Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof uit Published: March 19, 2012 doi: 10.3791/3647

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Stephen A. Banse¹, Craig P. Hunter¹

¹Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

Summary

Het model organisme

Abstract

De genetisch soepel model organisme C. elegans heeft inzicht in een groot aantal biologische vragen, mogelijk gemaakt door de korte generatietijd, gemakkelijke groei en kleine omvang. Deze kleine afmetingen, maar is afgewezen voor een aantal technische benaderingen in andere modelsystemen. Bijvoorbeeld, schakelt u bloedtransfusies in zoogdiersystemen en enten technieken in planten vragen te stellen aan de bloedsomloop samenstelling en signalering. De bloedsomloop van de worm, de pseudocoelom, Tot voor kort was het onmogelijk om direct assay. Om vragen van intercellulaire signalering en de bloedsomloop samenstelling C. beantwoorden elegans onderzoekers hebben van oudsher zich tot genetische analyse, cel / weefsel-specifieke redding, en mozaïek analyse. Deze technieken leveren een middel om duidelijk wat er gebeurt tussen cellen, maar niet universeel toepasbaar bij de identificatie en karakterisering van extracellulaire moleculen. Hier presenteren we een newly ontwikkelde techniek direct assay pseudocoelomic de vloeistof van C. elegans. De techniek begint met hetzij genetische of fysieke manipulatie het volume van de extracellulaire vloeistof. Daarna worden de dieren onderworpen aan een reverse vampiric micro-injectie waarbij gebruik wordt microinjectie rig die fijne balans drukregeling toelaat. Na isolatie van extracellulaire vloeistof, kan de verzamelde vloeistof worden getest door overdracht in andere dieren of door moleculaire middelen. Om de effectiviteit van deze techniek zien we een gedetailleerde benadering assay een specifiek voorbeeld van extracellulaire signaalmoleculen, lang dsRNA tijdens een systemische respons RNAi. Hoewel karakterisering van systemische RNAi is een proof of principle voorbeeld zien we deze techniek als aan te passen aan een verscheidenheid van vragen van bloedsomloop samenstelling en signalering te beantwoorden.

Protocol

1. Bereiding van Materials

De nodige hulpmiddelen ter vampiric reverse microinjectie is vergelijkbaar met die vereist voor de standaard micro-injectie technieken gebruikt om transgene C. maken elegans stammen ^1. Hoewel sommige reagentia (bijv. testplaten) bestaan ​​de dag van experimentele overdracht moet veel van de materialen gecoördineerd worden bereid over een periode van 8 dagen (zie tabel 1 voor een tijdschema). Als zodanig is het belangrijk uitermate voorzichtig plannen wanneer deze techniek (noodzakelijke reagentia en apparatuur zie tabel 2).

Injectie pads:

1. Maak een 2% agarose-oplossing in H ₂ O en warmte totdat het is opgelost. Aliquot in 1 ml porties in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij 4 ° C.
2. Indeling 22 x 50 mm dekglaasjes op een bankje top met hun randen iets uitsteken van de bank bovenkant te vergemakkelijken ze op te pakken snel.
3. Pokea gaatje in het deksel van de microcentrifugebuis (met een punaise) om ontluchting mogelijk. Plaats de buis in een 15 ml beker met ongeveer 5 ml water, en magnetron te smelten (ongeveer 35 seconden).
4. Met een Pasteur pipet en bol plaats een druppel (ongeveer 35 pl) van het gesmolten agarose op een dekglas en onmiddellijk een tweede dekglas plaats over het druppelsgewijs hoek van 90 ° de eerste. Herhaal dit voor verschillende andere dekglaasjes.
5. Nadat de agarose is gestold, verwijder het dekglas en laat de pad aan de lucht drogen overnacht (indien nodig eerder, slides worden geplaatst in een oven 50-80 ° C gedurende 15-30 minuten).
6. Pads kunnen vervolgens worden opgeslagen in een dekglas box onbepaalde tijd bij kamertemperatuur.

