Induktion af myokardieinfarkt i Adult Zebrafisk Brug kryobeskadigelse

Summary

Zebrafisk repræsenterer en værdifuld model til at studere de mekanismer hjerte regenerering i hvirveldyr. Her præsenterer vi en protokol for induktion af et hjerte infarkt hos voksne zebrafisk hjælp kryobeskadigelse. Denne metode resulterer i massiv celledød i 20% af den ventrikulære væg, der ligner den, der observeres i mammale infarkter.

Abstract

Pattedyr hjertet er i stand til signifikant regenerering efter en akut skade, såsom myokardieinfarkt ^1. Derimod bevarer urodele padder og benfisk en bemærkelsesværdig evne til hjerte regeneration med ringe eller ingen ardannelse hele livet ^2,3. Det vides ikke, hvorfor kun nogle ikke-pattedyr hvirveldyr kan genskabe en komplet orgel fra rest væv ^4,5. For at forstå de molekylære og cellulære forskelle mellem regenerative reaktioner i forskellige arter, er vi nødt til at anvende lignende metoder til at fremkalde akutte skader.

I pattedyr, er det hyppigst anvendte model til at studere hjerte reparation er akut iskæmi efter ligering af koronararterie eller vævsødelæggelse efter kryobeskadigelse ^6,7. Den kardielle regenerering i salamandre og zebrafisk er blevet overvejende undersøgt efter en delvis resektion af den ventrikulære Apex ^2,3. Nylig har adskillige grupper har established den kryobeskadigelse teknik voksne zebrafisk ^8-10. Denne fremgangsmåde har et stort potentiale, da det tillader en sammenlignende diskussion af resultaterne opnået fra pattedyr og ikke-pattedyr.

Her præsenterer vi en metode til at fremkalde en reproducerbar skiveformet infarkt af zebrafisk ventrikel ved kryobeskadigelse. Denne skade model er baseret på hurtig frysning-optøning væv, hvilket resulterer i massiv celledød på omkring 20% ​​af kardiomyocytter i den ventrikulære væg. Først blev et lille indsnit foretages gennem brystet med iridectomy saks adgang til hjertet. Ventrikelvæggen blev direkte frosset ved at ansøge om 23-25 ​​sekunder af rustfrit stål cryoprobe forkølet i flydende nitrogen. At standse frysning af hjertet, fisk vand ved stuetemperatur blev dryppet på spidsen af ​​cryoproben. Fremgangsmåden tolereres godt af dyrene, med en overlevelsesgrad på 95%.

For at karakterisere regenerative proces, hjerter varindsamlet og fast på forskellige dage efter kryobeskadigelse. Efterfølgende blev prøven indlejret for cryosectioning. Objektglassene med sektioner blev behandlet til histologisk analyse, in situ hybridisering og immunofluorescens. Dette tilsagn øger vores forståelse af de faktorer, der er nødvendige for regenerativ plasticitet i zebrafisk, og give ny indsigt i maskinerne af hjertets regenerering. En begrebsmæssig og molekylær forståelse af hjertet regenerering i zebrafisk vil påvirke både udviklings-biologi og regenerativ medicin.

Protocol

1. Udstyr Set-up

1. Den vigtigste værktøj til at udføre kryobeskadigelse er cryoproben, i pen-lignende instrument, der er fremstillet af rustfrit stål (figur 1A). Det cylindriske skaft er 40 mm lang og har en diameter på 8 mm. Spidsen af ​​applikatoren er 6 mm lang og 0,8 mm i diameter. Forbindelsen mellem spidsen og håndtaget er konisk 4 mm lange. Desuden skal håndtag cryoproben isoleres med et plastrør, og bånd for at undgå forfrysninger af fingrene mens man holder værktøjet under proceduren.
2. Andre materialer, der er nødvendige for kryokirurgi er et stereomikroskop, skarpe pincet, mikro dissekere forår saks og en plastik overførsel pipette. Desuden fremstilling af et bæger til bedøvelse af fisk og en plastikske til overførsel af fisk.
3. Under operation, fisken anbringes på en fugtig svamp med ventrale opad (fig. 1B). At holde dyret i en stabil procedure, enpassende rille skal manuelt skæres i svampen.
4. Fremstilling af en beholder med systemet vand til overføring fisken efter operationen.
5. Opret en dobbelt timer først med en 10 sekunders nedtælling og derefter automatisk en 24 sekunders nedtælling.

