جيل من الثقافات الطوافة عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية

Summary

و

Abstract

وقد وفرت تنمية عضوي النمط الثقافات طوف الظهارية مع الباحثين فعالة في نظام المختبر أن التمايز يلخص بأمانة الظهارية. هناك العديد من الاستخدامات لهذا النظام. على سبيل المثال، كانت القدرة على النمو ثلاثي الأبعاد الثقافات طوف عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية معلما هاما في دراسة فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) ^1. وترتبط بإحكام دورة حياة فيروس الورم الحليمي البشري إلى التفريق بين ظهارة الحرشفية ^2. تظاهر عضوي النمط الثقافات طوف الظهارية كما تتكاثر هنا حياة فيروس الورم الحليمي كامل دورة، بما في ذلك إنتاج فيروس ^3،4،5. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الثقافات طوف معرض آفات خلل التنسج مماثلة لتلك التي لوحظت على العدوى في الجسم الحي مع فيروس الورم الحليمي البشري. ومن هنا يمكن أيضا أن تستخدم هذا النظام لدراسة سرطان الخلايا الظهارية، فضلا عن تأثير المخدرات على تمايز الخلايا الظهارية بشكل عام. وضعت أصلا من قبل Asselineau وPrunieras وآخرون. ^7، وعضوي النمط ثقافة طوف الظهارية نظام قد نضجت في عام، نموذج ثقافة سهلة نسبيا، والذي ينطوي على نمو الخلايا في الكولاجين المقابس المحافظة على واجهة الهواء السائل (الشكل 1A). على مدار 10-14 يوما، وخلايا تطبق وتفرق، وتشكيل ظهارة سمك كامل الذي ينتج التمايز محددة cytokeratins. يمكن فحص القوارب التي تحصد تشريحيا، فضلا عن مستوى التقنيات الجزيئية والكيمياء الحيوية. في هذه المقالة، ونحن تصف طريقة لتوليد الثقافات طوف من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية. ويمكن استخدام نفس الأسلوب مع إنشاء خطوط الخلايا الظهارية، ويمكن بسهولة تطويعها للاستخدام مع الأنسجة الظهارية من الخزعات طبيعي أو المريضة ^8. العديد من الفيروسات الهدف إما ظهارة الغشاء المخاطي الجلدي أو كجزء من تنسخي دورة الحياة. على مدى السنوات العديدة الماضية، وجدوى استخدام عضوي النمط عبادة طوفوقد تبين أن القوام كوسيلة لدراسة التفاعلات الخلية الفيروسات المضيف لherpesviruses عدة، فضلا عن الفيروسات الغدية، parvoviruses، وpoxviruses ^9. وبالتالي يمكن أن الثقافات طوف عضوي النمط يمكن تكييفها لدراسة المرضية الفيروسية، و هي الوسيلة الوحيدة لاختبار العوامل المضادة للفيروسات جديدة لتلك الفيروسات التي ليست صالحة للزراعة في خطوط الخلايا دائم.

Protocol

1. استعدادا للثقافات الطوافة عضوي النمط

1. وشبكات طوف أول معدن كثيرا أن تعامل مع حامض الكبريتيك الكروم لإزالة أية بقايا يمكن أن تتداخل مع عملية التفاضل. شبكات معدنية غمر في كوب من الزجاج التي تحتوي على حامض الكبريتيك لمدة ساعة، ثم تشطف باستمرار بين عشية وضحاها مع ماء الصنبور. بعد ليلة وضحاها شطف، يجب أن تشطف شبكات طوف لمدة 3-5 ساعات في الماء المقطر مزدوجة.
2. لتقديم الدعم للطوافات، والانحناء ثلاث جهات لطوف عن 0.5 سم على مسافة متساوية من بعضها البعض. وينبغي بعد ذلك أن تعقم شبكات معدنية.
3. إعداد العازلة إعادة 10X بإضافة 2.2 غرام و 4.8 NaHCO3 Hepes ز. تذوب في 100 مل من هيدروكسيد الصوديوم M 0.05. تصفية تعقيم وتخزين في aliquots 5 مل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
4. إعداد DMEM 10X بدون بيكربونات الصوديوم. تصفية تعقيم وتخزين في aliquots 5 مل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
5. يعد عامل نمو البشرة الفأر: ذوب 100 ملغ من EGF و 10 ملغ من BSA كل منزوع الأيونات في 10 مل DDH ₂ 0. الجمع بين EGF وديوان الرقابة المالية وإضافة الى 80 مل من DDH منزوع الأيونات ₂ 0 لإجمالي حجم 100 مل. فلتر تعقيم، قسامة (5 مل) ومخزن في -20 درجة مئوية. لكل لتر من متوسط ​​E إضافة 5 مل من EGF ملغ / مل 1 (التركيز النهائي 5 نانوغرام / مل).

