Generación de las Culturas Raft organotípicos de queratinocitos humanos primarios

Summary

Un

Abstract

El desarrollo de las culturas organotípicos balsa epiteliales ha proporcionado a los investigadores con un eficiente sistema in vitro que fielmente recapitula la diferenciación epitelial. Hay muchos usos para este sistema. Por ejemplo, la capacidad de crecer cultivos tridimensionales balsa organotípicos de queratinocitos ha sido un hito importante en el estudio de los virus del papiloma humano (VPH) ^1. El ciclo de vida del HPV está estrechamente vinculada a la diferenciación del epitelio escamoso ^2. Organotípicos culturas balsa epiteliales como se ha demostrado aquí reproducir el ciclo de vida completo del virus del papiloma, incluidos los virus de la producción ^3,4,5. Además, estos cultivos presentan lesiones displásicas balsas similares a los observados en la infección in vivo con el VPH. Por tanto, este sistema también puede utilizarse para estudiar los cánceres de células epiteliales, así como el efecto de fármacos sobre la diferenciación de células epiteliales en general. Originalmente desarrollado por Asselineau y Prunieras et al. ^7, el sistema organotípico epitelial cultivo en balsas ha madurado en un modelo general, la cultura relativamente fácil, que implica el crecimiento de células sobre el colágeno se enchufa mantuvo a una interfase aire-líquido (Figura 1A). Durante el curso de 10-14 días, las células estratificar y diferenciar, formando un epitelio de grosor completo que produce específicos diferenciación-citoqueratinas. Balsas cosechadas se pueden examinar histológicamente, así como por las técnicas estándar de moleculares y bioquímicos. En este artículo, se describe un método para la generación de cultivos primarios balsa de queratinocitos humanos. La misma técnica se puede utilizar con las líneas celulares establecidas epiteliales, y puede ser fácilmente adaptado para su uso con el tejido epitelial de biopsias normales o enfermas ^8. Muchos virus objetivo, ya sea el epitelio cutáneo o mucoso, como parte de su ciclo de vida replicativa. En los últimos años, la posibilidad de utilizar culto balsa organotípicoUres como un método de estudio de virus-huésped interacciones celulares se ha demostrado por varios herpesvirus, así como adenovirus, parvovirus, y poxvirus ^9. Cultivos organotípicos balsa por lo tanto se puede adaptar para examinar la patogénesis viral, y son el único medio para poner a prueba nuevos agentes antivirales para los virus que no son cultivables en líneas celulares permanentes.

Protocol

1. Preparación para las Culturas Raft organotípicos

1. Las rejillas balsa de metal mucho primero se trata con ácido crómico sulfúrico para eliminar cualquier residuo que pudiera interferir con el proceso de diferenciación. Sumergir rejillas metálicas en un vaso de precipitados de vidrio que contenía ácido sulfúrico durante una hora, a continuación, de forma continua durante la noche enjuaga con agua del grifo. Después de la noche a la mañana enjuague, las redes de balsas debe enjuagarse durante 3-5 horas en agua doblemente destilada.
2. Para prestar apoyo a las balsas, doble tres lados de la balsa de 0,5 cm en la misma distancia el uno del otro. Las rejillas de metal, entonces deben ser esterilizados en autoclave.
3. Preparar el tampón de reconstitución 10 veces mediante la adición de 2,2 g de NaHCO3 y 4,8 g de Hepes. Disolver en 100 ml de 0,05 M de NaOH. Filtrar esterilizar y almacenar en alícuotas de 5 ml a -20 ° C.
4. Prepare el 10 veces DMEM sin bicarbonato de sodio. Filtrar esterilizar y almacenar en alícuotas de 5 ml a -20 ° C.
5. Preparar el factor de crecimiento epidérmico del ratón: Disolver 100 mg de EGF y 10 mg de BSA cada en 10 ml de agua desionizada ddH ₂ 0. Combinar EGF y BSA y añadir a 80 ml ​​de agua desionizada ddH ₂ 0 para un volumen total de 100 ml. Filtrar a esterilizar, alícuota (5 ml) y en la tienda de -20 ° C. Para cada litro de medio E añadir 5 ml de 1 mg / ml de EGF (concentración final de 5 ng / ml).