2. Den kryobeskadigelse Procedure

1. Afkøle cryoproben ved nedsænkning spidsen i 3-5 cm i flydende nitrogen i mindst 3 minutter.
2. Bedøver en voksen zebrafisk ved immerging den i 0,02% tricaine indtil fisken vender om på ryggen og dens gæller næsten op med at bevæge (ca. 90 sekunder).
3. Overføre fisk med en plastikske en fugtig svamp, der er skåret til at holde en fisk på hovedet (fig. 1B). Hold fisken fast med en pincet med ikke-dominerende hånd. Visuelt lokalisere den posteriore mediale margen af ​​hjertet og brug lige iridectomy saks til at punktere huden. (Figur 1C).
4. Lav en lille (ca. 2 mm) incision over hjertet ved cutting lige anteriort gennem huden, muskler (figur 1D). Der må ikke skæres igennem knoklet branchial apparatet, da dette vil dræbe dyret.
5. Forsigtigt rive den sølvfarvede epithellaget af hypodermis (fig. 1E) med spidsen af en saks til at have en direkte adgang til at slå ventrikel. Sæt ikke saksen dybere i kroppen hulrum, da dette vil punktere hjertet. Det bankende hjerte skal være godt synlige, og ingen omfattende blødning bør ske i løbet af torakotomi (1F).
6. Starte programmeret timer, der er indstillet i 10 sekunder efterfulgt af 24 sekunder. I 10 sekunder tag cryoproben fra den flydende nitrogen. Sørg for, at der ikke er mere kvælstof på kryosonden ved at ryste den forsigtigt. Fordel snittet sideværts ved hjælp af en pincet til at åbne brystet (1F).
7. Når timeren ringe 10 sekunder, røre ved det samme, men forsigtigt ventriklen med spidsen af ​​PRe-kølet cryoproben (fig. 1G).
8. Når timeren ringe 24 sekunder, hæld 2-3 ml systemet vand ved hjælp af en plastik pipette på brystet for at frigøre kryosonden fra væv, og overføre fiskene ind i tanken med systemet vand.
9. Fiskene skal genstarte vejrtrækning efter et par sekunder, og så skulle genoptage svømning. Hvis det ikke trække vejret efter omkring 45 sekunder, stimulere dyret ved at sprøjte vand ind i gællerne med en plastpipette, indtil det begynder at trække vejret af sig selv. I vores erfaring, overlever 95% af fiskene kirurgi, og alle dødsfald på dagen for kirurgi. Det vil ikke være nødvendigt at suturere indsnit.

3. Heart Collection og fiksering

1. Forbered 1 ml 2% formalin i et mikrocentrifugerør for fastsættelse af hjertet, to pincet, mikro-dissekere saks, og den fugtige slidsede svamp.
2. Ved den valgte dage efter kryobeskadigelse, aflive fisken i 0,1% tricaine i 5 minutter.
3. Placerfisk ventrale side op i en fugtig, slidset svamp. Lav en stor (ca. 4 mm) incision over hjertet gennem branchial brusk med mikro dissekere saks. Åbn bredt snittet med en pincet (fig. 1 H).
4. Afklemme den bulbus arteriosus et hvidt struktur anterior til ventriklen (fig. 1 HI), og fjerne hjertet fra hulrummet ved at trække det. En hel dissekeret hjerte er vist i fig 1J og figur 2A.
5. Anbring op til 3 hjerter i et mikrocentrifugerør med 1 ml 2% formalin. Forsigtigt dreje røret flere gange og opbevares natten over ved 4 ° C.

4. Heart Montering

1. Skyl hjerterne i PBS i 5 minutter. Overfør hjerterne i 10 ml 30% saccharose, som skal klargøres afkøles ved 4 ° C, og blandes forsigtigt. Prøven bør først flyder på overfladen af ​​saccharoseopløsning. Fortsat inkubering i 1 time og 20 minutter ved 4 ° C. Efterdette tidspunkt vil hjerter synke til bunden af ​​røret.
2. Forbered en kasse med tøris. Tage en indlejring støbeform, og hæld en 5 mm lag af OCT montering medium i bunden af ​​formen.
3. Med pincet placere hjertet i OC T monteringsmedium i formen. Under stereomikroskop, justere orienteringen af ​​prøven for at opnå den ventrikulære apex på bunden af ​​støbeformen, og bulbus arteriosus mod toppen.
4. Placer formene med prøvegenstanden på tøris. Når monteringsmedium begynder at fryse, fylde resten af ​​formen med OCT medium og lad det fryse fuldstændigt. Holde formen i mindst 1 time ved -80 ° C før skæring. Den frosne prøve kan lagres i flere måneder ved -80 ° C.