Testplaten:

Voor het testen van de embryonale dodelijkheid verbonden pal-1 RNAi, de bereiding van testplaten moet worden gedaan op de dag van de vampiric experiment. Het doel is om have een minimale bacteriële gazon terwijl niet verhongeren uw wormen. Een te dikke gazon maakt het scoren van Pal-1 larven erg moeilijk als het kleine, doorschijnende vervormd L1 dieren kunnen gemakkelijk verloren gaan in het voedsel. Plaat voorbereiding moet worden geoptimaliseerd voor het scoren van het fenotype van belang.

7. Bereid OP50: Seed 5mLs van LB bouillon met een OP50 kolonie gekweekt op LB agar platen. Incubeer de OP50 bij 37 ° C gedurende de nacht onder schudden, bewaar bij 4 ° C.
8. Bereid 35 mm NGM platen volgens basisprotocol (zie noot 1).
9. Spot 20 ul van het 's nachts OP50 cultuur (stap 1.7) op elk NGM plaat. Laat de LB-OP50 om te drogen (dit duurt minder dan 20 minuten).

Injectienaalden:

10. Trek injectienaalden van borosilicaatglas capillairen met een P97 vlammende / bruin micropipet trekker van Sutter instrumenten (zie figuur 1 voor representatieve naaldvorm).
11. Store injectienaalden in een naaldhouder opgebouwd uit een Petri plaat en klei (zie ^1).

2. Voorbereiding van Worms

Het geschatte pseudocoelomic volume van een volwassene C. elegans hermafrodiet is 40 tot 80 picoliter (pers com. David Hall). Monsters van extracellulaire verkrijgen van zo'n klein reservoir is het gunstig het vergroten van de totale beschikbare middelen. We hebben drie methoden om de beschikbare vloeistof sterk toenemen in de donor wormen. De eerste methode maakt gebruik van het fenotype van clr-1 (e1745) mutanten, die een 10-voudige of grotere toename in extracellulaire vloeistof volume (figuur 2) kan veroorzaken. De twee methoden gebruiken dat de kiemlijn vertegenwoordigt bijna een derde van het totale volume van de worm en de verwijdering door GLP-1 (RNAi) of laserablatie resultaten bij dieren met pseudocoelomic vloeistof de holte-opvullende kiemlijn (figuur 2) ^{2 <}/ Sup>.

Voorbereiding van donor wormen met clr-1 (e1745)

Zie figuur 3 voor clr-1 (e1745) overdracht test workflow

1. Streak uit bacteriën die dsRNA tot afzonderlijke kolonies op LB + 25μg/mL carbenicilline platen. Wij zullen pal-1 dsRNA producerende bacteriën voor deze demonstratie. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
2. Een gestreepte LB + 25 ug / ml carbenicilline plaat van pal-1 (RNAi) bacteriën, kies een kolonie op een 3 ml overnacht kweek te inoculeren in LB aangevuld met carbenicilline 25μg/mL.
3. Pipetteer 15 ul overnacht kweek op 35 mm NGM platen aangevuld met 25 ug / ml carbenicilline en 1 mM IPTG. Zorg ervoor dat u het bord van de bacteriën uit het midden van de plaat. Laten drogen (ongeveer 20 minuten).
4. Maak 500 pL verse bleekwater-oplossing (1:1 5M KOH: NaHypochlorite).
5. Pipetteer 10 ul bleekoplossing de geplaatste plaat. Zorg ervoor dat to plaatst u het bleekmiddel druppel uit de bacteriële plek.
6. Om een klein, schoon, gesynchroniseerde bevolking van clr-1 (e1745) dieren voor omgekeerde micro-injectie te krijgen, neem 2 tot 10 zwangere volwassenen in het bleekmiddel druppel. De volwassenen te ontbinden, waardoor schone, ontwikkelingsachterstand gedeeltelijk embryo's geënsceneerd. Deze embryo's zal dan uitkomen en de larven zullen kruipen om het voedsel.
7. Incubeer gedurende vier dagen bij 20 ° C.
8. Verschuiven platen 25 ° C gedurende vier uur zwelling induceren.
9. Kies wormen aan een unseeded NGM plaat en laat de tijd om duidelijk uit bacteriën uit de cuticula. (Optionele stap) Spoel wormen in M9 tijdens het overbrengen naar NGM platen.
10. Verplaats L4/Young Adult (YA) ontvanger wormen aan een unseeded plaat NGM plaat en laat de tijd om duidelijk uit bacteriën uit de cuticula. (Optionele stap) Spoel wormen in M9 tijdens het overbrengen naar NGM platen.