2. Preparación de geles de colágeno

1. Un gel de colágeno se requiere para cada balsa. El colágeno se debe mantener en hielo para evitar que se solidifique. Cada gel de colágeno requiere 3 ml de mezcla de colágeno que consta de: 2,4 ml de colágeno de tipo frío de cola de rata I (concentración final de 3-4 mg / ml), 0,3 ml de tampón 10X de la reconstitución, 0,3 ml de DMEM 10X and1-2 X 10 ⁶ ratón J2 3T3 fibroblastos como células alimentadoras. Para soluciones de alta concentración de colágeno de cola de rata, se diluye en 0,02 M de ácido acético para conseguir la concentración de trabajo correcta.
2. Determinar el número de geles de colágeno (balsas) que se necesita y luego calcular una mezcla maestra de la cantidad de colágeno, reconstit 10 veceslución tampón, 10X DMEM y fibroblastos J2 requerido. Incluir suficiente en cada mezcla maestra para 3-4 geles adicionales debido a la viscosidad del colágeno.
3. Para preparar el gel de colágeno, trypsinize los fibroblastos J2 y neutralizar con el medio. Combine todos los fibroblastos y el lugar en un frasco cónico de 50 ml. Cuenta las células para determinar el número de balsas que se pueden hacer. De nuevo, 1-2x10 ⁶ fibroblastos se requieren por gel de colágeno y, por tanto por balsa. Gira a las células a baja velocidad.
4. Aspirar el medio de la pastilla de fibroblastos y resuspender en la cantidad apropiada de tampón de reconstitución 10X, 10X DMEM y colágeno para el número de balsas calculados. Añadir el colágeno pasado para evitar que el gel se solidifique demasiado rápidamente. Una vez que el colágeno se añade, mezclar rápidamente, pero con cuidado para evitar la introducción de burbujas en el gel. El gel debe ser de un color naranja rojizo, indicativo de que el pH correcto. Si la mezcla de gel es demasiado amarillo, añadir un par de gotas de 1N, esterilizada por filtraciónNaOH y mezclar suavemente hasta obtener el color correcto.
5. Añadir 3 ml de la colágeno: mezcla de fibroblastos a los pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos. La mezcla de colágeno se pipeteó lentamente por el lado de cada pocillo para evitar la generación de burbujas. Colocar la placa en un 37 ° C tejido incubadora cultura y dejar que se solidifique durante 30 minutos.
6. Después de 30 minutos, añadir 3 ml de medio de E con EGF a la parte superior del gel de colágeno solidificado y devolver la placa a la incubadora. Los geles se deben mantener a 37 ° C durante al menos un día, pero utiliza un plazo de cuatro días. Los resultados óptimos se producen después de dos días de incubación.

3. Los queratinocitos Preparación para la diferenciación

1. Queratinocitos de bajo pasaje debe ser aumentado a aproximadamente el 70% de confluencia. Cada balsa requiere 1-2x10 ⁶ queratinocitos. Trypsinize los queratinocitos y neutralizar con un medio electrónico con EGF. Cuenta las células para determinar el número de balsas que se pueden hacer. Gira por las células en espe bajaed. Resuspender el precipitado en 1 ml de medio de E junto con la FGE para cada cultivo en balsas calculado.
2. Aspirar el medio de los geles de colágeno por la inclinación de la placa de 6 pocillos. Añadir 2 ml de medio fresco E con EGF a cada gel. Para cada gel, añadir cuidadosamente 1 ml de queratinocitos resuspendidos a los 2 ml de medio E ya presente en el pozo. Suavemente pipeta los queratinocitos más el 2 ml de los medios y luego dejar caer gota a gota de nuevo en el gel. Agitar o balanceo de la placa puede resultar en una distribución desigual de las células a un lado del gel de colágeno. Colocar la placa en la incubadora a 37 ° C.
3. Las células se cultivan hasta la confluencia, reemplazando el medio E diariamente. Las células son confluentes cuando los cambios en el medio a amarillo un día después de un cambio en el medio. Esto suele tardar entre 2-4 días. Si el medio no ha cambiado por día cuatro, proceder al paso siguiente.

4. Realización de las Culturas Raft

1. Use pinzas estériles para colocar una rejilla metálica balsa de estériles, se inclinó por los lados, En un plato de 10 cm. Aspirar el medio de gel de colágeno. Para aflojar el gel de las paredes del pozo, ir alrededor del perímetro del gel con una espátula estéril usando un movimiento ascendente y descendente. Para quitar el gel de colágeno, incline ligeramente la placa y levantar mediante la colocación de una espátula por debajo. Colocar el gel de colágeno en la rejilla metálica sin generar burbujas entre la rejilla y el gel. Dos geles se pueden colocar en cada cuadrícula.
2. Con el fin de hacer una interfase aire-líquido, se añade medio de E sin EGF lentamente a la parte inferior del plato por lo que la rejilla balsa está en contacto con los medios pero el gel de colágeno no lo es. Los medios de comunicación no deben entrar a través de los agujeros en la red. Añadir poco a poco el medio para evitar la generación de burbujas en la red, ya que esto evitará que la diferenciación uniforme. Incubar las balsas a 37 ° C y cambiar el medio de cada dos días manteniendo la interfase aire-líquido. Coseche las balsas después de 14 días.