2. إعداد الهلام الكولاجين

1. مطلوب واحد جل الكولاجين لكل طوف. ينبغي أن تظل الكولاجين على الجليد لمنعه من ترسيخ. كل هلام الكولاجين يتطلب 3 مل من مزيج الكولاجين تتكون من: 2.4 مل من البرد نوع الكولاجين الجرذ الذيل الأول (تركيز النهائي 3-4 ملغ / مل)، 0.3 مل العازلة إعادة 10X، 0.3 DMEM مل 10X and1-2 X 10 ⁶ الماوس 3T3 J2 الخلايا الليفية والخلايا المغذية. عن حلول تركيز عال من الكولاجين ذيل فأر، في تمييع حامض الخليك 0،02 م لتحقيق تركيز العمل الصحيح.
2. تحديد عدد المواد الهلامية الكولاجين (الطوافات)، ستحتاج ثم حساب مزيج الرئيسي لكمية الكولاجين، reconstit 10Xالعازلة ution، DMEM 10X والخلايا الليفية J2 المطلوبة. وتشمل بما فيه الكفاية في كل مزيج رئيسية لالهلام إضافي 3-4 بسبب اللزوجة من الكولاجين.
3. لتحضير هلام الكولاجين، ويعرض للتريبسين في الخلايا الليفية J2 وتحييد مع المتوسط. الجمع بين جميع الخلايا الليفية والمكان في قارورة 50 مل مخروطي. عد الخلايا لتحديد عدد من الطوافات التي يمكن تقديمها. مرة أخرى، هناك حاجة 1-2x10 ⁶ الليفية في هلام الكولاجين، وبالتالي في الطوافة. تدور باستمرار على الخلايا على سرعة منخفضة.
4. نضح في المتوسط ​​من بيليه الليفية وresuspend في كمية مناسبة من العازلة إعادة 10X، DMEM 10X والكولاجين لعدد من الطوافات محسوب. إضافة الكولاجين الماضي لمنع الجل من ترسيخ بسرعة كبيرة جدا. مرة واحدة يتم إضافة الكولاجين، وخلط بسرعة، ولكن بلطف لمنع دخول من الفقاعات في هلام. وينبغي أن يكون جل اللون البرتقالي المحمر، مما يدل على درجة الحموضة الصحيح. إذا كان خليط جل أصفر أيضا، إضافة بضع قطرات من فلتر تعقيم 1Nهيدروكسيد الصوديوم والمزيج بلطف للحصول على اللون الصحيح.
5. أضف 3 مل من الكولاجين: إلى آبار طبق ثقافة 6 جيدا خليط الخلايا الليفية. وينبغي pipetted الخليط الكولاجين ببطء أسفل الجانب من كل بئر لتجنب توليد فقاعات. وضع لوحة في 37 درجة مئوية نسيج ثقافة حاضنة والسماح ليصلب لمدة 30 دقيقة.
6. بعد 30 دقيقة، أضف 3 مل من المتوسط ​​E مع صندوق تعديل العولمة الأوروبي إلى الجزء العلوي من هلام الكولاجين طدت والعودة إلى لوحة الحاضنة. ينبغي أن تظل المواد الهلامية في 37 درجة مئوية على الأقل يوم واحد ولكنها تستخدم في غضون أربعة أيام. النتائج المثلى تحدث بعد يومين من الحضانة.

3. إعداد الكيراتينية للتمايز

1. وينبغي أن نمت الخلايا الكيراتينية مرور الأقل إلى ما يقرب من 70٪ confluency. كل طوف يتطلب 1-2x10 ⁶ الكيراتينية. يعرض للتريبسين في القرنية وتحييد مع متوسط ​​E مع صندوق تعديل العولمة الأوروبي. عد الخلايا لتحديد عدد من الطوافات التي يمكن تقديمها. تدور أسفل الخلايا في جمعية مهندسي البترول منخفضةأد. Resuspend لبيليه في 1 مل من المتوسط ​​E مع EGF لكل ثقافة طوف محسوب.
2. نضح في المتوسط ​​من المواد الهلامية الكولاجين عن طريق إمالة لوحة (6) وبشكل جيد. أضف 2 مل من المتوسط ​​E جديدة مع صندوق تعديل العولمة الأوروبي إلى كل جيل. لكل جيل، إضافة بعناية 1 مل من الخلايا الكيراتينية معلق إلى 2 مل من المتوسط ​​E موجودة بالفعل في البئر. الماصة بلطف القرنية بالإضافة إلى 2 مل من وسائل الاعلام ومن ثم السماح سقوط قطرة من زاوية ثانية على هلام. قد تهتز أو تعكير لوحة يؤدي إلى توزيع غير متساو من الخلايا إلى جانب واحد من هلام الكولاجين. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
3. وينبغي أن تنمو هذه الخلايا إلى confluency، لتحل محل المتوسطة E يوميا. كانت الخلايا متموجة عندما يتغير المتوسطة إلى يوم واحد أصفر بعد حدوث تغيير في المتوسط. هذا عادة ما يستغرق 2-4 أيام. إذا كان المتوسط ​​لم يتغير من قبل أربعة أيام، والمضي قدما الى الخطوة التالية.

