初代ヒトケラチノサイトからカドヘリン文化の生成

Summary

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Abstract

器官上皮いかだの文化の発展は、in vitroの系を忠実に繰り返すという上皮分化に効率的に研究を提供しています。このシステムには多くの用途があります。例えば、ケラチノサイトの三次元カドヘリンの文化を成長させる能力は、ヒトパピローマウイルス^（HPV）1の研究において重要なマイルストーンであった。 HPVのライフサイクルは、しっかりと扁平上皮の²分化にリンクされています。器官上皮いかだ培養は、ウイルス産生^3,4,5を含む全体のパピローマウイルスのライフサイクルを再現ここで示された。さらに、これらのラフト文化はHPVを用いた in vivo感染の際に観察されたものと同様の異形成病変を示す。したがって、このシステムは、上皮細胞がんと同様に、一般に上皮細胞の分化に及ぼす薬物の効果を研究するために使用することができます。もともとAsselineauとPrunierasによって開発されたらによって変更されます^。7、器官上皮いかだ培養システムは、コラーゲンに細胞の増殖を伴う一般的な、比較的容易に培養モデル、へと成長した気液界面（図1A）を維持し接続します。 10-14日の間に、細胞が層別化と差別化、分化特異的なケラチンを生成する完全な厚さの上皮を形成する。収穫ラフトと同様に標準的な分子生物学的および生化学的手法により、組織学的に調べることができます。本稿では、初代ヒトケラチノサイトからいかだ文化の生成方法を説明します。同じ手法が確立され上皮細胞株で使用でき、かつ容易に正常または病気の生検⁸から上皮組織での使用に適合させることができます。その複製のライフサイクルの一環として、多くのウイルスのターゲットのいずれかの皮膚または粘膜上皮。過去数年間、カドヘリンカルトを使用しての可能性ウイルス-宿主細胞の相互作用を研究する方法としてURESは、いくつかのヘルペスウイルスと同様に、アデノウイルス、パルボウイルス、およびポックスウイルス⁹に示されている。カドヘリンの文化は、このようにウイルスの病原性を調べるために適応し、永続的な細胞株での耕作ではありませんこれらのウイルスのための新規な抗ウイルス剤をテストする唯一の手段であることができます。

Protocol

1。カドヘリンの文化のための準備

1. 金属製のいかだグリッドは、多くの第一分化過程を妨げる可能性のある残留物を除去するためにクロム硫酸で処理することができます。一時間のために硫酸を含有するガラスビーカーに浸した金属グリッドは、その後継続的に水道水で一晩洗浄した。すすぎ一晩後、いかだグリッドは、蒸留水で3-5時間のためにリンスする必要があります。
2. ラフトのサポートを提供するために、互いに等しい距離で約0.5cmいかだの3辺を曲げる。金属グリッドはその後オートクレーブする必要があります。
3. 2.2グラム炭酸水素ナトリウムと4.8グラムのHepesを追加することによって、10X再構成バッファを準備します。 0.05 MのNaOH 100mlに溶解する。濾過滅菌し、-20℃で5ミリリットルのアリコートに格納
4. 重炭酸ナトリウムなく、10X DMEMを準備します。濾過滅菌し、-20℃で5ミリリットルのアリコートに格納
5. マウス上皮細胞増殖因子を準備します。EGF 100mgのAとBの10 mgを溶かし、10ミリリットルのSAは、それぞれのddH ₂ 0脱。 EGFおよびBSAを結合し、100ミリリットルの合計体積の脱イオンのddH ₂ 0の80ミリリットルに追加します。ろ過滅菌し、アリコート（5ml）中、-20℃に保管しE培地の各リットルに1 mg / mlのEGF（最終濃度5 ng / ml）を5 mlを加える。

