах по 10 000 номинальной центрифуги.
20. Центрифуга решение дважды в 10000 г при 4 ° С в течение 20 мин каждый. После каждого центрифугирования супернатант место в новой трубки.
21. Магазин Чет шелка решение в 4 ° C холодильник.
22. Внесите 2 пробы по 0,5 мл раствора шелк в небольшой вес блюда, и блюда место весит в 60 ° C сухой печи в течение 12 часов или до высыхания шелка решение.
23. Взвесьте оставшихся прочная пленка из шелка ботч образцы для измерения шелка решение процентов веса объемной концентрации белка:
    1. Вес 2 комбинированных пленочных образцов шелка: ___________ мг
    2. (Вес от 23.a) х (100) = ___________% шелк

3. Подготовка Шелковый Фильмы и настройка системы культуры

1. Подготовка поверхностей PDMS очистки литья с четким ленты для удаления пыли.
2. Чистая PDMS субстратов путем замачивания в 70% этанола и вымыть три раза с дН ₂ O.
3. Место 14 мм PDMS формы на держатель пластина, которая, как правило, 24 и крышку пластины.
4. Для получения 50 мкм пленка, распространение 70 μls 8% шелк решение о формах PDMS использованием жидкого распространение инструмент, который, как правило, 1 мл шприц наконечником ^2.
5. Позвольте шелковой фильмов высохнуть обнаружили на чистом столе работает давления воздушного потока 150 Па в течение 90 мин или пока фильмы сухой.
6. После фильмов сухом месте весь набор фильмов, в том числе PDMS мдети, в воде камеру для отжига> 4 часов для получения нерастворимых в воде пленку. Это, как правило, пустой камере эксикатор с водой в нижней части бассейна потянул на 25 кПа вакуум ^15.
7. Удалить шелка фильмов из воды отжига камеру и место на чистой поверхности.
8. Подготовьте 70% этанола в ванне 35 мм чашки Петри, и место управления субстратов (например, стекло или пластик поверхностей) и нержавеющих стальных колец в скважинах, по крайней мере 10 минут для стерилизации.
9. Удалить шелка фильмов из форм PDMS с помощью щипцов, окуните их в 70% этанола и место образца в 24-луночного планшета заполнено с 1 мл 70% этанола убедившись, узорные лицевой стороной вверх, чтобы обеспечить адгезию клеток.
10. После размещения каждого образца шелка фильм в соответствующее место и кольцо из нержавеющей стали весом (11,65 мм внутреннего диаметра 15,45 мм наружный диаметр, и 1,18 мм толщиной) на вершине.
11. Позвольте образцов с кольцами для инкубации в течение 10 минут, чтобы обеспечить стерильность.
12. Ремове этанола и мыть каждый образец с 3x 1 мл PBS. Пусть каждое мытье сидеть в течение 5 мин, чтобы обеспечить полную диффузии.
13. Удалить PBS использования аспирационных стеклянную пипетку, а убедившись, чтобы удалить большинство пузырьков под образцы шелковых фильма.
14. Подготовить клеточной линии для посева. Например, trypsinize человека роговицы-лимбальных эпителия (HCLE) клеточные линии с 0,25% трипсина и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) решение в течение 7 мин. Отключить использование трипсина 1:1 по объему модифицированных Eagle Дульбекко среде (DMEM) проход СМИ с 10% FBS добавил. Центрифуга трипсинизированных HCLE клеток, добавить 8 мл кератиноцитов в сыворотке свободных средств массовой информации (K-SFM) в осадок клеток, мягко агитировать, чтобы разогнать HCLEs, а также генерировать клеток.
15. Пример 500 мкл суспензии в HCLE также обычно используют 10 000 клеток / см ² плотность.
16. Место культуры в термостате при 37 ° С и 5% CO ₂ и запустите желаемое экспериментальный протокол.

4. Представитель Результаты

<с классом = "jove_content">
Рисунок 1. Схема иллюстрирующая обобщенные 10 шагов процесс производства шелка фильма и подготовка системе культуры.

Рисунок 2. (А) 21-краситель массив рисунком линий поверхности топологии производится на 90 мм пластин кремния диаметром использованием стандартной фотолитографии и сухого травления методы. (B) Шелковый фильмов сохранить оригинальную параллельную линию узорной особенности после заливки на поверхности PDMS литья. (C) Схема демонстрирует особенность конструкции размером решили продвигать сотовые выравнивания. (D) Сечение шелка фильма, иллюстрирующего сохранил параллельно выложены узорчатой ​​поверхности.

Рисунок 3. Сканирующей электронной микрофотографии HCLE клеточной линии присоединения к (А) рисункоми (б) плоских пленок шелк на 2-й день в культуре. HCLE культуры продолжают распространяться на слияние на (С) узорами и (D) плоских поверхностей на 8-й день в культуре.

Рисунок 4. (A, D, G) Узорчатое и (B, E, H) плоской шелковой фильмов культуре клеток сравнительно HCLE (С, F, I) стеклянных подложках контроля на (AC) 1 день (DF) 4-й день, и (GI) 8-й день в культуре. (J) CyQuant содержание нуклеиновых кислот и (К) (3 - (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-diphenyltetrazolium бромид (МТТ) метаболической активности анализа данных, свидетельствующих о HCLE жизнеспособность обеих рисунком и плоские подложки фильм шелк по сравнению со стеклом рулей с течением времени (шкала бар = 100 мкм).