5. Los resultados representativos

Cuando tl protocolo se realiza correctamente con queratinocitos primarios, este procedimiento se traducirá en un epitelio bien diferenciado donde las diferentes capas de la piel son evidentes. Esto se logrará mediante el examen histológico mediante la tinción de las secciones de las culturas balsa de hematoxilina y eosina (H & E), como se muestra en la Figura 1B. Tinción H & E también es útil para examinar la morfología de las balsas y el efecto de los virus o compuestos antivirales sobre la capacidad de las células para estratificar y diferenciar. Por ejemplo, balsas hechas de VPH-inmortalizado queratinocitos humanos primarios (HFK-31) son notablemente más gruesa en comparación con balsas hechas de queratinocitos normales de prepucio humano (HFK), lo que refleja un aumento en la tasa de proliferación y la capacidad de las proteínas del VPH para mantener las células de diferenciación activa en el ciclo celular (Figura 1B) ^10. Esto da como resultado la retención de los núcleos a través del epitelio, mientras que los queratinocitos normales salen del ciclo celular en la diferenciación, resultando en una ruptura delenvoltura nuclear. Para examinar más de cerca la diferenciación, inmunohistoquímica se puede realizar para examinar marcadores específicos de diferenciación, incluyendo citoqueratinas, así como involucrina, y filagrina. Citoqueratinas diferentes se expresan en etapas específicas de la diferenciación ^7. Como se muestra en la Figura 2, citoqueratina 10 (K10) no se expresa en la capa basal, y se encuentra sólo en las capas suprabasales que consisten en células progresivamente diferenciadores. En las balsas de VPH positivos, la expresión de K10 se retrasa en comparación con la de queratinocitos normales, reflejando la influencia de las proteínas del VPH en la diferenciación de los queratinocitos. Inmunohistoquímica también se puede utilizar para examinar el perfil de expresión de los genes virales. Se muestra en la Figura 3 es una tinción representativa examinar la expresión de la proteína E1 VPH ^ E4, que es una proteína finales cuya expresión está restringida a las capas superiores del epitelio. Como era de esperar, no hay manchas que se observa en las culturas balsa de lo normal Human queratinocitos prepucio.

Figura 1. Un esquema) de un método para la preparación de cultivos organotípicos balsa a partir de queratinocitos primarios o líneas de células epiteliales. B) Hematoxilina y eosina de las culturas balsa organotípicos generados a partir de queratinocitos de prepucio humano de forma estable el mantenimiento de VPH-31 (HFK-31) episomas, o de los queratinocitos normales de prepucio humano (HFK). Las capas epiteliales individuales se identifican, así como el tapón de colágeno.

Figura 2. Citoqueratina 10 (K10) expresión está restringida a las capas suprabasales del epitelio. Inmunohistoquímica se realizó en las secciones transversales de cultivos balsa organotípicos generados a partir de células HFK-31, así como HFKs normales usando un anticuerpo a K10. ADN celular se counterstained con DAPI. Las imágenes fueron capturadas utilizando confmicroscopía de fluorescencia vecinal. Las flechas indican la capa basal del epitelio.

Figura 3. E1 VPH ^ proteína E4 se produce al final de la fase productiva del ciclo de vida viral. Inmunohistoquímica se realizó en las secciones transversales de cultivos balsa organotípicos generados a partir de células HFK-31, así como HFKs normales usando anticuerpos para E1E4. ADN celular se counterstained con DAPI. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia confocal. Las flechas indican la capa basal del epitelio.

Discussion

Se describe aquí un método que puede utilizarse para estudiar la diferenciación epitelial en general, pero también puede ser fácilmente adaptado para estudiar la patogénesis viral, así como la eficacia de la terapéutica potencial. Muchos virus orientar las células epiteliales, ya sea como el sitio primario de la infección, como en el caso de VPH, o en algún punto del ciclo de vida viral, como con herpesvirus. Aunque cada vez más cultivos organotípicos balsa es mucho tiempo, la capacidad de hacer una recapitulación fielmente en la diferenciación epitelial in vivo constituye un método muy útil para examinar el virus: las interacciones de la célula huésped. Para crecer con éxito un epitelio completamente diferenciada, hay algunos pasos críticos que deben ser reconocidos. Con el fin de conservar la capacidad de diferenciar en cultivos balsa, uno debe tener un número suficiente de alimentadores de fibroblastos en el gel de colágeno para mantener la monocapa de queratinocitos. Pobre diferenciación en cultivos balsa también puede ser debido a una muy baja densidad de los queratinocitossobre el colágeno: gel de fibroblastos, la construcción de balsas incorrecta o por no cambiar los medios de comunicación todos los días. Un parámetro adicional que se debe considerar para asegurar la calidad de la diferenciación epitelial es el tipo de alimentador de fibroblastos utilizado. Por el procedimiento descrito aquí, 3T3 de ratón J2 fibroblastos se utilizaron. Mientras que los fibroblastos se pueden utilizar otros como alimentadores, se recomienda que los fibroblastos que se dividen rápidamente, o podría migrar a la superficie cutánea no ser used7. Aunque este protocolo exige la recolección de las balsas después de 14 días, balsas pueden ser cosechadas antes de este punto del tiempo, así como después. Sin embargo, después de 14 días las balsas progresivamente se vuelven más delgadas. Además de seccionar las culturas balsa para el análisis inmunohistoquímico, las balsas también pueden ser cosechados para el ARN y el ADN, así como la producción de virus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010