A2) Alternatieve bereiding van donor wormen met GLP-1 (RNAi)

1. Van een gestreepte plaatvan LB + 25 ug / ml carbenicilline inoculeren een 3 ml overnacht kweek van LB aangevuld met carbenicilline met een enkele kolonie van GLP-1 (RNAi) bacteriën. Incubeer bij 37 ° C geroerd.
2. Pipetteer 15 ul van GLP-1 (RNAi) overnachtcultuur op een 35 mm plaat NGM aangevuld met 25 ug / ml carbenicilline en 1 mM IPTG. Incubeer overnacht bij kamertemperatuur.
3. Overdracht vijf L3/L4 dieren aan de GLP-1 (RNAi) platen. Incubeer gedurende twee dagen bij 20 ° C. De RNAi gericht glp-1 resulteert in nakomelingen met kiemlijn proliferatie defecten. Het onvermogen om volledig te ontwikkelen van de kiembaan resultaten in onbezette ruimte die zich vult met extracellulaire vloeistof. Optimalisatie van de RNAi voedsel om nageslacht dat de vooruitgang naar volwassenheid zonder proliferatieve germlines noodzakelijk zijn, afhankelijk te genereren.
4. Hebben voorbereid pal-l (RNAi) platen als in stappen 2.1-2.3 van de clr-1 (e1745) worm voorbereiding protocol hierboven.
5. Maak een frisse bleekmiddel oplossingtie (1:1 5M KOH: NaHypochlorite).
6. Pipetteer 10 ul bleekoplossing de seeded pal-1 (RNAi) plaat. Zorg ervoor dat u het bleekmiddel druppel weg te plaatsen van de bacteriële plek.
7. Transfer embryo's door het plukken van 2 tot 10 zwangere GLP-1 (RNAi) volwassenen in het bleekmiddel druppel.
8. Incubeer gedurende vier dagen bij 20 ° C.
9. Kies wormen aan een unseeded 60mm NGM plaat en laat de tijd om duidelijk uit bacteriën uit de cuticula. (Optionele stap) Spoel wormen in M9 tijdens het overbrengen naar NGM platen.

B2) Alternatieve bereiding van donor wormen met behulp van kiembaan laser ablatie

1. Streak out bacteriën die dsRNA tot afzonderlijke kolonies op LB + 25 ug / ml carbenicilline platen. Wij zullen pal-1 dsRNA producerende bacteriën voor deze demonstratie. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
2. Van een plaat met carbenicilline inoculeren een 3 ml overnacht kweek in LB aangevuld met 25 ug / ml carbenicilline.
3. Pipetteer 15 ul van the overnachtcultuur van pal-1 dsRNA tot expressie bacteriën op 35 mm NGM platen aangevuld met 25 ug / ml carbenicilline en 1 mM IPTG. Laat een nacht drogen.
4. Isoleer L1 dieren uit standaard OP50 platen en laser ablatie van de somatische kiembaan voorloper cellen Z1 en Z4 met behulp van een standaard protocol ^3.
5. Recover laser ablatie wormen op de genoemde pal-1 RNAi platen.
6. Incubeer gedurende 3 dagen bij 20 ° C.
7. Kies wormen aan een schone NGM plaat en laat de tijd om duidelijk uit bacteriën uit de cuticula. (Optionele stap) Spoel wormen in M9 tijdens het overbrengen naar NGM platen.

Voorbereiding van de ontvanger wormen

1. Streak uit OP50 voor enkele kolonies op LB-platen. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
2. Van de LB plaat enten een 3 ml overnacht cultuur in LB.
3. Pipetteer 15 ul van de kweek van een nacht op 35 mm NGM platen. Zorg ervoor dat u het bord van de bacteriën uit het midden van de plaat. Laten drogen (ongeveer 20 minuten).
4. Maak een verse bleekwater oplossing (1:1 5M KOH: NaHypochlorite).
5. Pipetteer 10 ul bleekoplossing de geplaatste plaat. Zorg ervoor dat u het bleekmiddel druppel weg te plaatsen van de bacteriële plek.
6. Transfer embryo's door het plukken van 2 tot 10 zwangere N2 volwassenen in het bleekmiddel druppel.
7. Incubeer gedurende drie dagen bij 20 ° C.
8. Wormen verplaatsen naar een schone, unseeded NGM plaat en incubeer bij 20 ° C gedurende ten minste 30 minuten.

