Generering af Organotypiske Raft Cultures fra primære humane keratinocytter

Summary

En

Abstract

Udviklingen af organotypiske epitel flåder kulturer har givet forskere med en effektiv in vitro system, der nøjagtigt gengiver epitheldifferentiering. Der er mange anvendelser for dette system. For eksempel, har evnen til at vokse tre-dimensionelle organotypiske tømmerflåde kulturer af keratinocytter været en vigtig milepæl i studiet af human papillomavirus (HPV) ^1. Livscyklus HPV er tæt forbundet med differentiering af skæl-epitel ^2. Organotypiske epitel tømmerflåde kulturer, som det fremgår her gengiver hele papillomavirus livscyklus, herunder virusproduktion ^3,4,5. Desuden udviser disse flåder kulturer dysplastiske læsioner svarende til dem observeret ved in vivo-infektion med HPV. Derfor dette system kan også anvendes til at studere epitelcelletyper cancere, såvel som virkningen af ​​lægemidler på epitel celledifferentiering i almindelighed. Oprindeligt udviklet af Asselineau og Prunieras et al. ⁷ er organotypisk epitel redningsflåden dyrkningssystem modnet i et generelt relativt let kultur model, som involverer dyrkning af celler på collagen sættes holdt ved en luft-væske-grænsefladen (figur 1A). Løbet af 10-14 dage stratificere cellerne og differentierer til dannelse af en fuld tykkelse epithel, der producerer differentiering-specifikke cytokeratiner. Høstede klumper kan undersøges histologisk, såvel som ved standard molekylære og biokemiske teknikker. I denne artikel beskriver vi en fremgangsmåde til generering af flåder kulturer fra primære humane keratinocytter. Den samme teknik kan anvendes med etablerede epiteliale cellelinjer, og kan nemt tilpasses til brug med epitelvæv fra normale eller syge biopsier ^8. Mange vira målgrupper enten kutan eller slimhindeepithelet som en del af deres replikation livscyklus. I løbet af de sidste mange år er anvendelsen af ​​muligheden for organotypisk række kultninger, som en metode til at studere virus-værts-celle-interaktioner er blevet vist i adskillige herpesvira, samt adenovirus, parvovira, og poxviruser ^9. Organotypiske flåder kulturer kan således tilpasses til at behandle viral patogenese, og er de eneste midler til at teste hidtil ukendte antivirale midler for de vira, der ikke kan dyrkes i permanente cellelinier.

Protocol

1. Forberedelse til Organotypiske Raft Cultures

1. Metal flåder gitre meget først behandles med chromsyre svovlsyre for at fjerne enhver rest, som kan interferere med differentieringsprocessen. Nedsænkes metalgitre i et bægerglas indeholdende svovlsyre i en time, derefter kontinuerligt skyllet natten over med ledningsvand. Efter natten skylles, bør tømmerflåde net skal skylles i 3-5 timer i dobbelt destilleret vand.
2. At yde støtte til de flåder, bøjer tre sider af flåden omkring 0,5 cm i samme afstand fra hinanden. De metalgitre bør derefter autoklaveret.
3. Forbered 10X rekonstituering bufferen ved at tilsætte 2,2 g NaHCO3 og 4,8 g Hepes. Opløses i 100 ml 0,05 M NaOH. Filtersteriliser og opbevares i 5 ml portioner ved -20 ° C.
4. Forbered 10X DMEM uden natriumbicarbonat. Filtersteriliser og opbevares i 5 ml portioner ved -20 ° C.
5. Forberede mus epidermal vækstfaktor: Opløs 100 mg af EGF og 10 mg BSA hver i 10 ml deioniseret ddh ₂ 0. Kombiner EGF og BSA, og der tilsættes 80 ml ​​deioniseret ddh ₂ 0 til et samlet volumen på 100 ml. Filter-sterilisere, alikvot (5 ml) og gemmer i -20 ° C. For hver liter E-medium tilsættes 5 ml af 1 mg / ml EGF (slutkoncentration 5 ng / ml).