Видео 1. Временной интервал фазового контраста изображений HCLE клетки мигрируют по поверхности пленки шелковый узор в течение 18 часов. период времени. Клетки высевали на 10k/cm ² плотность и культивировали в течение 2 часов. до изображения. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Видео 2. Временной интервал фазового контраста изображений HCLE клетки мигрируют над плоской поверхностью управления TCP в течение 18 часов. период времени. Клетки высевали на 10k/cm ² плотность и культивировали в течение 2 часов. до изображения. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Discussion

Использование регенерированного шелка фильмы в качестве субстрата для культуры клеток получил популярность за последние два десятилетия в связи с обширной характеристика свойств материалов этого белка и более глубокое понимание ее биоматериала утилита ^3,8. Культура система, описываемая здесь, представляет собой роман в пробирке тестирования системы для оценки взаимодействия поверхности клеток на рисунке шелковых фильм биоматериала подложки ^7. Система позволяет в глубокий анализ клеточного взаимодействия с течением времени, которые могут быть легко приняты для высокой пропускной способности сбора данных. Это в значительной степени включены, потому что шелк пленки обладают рядом настраиваемых свойств биоматериала, который может быть изменен, чтобы непосредственно влиять на функции клеток ^8,9,12, в том числе: контроль поверхности микро / нано-топографии поверхности ^7, различных химических поверхность через ковалентные модификации или адсорбции биологически активных молекул ^13, надежной мехanical свойства ^15,16; контроля гидрофильности материала / гидрофобности ^16; массовой загрузки биологических соединений для выпуска ^4,8,17 и контролируемый распад / ферментативной деградации ставки по контролю вторичной структуры (содержание бета-листе) ^11,18,19 .

Прозрачность шелка фильмов достигается за счет отжига пленки для определенного периода времени в вакууме в присутствии водяного пара ^7,15. Эта обработка подход позволяет для формирования β-лист вторичной структуры, содействие неразрешимости материала в воду, позволяя минимальными дифракции света ^15. Эта прозрачность пленок является ключевым в обеспечении прямого живых клеток изображений, которые могут быть использованы в рамках ряда изображений условиях (например, широкое поле и флуоресценции) с использованием любого количества систем микроскоп ^12,20. В дополнение к живой клетке изображения, шелк фильмы могут быть легко удалены из йСистема электронной культуры для обеспечения дополнительной фиксации и анализа. Таким образом, большое разнообразие прямых экспериментальных оценок, которые могут быть выполнены на данной системе применяются в самых разнообразных клеток / тканей источников для многих технических областях ^{3,8,9,12,13,21.} Покадровой визуализации результатов показано, как данные в реальном времени культура может быть собрана, и в качестве примера были использованы для иллюстрации того, как рельеф поверхности клетки влияет на взаимодействие. Представитель результаты показывают, как шелк биоматериалов пленка может быть использована для поддержки HCLE роста культуры, и исправимый ряд стандартных клеточную пролиферацию и метаболическую анализа (рис. 4). Кроме того, в культуре фиксируются и обрабатываются для сканирующего электронного изображений или других протоколов (рис. 3).

Подложки Шелковый фильма производится в лабораторных условиях с высокой точностью, последовательности и с относительно низкой стоимости (рис. 1). Это позволяет воспроизводимостьность как в настройке системы культуры и экспериментальных результатов. Было показано, что вода-отжига обработки получается стабильный материал фильма шелк в культуре, что определило темпы деградации до концентрации протеаз в решении ^2,15,22. В результате эти материалы могут быть использованы в течение длительных периодов времени для долгосрочных культуре клеток, или оставаться имплантированы в течение нескольких месяцев или лет в зависимости от физиологического место ^8. Кроме того, недавние исследования показали, что обе структуры белков и материальных свойств воды отожженных пленок шелка соответствуют от партии к партии позволяет воспроизводимые результаты культура проявляется через различные механические и биофизические методы испытаний ^15,16. Кроме того, поверхность материала показал большую верность среди фильм партий, как указано SEM, атомно-силовой micrscopy (АСМ), и исследования клеточных культур {Лоуренс: 2008wr, Оменетто: 2008tc, Bray: 2011kq} ^7,23,24. Материал стабильностьюность и последовательность является важным фактором, как ячейка будет чувствовать культуры подложку через различные пути механотрансдукции, и в конечном итоге получить желаемый / нежелательного клеточного ответа ^25,26.

Исторические стандарты культуры субстратов, таких как культуры тканей лечение пластика или стекла, обеспечить адекватную субстратов для мобильного приложения. Тем не менее, эти материалы не исправимый для дальнейшего утилиты в естественных условиях. Это может быть предусмотрено, что шелк фильм биоматериала могут быть настроены в пробирке, и как только экспериментальные ожидания были достигнуты настроенный фильм может быть непосредственно переведены на модели в естественных условиях. Такие парные конструкции между в пробирке и в естественных экспериментов предлагает большое преимущество для такого имплантируемые биоматериалы шелка на другие субстраты, которые обычно используются в лабораторных условиях.