3. Vampiric Isolatie van extracellulaire vloeistof

Het volgende protocol is specifiek voor een micro-injectie set-up bestaat uit een PLI-100 pico-injector, een stationaire naald die in een micromanipulator en een drijvend fase waarin de worm kan worden geschoven in de naald. De algemene techniek een lege microinjectie naald in een donordier, terwijl tegelijkertijd voldoende druk te voorkomen in capillaire stroom minerale olie voorafgaande aan en cellulaire materiaal bij het binnendringen van het lichaam-weefsel van de wand. Terwijl de naald in een donordier druk verlaagd tot capillaire vulling van de naald mogelijk met extracellulaire vloeistof, die vervolgens in de naald worden verplaatst naar een ontvanger worm en uitgezet door de druk voldoende. Verwijdering van de vloeistof door capillaire werking kunnen ook worden ondersteund door de vulling of zuigkracht functie van de pico-injector. Deze algemene techniek moeten gemakkelijk aangepast aan andere micro-injectie systemen die controle evenwicht druk aan.

1. Zet de omgekeerde microscoop, de dissectie microscoop en pico-injector (zie figuur 1).
2. Draai de regelknop van de Pico injector naar P _helder, en controleer of de huidige meting is in psi. Deze lezing, de heldere druk, is de inlaatdruk en moet ongeveer 0 psi.
3. Controleer de primaire klep op de stikstoftank regulator ervoor zorgen dat de uitgang gesloten (draai counterclockwise tot knop is los).
4. Open het belangrijkste stikstof tankklep. De regelaar meter het dichtst bij de N2 tank luidt nu de inwendige druk van de tank.
5. Verhoog langzaam de druk uit door de primaire regulator klep met de klok mee. Bewaak de toenemende druk op de pico-injector (dit is nauwkeuriger dan de uitgangsdruk lezing op de regelaar meter). Voer de druk langzaam tot 100 psi. Niet in de 105 psi OVERSCHRIJDEN.
6. Wanneer 100 psi bereikt is schakelt de keuzeschakelaar op en _injecteer stel de injectiedruk tot 30 psi met behulp van de Pinject knop av.
7. Zet de keuzeknop op P _balans.
8. Plaats een 15 ul druppel minerale olie op uw schone donor en ontvanger platen.
9. Bedek je 2% agarose injectie pad in minerale olie.
10. Laad je getrokken micropipet naald in de houder en lijn.
11. Met behulp van een dissectie microscoop, monteren een donor en een ontvanger worm dicht bij elkaar op de agarose padvertentie.
12. Positie wormen met behulp van lage vergroting en breng de naald in de minerale olie bij de donor.
13. Ga naar hoog vermogen en positie naald in de buurt van een pseudocoelomic holte.
14. Verhoog de balans druk tot ongeveer 10 psi. Opmerking van een minerale olie plug aan het uiteinde van de naald.
15. Duw de worm in de naald aan de naaldpunt in de pseudocoelomic holte te positioneren door het verplaatsen van het podium.
16. Let op een sprong in de positie van de minerale olie in de punt van de naald.
17. Verminder de balans druk om capillaire werking om de naald te vullen. (Men kan eveneens de vulling functie om het proces te versnellen).
18. Na het verzamelen van vloeistof schuift u de worm uit de buurt van de naald.
19. Schakel over naar laag vermogen zoomfactor en de positie van de naald door de ontvanger worm (NIET TOEGESTAAN punt van de naald om de minerale olie te verlaten). [Alternatief kan de naaldhouder worden verwijderd en de vloeistof overgebracht naar een druppel in een microcentrifugebuis.]
20. Ga terug naarhoge vergroting en beweeg de naald in de ontvanger worm door met de microscoop podium.
21. Eenmaal gepositioneerd in de ontvanger worm gebruik maken van de injectie (ingesteld op 35 psi) functie om de pseudocoelomic vloeistof verzameld uit de donor te injecteren.
22. Trek de naald uit de ontvanger in door de worm microscooptafel in de tegengestelde richting gebruikt om de ontvanger in te voeren.
23. Met de naald uit de worm, zet u de naald uit de buurt van de injectie pad.
24. Verwijder de injectie pad en plaats een druppel M9 op de wormen om te herstellen.
25. Plaats een 10 ul druppel M9 op een testplaat.
26. Kies de ontvanger worm in de M9 op de testplaat.