4. جعل الثقافات الطوافة

1. عازمة الجانبين استخدام ملقط معقم لوضع أساسات معدن عقيم شبكة، بانخفاض، في طبق 10 سم. نضح في المتوسط ​​من هلام الكولاجين. لتخفيف هلام من جانبي جيد، اذهب حول محيط الجل مع ملعقة معقمة باستخدام الحركة صعودا ونزولا. لإزالة هلام الكولاجين، وإمالة لوحة قليلا، ورفع عن طريق وضع تحت الملعقة. وضع الجل الكولاجين على الشبكة المعدنية من دون توليد فقاعات بين الشبكة وهلام و. يمكن وضعها في اثنين من المواد الهلامية في كل شبكة.
2. من أجل جعل واجهة الهواء السائل، إضافة المتوسطة E بدون EGF ببطء إلى أسفل طبق ذلك شبكة مجموعة كبيرة لمس وسائل الاعلام ولكن جل الكولاجين ليست كذلك. وينبغي أن وسائل الإعلام لا تأتي من خلال الفتحات الموجودة في الشبكة. إضافة المتوسطة ببطء لتجنب توليد فقاعات في إطار الشبكة، حيث سيؤدي ذلك إلى منع التمييز موحدة. احتضان والطوافات في 37 درجة مئوية وتغيير المتوسطة كل يوم الحفاظ على واجهة الهواء السائل. حصاد طوافات بعد 14 يوما.

5. ممثل النتائج

عندما روالذي كان يقوم به بروتوكول بشكل صحيح مع الكيراتينية الأولية، فإن هذا الإجراء يؤدي إلى ظهارة جيدا متباينة حيث الطبقات المختلفة من الجلد واضحة. يمكن تحقيق ذلك من خلال الفحص النسيجي بواسطة تلطيخ أقسام الثقافات لطوف هيماتوكسيلين ويوزين (H & E)، كما هو مبين في الشكل 1B. H & E تلطيخ مفيد أيضا لدراسة مورفولوجية الطوافات وتأثير الفيروسات أو المركبات المضادة للفيروسات على قدرة الخلايا لتطبق وتفرق. على سبيل المثال، وخصوصا طوافات مصنوعة من فيروس الورم الحليمي البشري خلد الكيراتينية الإنسان الأساسية (HFK-31) مقابل سمكا على عوامات مصنوعة من الطبيعي الكيراتينية القلفة البشرية (HFK)، مما يعكس زيادة في نسبة الانتشار وقدرة بروتينات فيروس الورم الحليمي البشري للحفاظ على الخلايا التفريق نشط في دورة الخلية (الشكل 1B) ^10. وهذا يؤدي إلى الإبقاء على النوى في جميع أنحاء البشرة، في حين أن الخلايا الكيراتينية العادي الخروج من دورة الخلية على التمايز، مما أدى إلى انهيارنووي مغلف. لمزيد من التمايز عن كثب فحص، ويمكن أن يؤديها المناعية لفحص علامات التمايز محددة، بما في ذلك cytokeratins، فضلا عن involucrin، وfilaggrin. يتم التعبير عن cytokeratins مختلفة في مراحل معينة من التمايز ^7. كما هو مبين في الشكل 2، لا يتم التعبير عن cytokeratin 10 (K10) في الطبقة القاعدية، ويوجد فقط في الطبقات suprabasal التي تتكون من خلايا التفريق تدريجيا. في الطوافات فيروس الورم الحليمي البشري الإيجابية، يتم تأخير التعبير عن K10 مقارنة بما كان عليه من الخلايا القرنية الطبيعية، والتي تعكس مرة أخرى من تأثير البروتينات فيروس الورم الحليمي البشري على تمييز خلية كيراتينية. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعية لدراسة الملف التعبير عن الجينات الفيروسية. هو مبين في الشكل (3) هو تلطيخ ممثل دراسة التعبير عن بروتين فيروس الورم الحليمي البشري E4 ^ E1، وهو البروتين الذي أواخر التعبير يقتصر على الطبقات العليا من البشرة. كما هو متوقع، يتم احترام أي تلطيخ في الثقافات طوف من هوما طبيعين الكيراتينية القلفة.