2. Fremstillinq af kollagengeler

1. En kollagengel er påkrævet for hver række. Kollagen bør holdes på is for at forhindre det i at størkne. Hver kollagengel kræver 3 ml collagen blanding bestående af: 2,4 ml kold Rat-hale collagen type I (slutkoncentration 3-4 mg / ml), 0,3 ml 10X opløsning puffer, 0,3 ml 10X DMEM og1-2 X 10 ⁶ mus 3T3 J2 fibroblaster som fødeceller. For høje koncentrationer opløsninger af rotte hale collagen, fortyndes i 0,02 M eddikesyre til at opnå det korrekte koncentration.
2. Bestem antallet af kollagengeler (redningsflåder) du har brug for og derefter beregne en master mix for mængden af ​​kollagen, 10X reconstitution puffer 10X DMEM og J2 fibroblaster påkrævet. Omfatter nok i hver stamblanding 3-4 ekstra geler på grund af viskositeten af ​​collagen.
3. Til fremstilling af kollagengelen, Trypsinisér de J2 fibroblaster og neutraliseres med medium. Kombiner alle fibroblaster og læg dem i en 50 ml konisk hætteglas. Tæl cellerne for at bestemme antallet af klumper, der kan laves. Igen er en-2x10 ⁶ fibroblaster kræves per kollagengel og dermed pr redningsflåde. Spinnes ned cellerne ved lav hastighed.
4. Aspirer mediet fra fibroblast pelleten og resuspender i den passende mængde af 10X opløsning buffer, 10X DMEM og kollagen til antallet af beregnede klumper. Tilføje collagen sidste at forhindre gelen i at størkne for hurtigt. Når collagen er tilføjet, bland hurtigt, men forsigtigt, for at forebygge indslæbning af bobler i gelen. Gelen bør være en rødlig orange farve, hvilket indikerer den korrekte pH-værdi. Hvis gelen blandingen er for gult, tilsættes et par dråber filtersteriliseres 1NNaOH og bland forsigtigt for at opnå den rigtige farve.
5. Tilsæt 3 ml collagen: fibroblast blanding til brøndene i en 6 brønds dyrkningsplade. Kollagen Blandingen bør pipetteres langsomt ned langs siden af ​​hver brønd for at undgå frembringelse bobler. Pladen anbringes i en 37 ° C vævsdyrkningsinkubator og tillade at størkne i 30 minutter.
6. Efter 30 minutter tilsættes 3 ml E-medium med EGF til toppen af ​​den størknede kollagengel og returnere pladen til inkubatoren. Gelerne bør opbevares ved 37 ° C i mindst én dag, men anvendes inden for fire dage. Optimale resultater forekommer efter to dages inkubation.

3. Forberedelse Keratinocyter til differentiering

1. Lavpassage keratinocytter bør dyrkes til 70% konfluens. Hver række kræver 1-2x10 ⁶ keratinocytter. Trypsinisér de keratinocytter og neutraliseres med E-medium med EGF. Tæl cellerne for at bestemme antallet af klumper, der kan laves. Spinnes ned cellerne ved lav spered. Pellet resuspenderes i 1 ml E-medium med EGF for hver flåde beregnet kultur.
2. Aspirer mediet fra kollagengeler ved at vippe 6 brønde. Tilsæt 2 ml frisk E-medium med EGF til hver gel. For hver gel, og der tilsættes forsigtigt 1 ml resuspenderede keratinocytter til 2 ml af E medium, der allerede er til stede i brønden. Forsigtigt pipette keratinocytter plus 2 ml af medier og lad falde dråbevist tilbage på gelen. Ryste eller rokkende pladen kan resultere i ujævn fordeling af celler til den ene side af kollagengel. Pladen anbringes i 37 ° C inkubator.
3. Cellerne skal dyrkes til konfluens og erstatte E-medium dagligt. Cellerne er sammenflydende, når mediet skifter til gul en dag efter en ændring i medium. Det tager normalt 2-4 dage. Hvis mediet ikke har ændret sig efter dag fire, skal du fortsætte til næste trin.

4. At gøre Raft Cultures

1. Brug sterile pincet til at placere en steril metal tømmerflåde nettet, bøjede sider ned, I en 10 cm skål. Aspirer mediet fra kollagengelen. At løsne gelen fra siderne af borehullet, gå rundt om omkredsen af ​​gelen med en steril spatel med en op-og nedadgående bevægelse. For at fjerne kollagengelen, vippe pladen lidt, og løft ved at placere en spatel nedenunder. Lå kollagengelen på metalgitteret uden at frembringe bobler mellem gitteret og gelen. To geler kan anbringes på hvert gitterpunkt.
2. For at gøre en luft-væske-grænsefladen, og der tilsættes E-medium uden EGF langsomt til bunden af ​​skålen, således at redningsflåden gitteret berøre medier, men kollagengelen ikke. Medierne bør ikke komme gennem hullerne i gitteret. Tilsæt mediet langsomt for at undgå at skabe bobler under nettet, da dette vil forhindre en ensartet differentiering. Inkuber flåder ved 37 ° C og ændre medium hver anden dag fastholdelse af luft-væske-grænsefladen. Høste flåder efter 14 dage.