4. Analyseren RNAi Fenotypische Transfer

1. Laat herstelde wormen gedurende 24 uur groeien bij 20 ° C.
2. Verwijder de ontvanger volwassenen, waardoor embryo's en uitgebroed nageslacht op de plaat. Incubeer plaat nog eens 24 uur bij 20 ° C.
3. Score nageslacht alshebben niet uitgekomen, uitgekomen maar omdat fenotypisch mutant, of het zijn wild-type larven.

Opmerkingen

1. NGM media wordt in 1 liter batches door toevoeging van 18 g agar, 2,5 g bactopepton, 3 g natriumchloride _en H2O Voeg roer bar en autoclaaf. Na autoclaveren zet de kolf op een roerplaat en laat de media afkoelen tot 60 ° C onder roeren. Nadat de media is afgekoeld, voeg 1 ml van cholesterol (5 mg / ml in ethanol), 1 ml 1M _CaCl2, 1 ml 1 M _MgSO4, 25 ml kaliumfosfaatbuffer (pH 6,0). Platen en worden gebruikt voor de RNAi NGM wordt aangevuld met 1 ml 1M IPTG en 1 ml 25 mg / ml carbenicilline na afkoelen tot 60 ° C. Platen gegoten in ofwel 35 mm (3,5 ml NGM) of 60 mm (8,5 ml NGM) petrischalen.
2. 2% agarose in water. Bewaar in de koelkast. Smelt en maak pads ruim voor de dag van pseudocoelomic vloeistof isolement. De droogte van de pad maakt de worm zich te houden aan de pad,en ten minste een dag luchtdroging is noodzakelijk voor de pads voldoende droog. Als de injecties pads zijn te droog en uw donor wormen sneller drogen van dan je ze kunt manipuleren kunt u extra vocht toe te voegen aan de injectie pads door het inademen op het pad voor het toevoegen van minerale olie. Ongeacht de mogelijkheid om snel te werken pseudocoelomic vloeistof te isoleren voordat de worm droogt absoluut noodzakelijk is.
3. We gebruiken carbenicilline bij alle stappen van onze RNAi bereidingen te selecteren op de ampicillineresistentie marker. Carbenicilline is een ampicilline analoog die stabieler en resulteert in minder kolonies dan satelliet ampicilline.
4. We gebruiken RNAi platen die NGM aangevuld met 1 mM IPTG en 25 pg / ml carbenicilline. De RNAi voeden vectoren zijn in de E. HT115 coli stam die deficiënt is voor een dsRNA nuclease.
5. (Optionele stap) We vinden dat gegeven een uur op unseeded NGM platen donor en ontvanger wormen een passende baan te verliezen cuticula te doengebonden bacteriën die is overgenomen uit de voeding platen. Dit geldt niet maar wanneer de RNAi target in het donordier interfereert met mobiliteit (bijv. unc-22 (RNAi)). Het wordt derhalve noodzakelijk om te helpen bij het proces. Hiervoor gebruiken we een depressie dia met ongeveer 50 ui M9. Het kiezen van wormen in de M9 van de RNAi voeden platen, dan roeren met een standaard platina worm pick voldoende is om de meeste aanklevende bacteriën te verwijderen.