الشكل 1. مخطط) من طريقة لإعداد الثقافات طوف عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الأولية أو خطوط الخلايا الظهارية. B) هيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ الثقافات طوف عضوي النمط المتولدة من الخلايا الكيراتينية القلفة الإنسان الحفاظ على ثابت HPV-31 (HFK-31) episomes، أو من الطبيعي الكيراتينية القلفة البشرية (HFK). ويتم تحديد طبقات الفردية الظهارية، وكذلك سد الكولاجين.

الشكل 2، ويقتصر Cytokeratin 10 (K10) التعبير للطبقات suprabasal من الظهارة. تم تنفيذ المناعية على المقاطع العرضية للثقافات طوف عضوي النمط المتولدة من خلايا-31 HFK، فضلا عن HFKs طبيعي ان استخدام أجسام مضادة لK10. وكان counterstained الحمض النووي الخلوي مع دابي. تم القبض على الصور باستخدام أسيوطمضان المجهر ocal. تبين الأسهم الطبقة القاعدية من البشرة.

الشكل (3)، وفيروس الورم الحليمي البشري E1 ^ ينتج بروتين E4 في وقت متأخر من مرحلة مثمرة من دورة الحياة الفيروسية. تم تنفيذ المناعية على المقاطع العرضية للثقافات طوف عضوي النمط المتولدة من خلايا-31 HFK، فضلا عن HFKs العادية باستخدام الأجسام المضادة لE1E4. وكان counterstained الحمض النووي الخلوي مع دابي. تم القبض على الصور باستخدام مضان المجهري متحد البؤر. تبين الأسهم الطبقة القاعدية من البشرة.

Discussion

نحن هنا وصف طريقة التي يمكن استخدامها لدراسة التمايز الظهارية بشكل عام، ولكن يمكن أيضا أن تتكيف بسهولة لدراسة المرضية الفيروسية، فضلا عن فعالية من العلاجات المحتملة. العديد من الفيروسات تستهدف الخلايا الظهارية اما الموقع الرئيسي للعدوى، كما هو الحال بالنسبة لفيروس الورم الحليمي البشري، أو في مرحلة ما من دورة الحياة الفيروسية، كما هو الحال مع herpesviruses. على الرغم من تزايد الثقافات طوف عضوي النمط هو مضيعة للوقت، والقدرة على تلخيص بأمانة في المفاضلة المجراة الظهارية توفر وسيلة مفيدة للغاية لفحص فيروس: التفاعلات الخلية المضيفة. أن تنمو بنجاح ظهارة متباينة تماما هناك بعض الخطوات الهامة التي لا بد من الاعتراف. من أجل الحفاظ على القدرة على التمايز في الثقافات طوف، يجب على المرء أن يكون هناك عدد كاف من مغذيات الليفية في هلام الكولاجين للحفاظ على أحادي الطبقة خلية كيراتينية. ويمكن تمييز الفقراء في الثقافات طوف يكون أيضا بسبب كثافة منخفضة جدا من الخلايا الكيراتينيةعلى الكولاجين: هلام الليفية، غير لائق بناء طوف، أو الفشل في تغيير وسائل الاعلام كل يوم. معلمة واحدة إضافية التي يجب مراعاتها لضمان جودة التمايز الظهارية هو نوع من الخلايا الليفية التغذية المستعملة. لهذا الإجراء وصفها هنا، كانت تستخدم الماوس 3T3 J2 الخلايا الليفية. في حين يمكن استخدام الخلايا الليفية الأخرى، مغذيات، فمن المستحسن أن الخلايا الليفية التي تفرق بسرعة، أو يمكن أن تهاجر يحتمل أن تصل إلى سطح الجلد لا يكون used7. على الرغم من أن هذا البروتوكول يدعو إلى حصاد للطوافات بعد 14 يوما، ويمكن حصادها أطواف قبل هذه النقطة مرة، فضلا عن بعد. ومع ذلك، بعد 14 يوما سوف تصبح تدريجيا الطوافات أرق. بالإضافة إلى باجتزاء الثقافات طوف للتحليل المناعى، ويمكن أيضا أن تحصد للطوافات الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، فضلا عن إنتاج الفيروس.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010