5. Hearts koblinger

1. Etablere en kryostat med en skærende størrelse på 16 um, en kammertemperatur på -24 ° C, og temperaturen af ​​prøven ved -22 ° C.
2. Anbring den frosne blok medvist i kryostaten og fastgør dens orientering til at begynde at skære parallelt med bunden af ​​blokken.
3. Forbered seks SuperFrost-plus slides per en blok og numerate dem fra 1 til 6. Start skære, indtil vævet er nået, og trim blokken omkring prøven med et barberblad.
4. For at opnå 6 replikater af en hjerte, tage det første afsnit på dias 1, andet afsnit på dias 2, den tredje på dias 3, osv. Når du placerede den sjette afsnit om slide 6, genstarter med slide 1 og fortsætte, indtil helorgan skæres. Saml to rækker af omkring 8 sektioner på dias (Figur 3).
5. Lad objektglassene tørre i 1 time ved stuetemperatur. Opbevar dem i op til 1 år i tæt lukkede kasser ved -20 ° C.

6. Repræsentative resultater

Repræsentative kardiel skade efter denne protokol er vist i dissekerede hele hjerter ved 4 dpci (dage efter kryobeskadigelse, figur 2D-F). Til visualize det myocardiale væv in vivo anvendte vi transgene fisk udtrykker EGFP og nukleare DsRed2 under kontrol af hjerte-specifik cmlc-2-promotoren ^11,12. Fraværet af EGFP og DsRed2 fluorescerende signaler afgrænses en skiveformet infarktzonen langs apikale-laterale ventrikelvæg.

At udføre cellulære og molekylære analyser af vævet, hjerterne blev fikseret og snittet med en kryostat. En repræsentativ objektglas med en konsekutiv serie af tværgående hjerte sektioner er vist i figur 3.

Sektionerne kan analyseres med forskellige metoder (figur 4). At bestemme udstrækningen af hjertet regenerering versus ardannelse, udførte vi histologisk analyse under anvendelse af sur fuchsin Orange G (AFOG) farvning, der differentielt mærker hjerte-og fibrotisk væv ^9. De genekspressionsanalyse blev opnået efter in situ-hybridisering procedure 9. En kombination af forskellige farvningsprocedurer fører til identifikation af molekylære og cellulære mekanismer involveret i hjertets regenerering efter kryobeskadigelse.

Figur 1. Induktion kryobeskadigelse af ventriklen i den voksne zebrafisk. (A) et fotografi af cryoproben. (B) En voksen zebrafisk er placeret i spalten af ​​svampen med ventrale side opad. (CF) Bryst snit at få adgang til hjertet. (C) Et lille snit gennem huden og muskler foretages mellem de to brystfinnerne (rød linje). (D) saks indsættes i indsnittet at skære huden efter den røde pil. (E) under huden, er det fine lag sølvagtigt hypodermis (omgivet af blå stiplet linie) forsigtigt åbnet for at få adgang til hjertet. (F) incision spredes medpincet og slå ventrikel (grøn pil) er tilgængelig for kryobeskadigelse. (G) den kolde cryoproben forsigtigt indsat i brystet at røre hjertet. (HJ) Heart kollektion. (H) En dyb og lang incision gennem Branchialfedderne buer brystet for at få adgang til perikardial hulrum. To hjerte strukturer er synlige: bulbus arteriosus (hvid pil) og ventrikel (grøn pil). (I) bulbus arteriosus er at holde med pincet og trækkes ud fra kropskaviteten. (J) hele hjertet udskæres fra af kroppen.

Figur 2. Repræsentant kontrol og cryoinjured hjerter dissekeret fra voksne transgene zebrafisk udtrykke EGFP og nuklear DsRed2 i cardiomyocytes. (AC) uskadt hjerte. (A) mørkefeltbelysning viser ventrikel (V), bulbus arteriosus (Ba, hvid) og ventiler (Va), hvor atrium blev forbundet til ventriklen. (B og C) Fluorescerende billeder af t Han intakt ventrikel display EGFP og DsRed2 ekspression i cardiomyocytter. (DF) Heart ved 4 dage efter kryobeskadigelse (4 dpci) (D) mørkefeltbelysning viser et skiveformet infarkt (gul stiplet linie). (EF) cardiomyocyte markører EGFP og DsRed2 ikke detekteres i infarktareal, indikerer den beskadigede myokardium (omgivet af punkterede linie).

Figur 3. Afskæring af hjerte. (A) Hele hjertet med tegningen af ​​tværgående sektioner fra bunden af ​​hjertet (1 og 2, med rødt) mod toppen af ​​hjertet (3 og 4 i grøn). (B) fotografi af et dias med den række af på hinanden følgende tværgående sektioner farvet med AFOG (Acid Fuchsin Orange-G). De første sektioner (1 og 2, røde firkanter) indeholder ventrikulære apex, og de sidste dele af hjertet (3 og 4, grønne firkanter) omfatter bulbus arteriosus.

iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/>
Figur 4. Eksempler på analyser udført på hjerte sektioner på 7 dage efter kryobeskadigelse. (A) AFOG (Acid Fuchsin Orange-G) farvning etiketter sunde muskelceller i orange, det arvæv, der indeholder kollagen i blåt og fibrin i rødt. (B) In situ-hybridisering af ventrikulær myosin-tung kæde (vmhc) mRNA visualiserer intakte myokardiet (blå farvning). Det skadede væv er blottet for hjertets gentranskriptet (rød stiplet linie). (C) immunanalyse af tropomyosin (grøn) mærker intakte cardiomyocytter og ikke beskadiget væv (omgivet med den punkterede linie). DAPI (blå) pletter kernerne i alle cellerne. (D) Genetisk mærket cardiomyocytes express DsRed2 (rød) i deres kerner. DAPI (blå) etiketter alle kernerne. Infarktzonen indeholder ikke DsRed2-positive celler (hvid stiplet linie).