5. Representatieve resultaten

Gepresenteerd zijn representatieve resultaten voor de experimentele overdracht van extracellulaire vloeistof van clr-1 (e1745) wormen gegroeid op bacteriën die dsRNA gericht pal-1. Het nageslacht van de donor dieren stierven en / of tentoongesteld posterieure patroonvorming gebreken. We dan overgebracht extracellulairevan deze dieren tot de pseudocoelom van RNAi naïeve wild-type wormen. Een gedeelte van de daaropvolgende nakomelingen van het ontvangende dier dan de verwachte weergegeven pal-1 mutant fenotype (Figuur 4). Dit in tegenstelling tot de nakomelingen van dieren die ontvanger extracellulaire ontvangen van donordieren gekweekt op zowel standaard bacteriële voedsel of control RNAi vector bacteriën die alleen getoond achtergrondniveaus van letaliteit (figuur 4). Hoewel nakomelingen van ontvangers van extracellulaire vloeistof van donor dieren die RNAi een significante toename in de frequentie van dsRNA geïnduceerde fenotypes de penetrantie niet zo sterk als in het donor dieren nakomelingen, waarbij bijna 100% van het nageslacht matrijs als unhatched embryo's en alleen zeldzaam, ernstig misvormde dieren broeden.

Figuur 1. Vampiric omgekeerde injectie setup. De juiste setup fora vampier omgekeerde micro-injectie setup is vergelijkbaar met een standaard C. elegans microinjectie rig en omvat een dissectie microscoop, een omgekeerde microscoop met 10x en 40x doelstellingen, een beweegbare podium voor positionering, en een micromanipulator met injectienaald houder. Bovendien wordt een naald trekker voor de bereiding van injectienaalden nodig. Uniek aan de omgekeerde micro-injectie-protocol een pico-injector die een nauwkeurige controle van de balans onder druk staat (bijv. Warner Instruments PLI-100) nodig.

Figuur 2. Versterking van pseudocoelomic volume. Het volume van vloeistof pseudocoelomic voor isolatie onvoldoende is voor assay in wild-type dieren. Het volume kan worden verhoogd door het verstoren van de regeling van de osmotische balans door temperatuurverschuiving van clr-1 (e1745) dieren, resulteert in duidelijke ophoping van vocht pseudocoelomic (witte pijl). Bovendien het verlies van de gonaden door laserablatie of GLP-1 (RNAi) geeft toegang tot de extracellulaire vloeistof (verlies door laserablatie wordt getoond). De beschikbare fluïdum wordt het gemakkelijkst waargenomen Clear pleisters tussen de donkere darm en de lichaamswand (zwarte pijl), maar de totale beschikbare volume is veel geringer dan in clr-1 (e1745) dieren gegroeid bij de restrictieve temperatuur.

Figuur 3. Vampiric isolatie en transfer protocol tijdlijn. Vier dagen voor overdracht experiment clr-1 (e1745) donor embryo isoleren op platen met RNAi voedsel en incubeer bij 20 ° C. Drie dagen voor isoleren N2 ontvanger embryo's OP50. Op de dag van het experiment verschuiven de donor platen 25 ° C gedurende vier uur. Verwijder de donoren na 25 ° C incubatie om schone borden ontbreken voedsel en verschuiving naar 20 ° C. Verplaats de ontvanger dieren platen schoon te makenweinig eten en verder incuberen bij 20 ° C. Voer overdracht experiment en herstellen ontvanger wormen op OP50 platen en incubeer bij 20 ° C. Verwijder de ontvangende dieren na 24 uur bij 20 ° C. Incubeer ontvanger nakomelingen gedurende 24 uur bij 20 ° C. Score nakomelingen als wild type, mutant of unhatched.

Figuur 4. Representatieve resultaten. Het verlies van PAL-1 functie in de ontvanger leidt tot embryonale letaliteit of verlies van kenmerkende ontwikkeling posterior (A). 48 uur na overdracht PCF nakomelingen opgenomen binnen de eerste 24 uur wordt gescoord als ofwel wildtype larven, Pal-1 larven of unhatched embryo. De frequentie van unhatched embryo's en fenotypisch Pal-1 larven worden gecombineerd om een maat pal-1 (RNAi) transfer geïnduceerde fenotypen geven. Ontvangst van pseudocoelomic vloeistof uit dieren gekweekt op PAL-1 dsRNA voedsel produceert een sterke inductie van de geassocieerdefenotypes ongezien in de controle-overdracht ontvangers (B).