2。コラーゲンゲルの調製

1. Oneコラーゲンゲルは、それぞれのいかだに必要とされています。コラーゲンは凝固を防止するために氷上で保存する必要があります。コールドラット尾コラーゲンI型（最終濃度3から4 mg / ml）を、0.3ミリリットル10X再構成バッファ、0.3ミリリットル10X DMEM AND1-2×10 ⁶マウスの2.4ミリリットル：各コラーゲンゲルは、以下から構成されるコラーゲンミックスの3ミリリットルを必要とするフィーダー細胞として3T3線維芽細胞のJ2。ラット尾コラーゲンの高濃度溶液の場合は、正しい仕事濃度を達成するために、0.02 M酢酸で希釈します。
2. あなたが必要としてコラーゲンの量のマスターミックスを計算します。コラーゲンゲルの数（ラフト）、10X reconstitを決定utionバッファ、10X DMEMとJ2線維芽細胞が必要です。コラーゲンの粘度のために3月4日余分なゲルの各マスターミックスに十分含まれています。
3. コラーゲンゲルを準備するには、J2線維芽細胞をトリプシン処理し、培地で中和する。 50 mlコニカルバイアル内のすべての線維芽細胞と場所を兼ね備えています。行うことができますラフトの数を決定するために細胞をカウントします。再び、1×10 ⁶線維芽細胞がいかだあたりしたがって、コラーゲンゲルごとに必要とされています。低速度で細胞をスピンダウンする。
4. 計算されたラフトの数の線維芽細胞ペレットを再懸濁し10X再構成バッファの適切な量で、10X DMEMとコラーゲンから培地を吸引除去する。早すぎると凝固からゲルを防ぐために、最後のコラーゲンを追加します。コラーゲンが追加されると、すぐに混ぜますが、静かにゲル化気泡の導入を防ぐことができます。ゲルは、適切なpHの示す赤みがかったオレンジ色でなければなりません。ゲル混合物があまりにも黄色である場合、フィルタ滅菌1Nの滴のカップルを追加するNaOHおよび正しい色を得るために静かに混ぜる。
5. コラーゲンの3ミリリットルを追加します。線維芽細胞の混合物を6ウェル培養皿のウェルに。コラーゲン混合物は、泡の生成を回避するために各ウェルの側をゆっくりとピペッティングする必要があります。 37℃の組織培養インキュベーター内でプレートを置き、30分間固化することができます。
6. 30分後、固化したコラーゲンゲルの上にEGFをE培地3 mlを追加し、インキュベーターにプレートを返します。ゲルは、少なくとも1日に37°Cに保持しますが、4日以内に使用する必要があります。最適な結果を得るには、インキュベーションの2日後に発生します。

3。差別化のために準備ケラチノサイト

1. 低い通路ケラチノサイトは約70％コンフルエントに成長する必要があります。それぞれのいかだには、1×10 ⁶ケラチノサイトが必要になります。ケラチノサイトをトリプシン処理およびEGFのE培地で中和する。行うことができますラフトの数を決定するために細胞をカウントします。低SPEで細胞をスピンダウンED。計算されたそれぞれのラフト文化のEGFとE培地1ml中にペレットを再懸濁します。
2. 傾斜6ウェルプレートによるコラーゲンゲルから培地を吸引除去する。各ゲルにEGFと新鮮なE培地2 mlを追加します。それぞれのゲルには、慎重にも内にすでに存在するE培地2mlに再懸濁したケラチノサイトの1ミリリットルを追加します。ゆっくりピペットケラチノサイトに加えて、メディアの2 mlを、ゲルの上に秋の滴下戻ってみましょう。プレートを振とうまたは揺動すると、コラーゲンゲルの片側への細胞の不均一な分布になることがあります。 37℃インキュベーター内でプレートを配置します。
3. 細胞は、毎日のE培地を交換し、コンフルエントに成長する必要があります。細胞がコンフルエントにあるとき培地中に変更後の黄色の一日にメディア変更します。これは、通常2-4日間かかります。培地は一日4で変更されていない場合は、次のステップに進みます。

4。ラフトの文化を作る

1. 滅菌した金属製のいかだのグリッドを配置するために滅菌ピンセットを使用して、側面が曲がっ、10cmディッシュに。コラーゲンゲルから培地を吸引除去する。井戸の両側からゲルを緩め、上下運動を用いた滅菌スパチュラを用いてゲルの周囲に移動します。コラーゲンゲルを削除するには、わずかに板を傾けて、ヘラの下に配置することによって持ち上げます。グリッドとゲルの間に気泡を発生させることなく、金属グリッド上にコラーゲンゲルを置きます。つのゲ​​ルは、各グリッドに配置することができます。
2. 気液界面を作るために、いかだのグリッドがメディアに触れているので、皿の底にゆっくりとEGFなしでE培地を追加しますが、コラーゲンゲルではありません。メディアは、グリッド内の穴を通って来るべきではありません。これは均一な分化を防ぐことができますので、グリッドの下に気泡が発生しないように徐々に培地を追加します。 37℃でラフトをインキュベートし、気液界面を維持し、一日おきに培地を変更します。 14日後にラフトを収穫。