Discussion

Kryobeskadigelse er defineret som den styrede beskadigelse af væv ved den præcise anvendelse af ekstrem kulde ^14. Direkte termisk chok ødelægger celler ved protein ødelæggelse og intracellulære væske iskrystaldannelse at brydes plasmamembranen. Følgelig de beskadigede celler dør i fremgangsmåderne ifølge apoptose og nekrose ^14. Begge disse celledød mekanismer er blevet vist at bidrage til tab af væv efter myokardieinfarkt ^15. Således kryobeskadigelse betegner en egnet model til at inducere et hjerte infarkt. Adskillige studier rapporterede dette godt bevist metode i forskellige pattedyr, herunder mus, rotter, kaniner og grise ^6,7. Den tilpasning af kryobeskadigelse protokollen i zebrafisk muliggør en mere komparativ diskussion om infarkt respons mellem forskellige arter.

To andre grupper udviklede uafhængigt kryobeskadigelse proceduren for voksne zebrafisk hjertet. De store forskelle er surGerys metoder, typen af ​​værktøjer og anvendes frysning tid. I undersøgelsen af Gonzalez-Rosa et al. Blev pericardium åbnet ved oprivning vævet i stedet for skæring. De brugte 0,3 mm kobber endeløse knyttet til en polyamid rør på forhånd afkølet i flydende nitrogen til at fryse hjertet i et par sekunder, indtil optøning kunne observeres ^10. I undersøgelsen af Schnabel et al. En konisk stykke tøris 20 mm længde med en spids på 2 mm i diameter blev anvendt til at røre hjertet i 10 sekunder ^8. De to grupper opnåede ventrikulær skader gennem døden af ​​myokardiet. Fordel af vores fremgangsmåde er en mere reproducerbar aflejring af kollagen-rige ar, som bedre efterligner de tidlige infarkt helbredende responser observeret i mammale systemer.

Det kritiske trin i kryobeskadigelse fremgangsmåden i zebrafisk er et snit gennem huden og pericardiale sæk uden at punktere den underliggende hjertet. En korrekt performed kirurgi forårsager mindre blødning. Voldsom blødning angiver en utilsigtet punktering af ventriklen med saks. I sådanne tilfælde bør dyrene trækkes ud af eksperimentet. For at undgå at punktere hjerte, bør det punkt saks være rettet mod en flad vinkel i forhold til huden.

Et andet vigtigt aspekt for at skabe en reproducerbar skade, er den nøjagtige placering af den kolde cryoproben i ventriklen for den optimale præcise varighed. For kort frysning tid vil resultere i inflammation med lille celledød. Langvarig nedfrysning på den anden side forårsager kan omfattende beskadigelse af hjertet, hvilket kan føre til forøget dødelighed af dyrene. Vi bestemt, at den optimale tid til at holde ventrikel i frossen tilstand ligger i området mellem 23-26 sekunder for en 2 cm lang voksen zebrafisk, og det kan være forskelligt dosisafhængigt på størrelsen af ​​dyrene.

Fordi vores protokol er meget enkel og hurtig, der er ingen eksperimentelle begrænsningtioner i underkaste tilstrækkeligt antal dyr for at opnå tilstrækkelige biologiske replikationer. Den kryokirurgiske behandling udmærket tåles af dyrene. Indsamling af hjerter på forskellige tidspunkter efter kryobeskadigelse giver detaljeret karakterisering af de efterfølgende faser i løbet af regenerative proces. Den eksperimentelle gennemgang af de cryoinjured hjerter kan omfatte 1) visualisering af gentranskription ved in situ hybridisering, 2) påvisning af protein fordeling ved immunofluorescent farvning, 3) histologisk billeddannelse af forskellige strukturer. Forståelse af de vigtigste helbredende processer efter myokardieinfarkt i zebrafisk vil påvirke området for regenerativ biologi. Endvidere kan det være gavnligt for at designe hidtil ukendte terapeutiske strategier til regenerativ medicin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5602
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Formaldehyde ~36%	Sigma-Aldrich	47630
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8	Polysciences, Inc.	18985