5. Repræsentative resultater

Når tHan protokol udføres korrekt med primære keratinocytter, vil denne procedure resulterer i en veldifferentieret epitel, hvor de forskellige lag af huden er indlysende. Dette opnås ved histologisk undersøgelse ved farvning sektioner af flåder kulturer for hematoxylin og eosin (H & E), som vist i figur 1B. H & E-farvning er også nyttigt at undersøge morfologien af ​​redningsflåder og virkningen af ​​vira eller antivirale forbindelser på cellernes evne til at stratificere og differentiere. For eksempel er flåder fremstillet af HPV-immortaliserede primære humane keratinocytter (HFK-31), navnlig tykkere sammenlignet med klumper fremstillet af normale humane forhudsceller keratinocytter (HFK), hvilket afspejler en forøget hastighed af proliferation og evnen af ​​HPV-proteiner for at opretholde differentierende celler aktive i cellecyklussen (figur 1B) ^10. Dette resulterer i retention af kerner gennem epitel, mens normale keratinocytter forlade cellecyklussen efter differentiering, hvilket resulterer i en nedbrydning afkernekappen. Til i højere grad undersøge differentiering, kan immunhistokemi udføres for at undersøge specifikke differentieringsmarkører, herunder cytokeratiner samt involucrin og filaggrin. Forskellige cytokeratiner udtrykkes på bestemte stadier af differentiering ^7. Som vist i figur 2 er cytokeratin 10 (K10), der ikke udtrykkes i det basale lag, og kun findes i de suprabasale lag, der består af celler gradvist differentierende. I HPV positive flåder, er ekspressionen af ​​K10 forsinket sammenlignet med normale keratinocytter, igen afspejler indflydelse HPV-proteiner på keratinocyt-differentiering. Immunohistokemi kan også anvendes til at undersøge ekspressionen profilen af ​​virale gener. Vist i figur 3 er et repræsentativt farvning undersøge ekspressionen af ​​HPV-proteinet E1 ^ E4, som er et sent protein, hvis ekspression er begrænset til de øverste lag af epitelet. Som forventet er ingen farvning observeret i flåder kulturer fra normale humanin forhudsceller keratinocytter.

Figur 1. A) Oversigt over metode til fremstilling af organotypiske tømmerflåde kulturer fra primære keratinocytter eller epiteliale cellelinier. B) Hematoxylin-og eosinfarvning af organotypiske flåder kulturer genereret fra humane forhuds keratinocytter stabilt opretholder HPV-31 (HFK-31) episomer eller fra normale humane forhudsceller keratinocytter (HFK). De enkelte epiteliale lag identificeres, såvel som collagen proppen.

Figur 2. Cytokeratin 10 (K10) ekspression er begrænset til de suprabasale lag af epitelet. Immunohistokemi blev udført på tværsnit af organotypiske flåder kulturer genereret fra HFK-31-celler, såvel som normale HFKs anvendelse af et antistof til K10. Cellulært DNA blev modfarvet med DAPI. Billeder blev taget med confocal fluorescensmikroskopi. Pilene angiver det basale lag af epitelet.

Figur 3. HPV E1 ^ E4 protein produceres sent i den produktive fase af den virale livscyklus. Immunohistokemi blev udført på tværsnit af organotypiske flåder kulturer genereret fra HFK-31-celler, såvel som normale HFKs anvendelse af antistoffer til E1E4. Cellulært DNA blev modfarvet med DAPI. Billeder blev fanget ved hjælp af konfokal fluorescens mikroskopi. Pilene angiver det basale lag af epitelet.

Discussion

Vi beskriver her en fremgangsmåde, som kan anvendes til at studere epitheldifferentiering i almindelighed, men kan også let tilpasses til at studere viral patogenese, såvel som effekten af ​​potentielle terapeutiske midler. Mange virus målrette epitelceller enten det primære sted for infektion, som i tilfælde af HPV eller på et tidspunkt i den virale livscyklus, som med herpesvirus. Skønt stigende organotypiske flåder kulturer er tidskrævende, evnen til nøjagtigt rekapitulere in vivo epitheldifferentiering tilvejebringer en særdeles nyttig metode til at undersøge virus: værts-celle interaktioner. Til at vokse en fuldt differentieret epithel der er nogle vigtige skridt, der skal anerkendes. For at bevare evnen til at differentiere i flåder kulturer, skal man have et tilstrækkeligt antal fibroblast fødere i kollagengelen at opretholde keratinocyt monolag. Dårlig differentiering flåder kulturer kan også skyldes en for lav densitet af keratinocytterpå kollagen: fibroblast gel, forkert tømmerflåde bygning, eller undladelse af at ændre medierne hver dag. En yderligere parameter, som skal anses for at sikre kvaliteten af ​​epitheldifferentiering er den type af fibroblast anvendes føder. For den her beskrevne procedure blev muse-3T3-J2-fibroblaster anvendes. Medens andre fibroblaster kan anvendes som føderne, anbefales det, at fibroblaster, der deler sig hurtigt, eller potentielt migrere op til dermal overflade ikke used7. Selvom denne protokol kræver høst af klumper efter 14 dage, kan klumper høstes, før dette tidspunkt, og efter. Men efter 14 dage flåder vil gradvis blive tyndere. Ud over sektionering flåder kulturer til immunohistokemisk analyse, kan klumper også høstes til RNA og DNA, såvel som virusproduktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010