5。代表的な結果

と、t彼プロトコルがプライマリケラチノサイトで正しく実行されている場合、この手順は、皮膚の異なる層が明白である高分化型上皮になります。これは、図1Bに示すように、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）用のいかだ文化の切片を染色して組織学的検査によって達成される。 H＆E染色では、ラフトと階層化と分化する細胞の能力にウイルスや抗ウイルス化合物の影響の形態を調べるためにも有用である。たとえば、HPV-不死化ヒト一次ケラチノサイト（HFK-31）から作られたラフトは特に厚く増殖率の増加と分化細胞をアクティブに維持するためにHPVタンパク質の能力を反映して、正常なヒト包皮角化細胞（HFK）から作られたラフトと比較されます細胞周期（図^{1B）10インチ}上皮全体に核の保持この結果、正常なケラチノサイトの破壊、その結果、分化に細胞周期を終了するのに対し、核膜。より密接に差別化を調べるために、免疫組織化学は、サイトケラチンと同様に、インボルクリン、およびフィラグリンなど、特定の分化マーカーを調べるために行うことができます。別のサイトケラチンは、分化⁷の特定の段階で表現されています。図2に示すように、サイトケラチン10（K10）は、基底層で表現されていない、とだけ徐々に分化細胞で構成される基底上の層に含まれています。 HPV陽性のラフトに、K10の発現が再びケラチノサイト分化のHPVタンパク質の影響を反映して正常なケラチノサイトのそれに比べて遅れている。免疫組織化学は、ウイルス遺伝子の発現プロファイルを調べるために使用することができます。図3に示すように、式上皮の最上位層に限定されている後半のタンパク質であるHPVタンパク質E1 ^ E4の発現を調べる代表的な染色です。予想通り、全く染色が正常フーマーからいかだ培養で観察されないnは包皮ケラチノサイト。

図主なケラチノサイトまたは上皮細胞から器官いかだ培養を調製するための方法の1）。概要。安定したHPV-31（HFK-31）エピソーム、または正常なヒト包皮角化細胞（HFK）からを維持するヒト包皮角化細胞から生成されたカドヘリン培養のB）、ヘマトキシリン​​およびエオシン染色。個々の上皮層が識別されるだけでなく、コラーゲンプラグインされています。

図2：サイトケラチン10（K10）の発現は上皮の基底層直上の層に限定されています。免疫組織化学は、HFK-31細胞と同様に、K10に対する抗体を使用して、通常のHFKsから生成されたカドヘリンの文化の断面を行った。細胞のDNAはDAPIで対比されました。画像は、confを使用してキャプチャされましたOCAL蛍光顕微鏡。矢印は上皮の基底層を示しています。

図3。HPV E1 ^ E4タンパク質が遅いウイルスのライフサイクルの生産段階で生成されます。免疫組織化学は、HFK-31細胞と同様に、E1E4に対する抗体を用いて通常のHFKsから生成されたカドヘリンの文化の断面を行った。細胞のDNAはDAPIで対比されました。画像は、共焦点蛍光顕微鏡を用いて捕獲された。矢印は上皮の基底層を示しています。

Discussion

ここでは一般的には上皮分化を研究するために使用できるメソッドを記述するだけでなく、容易にウイルスの病原性と同様に、潜在的な治療薬の有効性を研究するために適応させることができます。多くのウイルスは、ヘルペスウイルスと同様に、HPVの場合のように、またはウイルスのライフサイクルのある時点で、感染症のプライマリサイトのいずれかとして上皮細胞を標的とする。宿主細胞の相互作用：カドヘリンの文化を育てるには時間がかかるのですが、忠実に生体上皮分化に要約する能力は非常に有用なウイルスを調べるためのメソッドを提供します。確認応答が成功しなければならないいくつかの重要なステップがある完全に分化した上皮細胞を成長させる。いかだ培養で分化する能力を保持するために、1つは、ケラチノサイト単層を維持するために、コラーゲンゲル内で線維芽細胞フィーダー十分な数を持っている必要があります。いかだの文化の貧困層分化はまたケラチノサイトの密度が低すぎるのが原因である場合もありますコラーゲン上：線維芽細胞のゲル、不適切ないかだの建設、またはメディアが毎日変更に失敗した。上皮分化の品質を確保するために考慮しなければならない一つの追加パラメータが使用される線維芽細胞フィーダーのタイプです。ここで説明する手順については、マウス3T3繊維芽細胞J2を用いた。他の線維芽細胞をフィーダーとして使用することができますが、それは急速に分裂する線維芽細胞、または、潜在的に皮膚表面にできませんused7を移行することをお勧めします。このプロトコルは14日後にラフトの収穫を求めていますが、ラフトはこの時点で前と同様に、後に収穫することができます。しかし、14日後にラフトは徐々に薄くなります。免疫組織化学的分析のためのいかだの文化を切片に加えて、ラフトはまた、RNAとDNAと同様に、ウイルス産生のために採取することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010