Discussion

We hebben hier gepresenteerd een nieuwe methode die de isolatie en karakterisering van extracellulair vocht kan het modelorganisme C. elegans. De techniek begint met de genetische of fysieke manipulatie van donor wormen tot het totale volume van de extracellulaire vloeistof verhogen. Extracellulaire vloeistof wordt vervolgens geïsoleerd met een gemodificeerde micro-injectie techniek. De wormen zijn gemonteerd voor micro-injectie met behulp van droge agarose pads om stil te houden de wormen in de loop van de procedure. De fysieke gehechtheid aan de pad maakt gebruik van de kracht van drogen van het droge pad om de worm hydrostatisch zijn plaats te houden. Dit betekent een uitdaging, want zodra de worm is gemonteerd de beschikbare extracellulair water begint te worden afgevoerd van de donor dieren. Het is daarom noodzakelijk om snel te werken. Het kan nuttig zijn om een ​​aantal onderzoekers aan de wormen te schorten in de minerale olie op de injectie pad, maar niet hebben ze contact met het kussen. Na de montage van de injectie pad op the microscoop, en het afstemmen van de worm en de naald wachten tot de worm om contact te maken met de pad en het "mount" zelf. Bovendien, hoewel het mogelijk is fysiek wormen plaatsen op agar pads tijdens normaal microinjectie, vinden we dat de fysieke kracht op monteren wormen kan sterk het drogen van donor wormen versnellen. Het is het beste te halen de donor wormen in minerale olie, en over te brengen aan de pad door de invoering van de pick tip de buurt van de pad en het toestaan ​​van de worm om af te klimmen van de pick op zijn eigen.

Naast het werken snel, is het ook noodzakelijk de vampiric isolatietechniek zuiver voeren om infectie te voorkomen. De introductie van het algemeen goedaardige bacteriën in de cuticula leidt tot een hardnekkige en dodelijke infectie. Juiste techniek elimineert het voorkomen van infectie. Men kan testen op de reinheid van extracellulaire vloeistof overdracht door het gebruik van bacteriën die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. Bij de ontwikkeling van de techniek die we vonden het beneficial oefenen met bacteriestammen die kunnen worden gevolgd door fluorescentie ^{4, 5.} Als bacteriële verontreiniging komt de donor worm wordt gemakkelijk waargenomen binnen 24 uur na infectie.

We vinden dat de ontvanger wormen een zwakkere RNAi fenotype dan de donor wormen laten zien. Dit is niet verwonderlijk als de donor wormen worden gekweekt op bacteriën het genereren van een constante bron van dsRNA, terwijl de ontvangers van pseudocoelomic vloeistof overdracht krijgen een enkele dosis in op de normale fysiologische concentraties. Derhalve moet de beperking van gevoeligheid onderzocht en de sterkte van RNAi in de donor maximaliseren. Het gebruik van IPTG tot dsRNA productie induceren gedraagt ​​zich niet in een voorspelbare manier met meer inductie gelijk efficiënter RNAi. We wijzen de lezer naar de gepubliceerde karakterisering van het milieu RNAi efficiëntie (zie ^6,7,8). Wij stellen voor dat een experimenteel bepaalt de meest efficiënte methode van de levering aan de donor prIOR het isoleren extracellulaire vloeistof voor analyse.

We hebben aangetoond dat systemische RNAi signalen van dsRNA gevoed kan worden gedetecteerd in de extracellulaire vloeistof. Karakterisering van deze signalen aangetoond dat identificatie en genetische analyse van extracellulaire vloeistof mogelijk is. Hoewel we hoofdzakelijk gebruikt genetische analyse van deze extracellulaire signalen te karakteriseren, zou het ook mogelijk moleculaire analyse van extracellulaire voeren. Verwijderd vloeistof kan worden behandeld, hetzij chemisch of enzymatisch, vóór overdracht. Bovendien kan vloeistof uit meerdere dieren worden verzameld in een micro-centrifugebuis voor moleculaire assay. Pooling van materiaal van meerdere donoren voor overdracht in een enkele donor is moeilijk, hoewel kan blijken mogelijk met de praktijk. Met verfijning en aanpassing voorzien we toekomstige toepassingen veel verder gaat dan verdere karakterisering van RNAi het induceren van extracellulaire signalen. De identificatie en karakterisering vanendogene systemische signalering RNA's, genetische analyse van ontwikkelingsstoornissen intercellulaire signaalwegen, en milieuvriendelijke geïnduceerde veranderingen in extracellulaire samenstelling kan mogelijk zijn door aanpassing van deze techniek.