Summary
Bir
Abstract
Organotipik epitel sal kültürlerin gelişimi vitro sistemde sadakatle özetlediği epitel farklılaşmasında etkili olan araştırmacılar sağlamıştır. Bu sistem için bir çok kullanıma vardır. Örneğin, keratinositlerin üç boyutlu organotipik sal kültürleri yetiştirme yeteneğiyle, insan papilloma virüsü (HPV) 1 çalışmalarında önemli bir kilometre taşı olmuştur. HPV yaşam döngüsü sıkıca skuamöz epitel 2 farklılaşma bağlantılıdır. Olarak Organotipik epitel sal kültürler burada virüs üretimi 3,4,5 dahil olmak üzere, tüm papillomavirus yaşam döngüsü yeniden gösterdi. Ayrıca, bu sal kültürler HPV ile in vivo enfeksiyon üzerine görülenlere benzerdir displastik lezyonlar gösterirler. Böylece bu sistem, aynı zamanda epitel hücre kanserleri, yanı sıra genel olarak epitel hücre farklılaşması üzerinde ilaçların etkisini araştırmak üzere de kullanılabilir. Başlangıçta Asselineau ve Prunieras tarafından geliştirilen
Protocol
1. Organotipik Raft Kültürler Hazırlık
- Metal sal ızgaraları kadar ilk farklılaşma sürecine müdahale olabilecek artıkları temizlemek için kromik sülfürik asit ile tedavi edilebilir. Bir saat için sülfürik asit içeren bir cam beher içinde bırakın metal ızgaralar, daha sonra sürekli musluk suyu ile bir gece durulanmalıdır. Durulama gece sonra, radye ızgaraları çift distile su içinde 3-5 saat durulanmalıdır.
- Sal destek sağlamak için, birbirinden eşit mesafede 0.5 cm radye üç tarafı bükün. Metal ızgaraları sonra otoklava edilmelidir.
- 2,2 g NaHCO3 ve 4.8 g Hepes ekleyerek 10X sulandırma tamponu hazırlayın. 0.05 M NaOH 100 ml eritin. Filtre sterilize ve -20 ° C'de 5 ml hacimde depolamak
- Sodyum bikarbonat olmadan 10X DMEM hazırlayın. Filtre sterilize ve -20 ° C'de 5 ml hacimde depolamak
- Fare epidermal büyüme faktörü hazırlayın: EGF 100 mg ve B 10 mg eritilirSA 10 ml her GKD 2 0 deiyonize. EGF ve BSA birleştirin ve 100 ml toplam hacim deiyonize GKD 2 0 80 ml ekleyin. Filtre sterilize, tablet (5 ml) ve -20 ° C'de saklayın E, orta her litre için 1 mg / ml EGF (nihai konsantrasyon 5 ng / ml), 5 ml ilave edilir.
2. Kollajen Jeller hazırlanması
- Bir kollajen jel her salı için gereklidir. Kollajen katılaşabilme önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır. Sıçan soğuk-kuyruk kolajeni tip I (nihai konsantrasyon 3-4 mg / ml), 0.3 ml 10X rekonstitüsyon tamponu, 0.3 ml DMEM 10X AND1-2 X 10 6 fare 2.4 ml: her kollajen jel oluşan kollajen karışımı 3 ml gerektirir besleyici hücreler olarak 3T3 J2 fibroblastlar. Fare kuyruk kolajeni ile yüksek konsantrasyonlu çözümler için, doğru çalışma konsantrasyonu elde etmek için 0.02 M asetik asit içinde tamamlanır.
- Eğer kolajen miktarı, 10X reconstit için bir master miks hesaplamak daha sonra ihtiyacınız olacak kollajen jel (sallar) sayısını belirlemekution tampon, 10X DMEM ve J2 fibroblastlar gereklidir. Kollajen viskozite nedeniyle 3-4 ekstra jeller için her ana karışım yeterli ekleyin.
- Kollajen jel hazırlamak için, J2 fibroblastlar trypsinize ve orta ile nötralize. 50 ml'lik konik flakon tüm fibroblastlar ve yerde birleştirin. Yapılabilir sallar numarasını belirlemek için hücreleri hesaplama. Yine, 1-2x10 6 fibroblastlar sal başına böylece kollajen jel başına gereken ve uygulanır. Düşük hızda hücreleri aşağı Spin.
- 10X rekonstitüsyon tamponu, 10X DMEM ve hesaplanan salları sayısı için kolajen uygun miktarlarda fibroblast pelet ve Pastör pipetiyle gelen ortamı aspire. Hızlı katılaşmayı gelen jel önlemek için kolajen son ekleyin. Kollajen eklendikten sonra, jel içine kabarcıklarının giriş önlemek için hızlı bir şekilde yavaşça karışımı, fakat. Jel Doğru pH göstergesi kırmızımsı portakal rengi, olmalıdır. Jel karışımı aşırı sarı ise, filtre ile sterilize 1N damla bir çift eklemeNaOH ve karışımı yavaşça doğru renk elde etmek.
- Kollajen 3 ml ekleyin: fibroblast karışımı 6 kuyu kültür yemeğin kuyulara. Kollajen karışımı kabarcıklar oluşturarak önlemek için yavaş yavaş her iyi tarafı aşağı pipetlenir edilmelidir. Bir 37 ° C doku kültürü plakası inkübatörde yerleştirin ve 30 dakika boyunca katılaşmaya izin verir.
- 30 dakika sonra, katılaştırılmış kollajen jel üst EGF E orta 3 ml ekleyin ve plaka inkübatöre geri döner. Jeller, en az bir gün boyunca 37 ° C'de tutulur, ancak dört gün içinde kullanılmalıdır. Optimal sonuçlar inkübasyon iki gün sonra ortaya çıkar.
3. Farklılaşma için hazırlık Keratinositler
- Düşük geçit keratinositler yaklaşık% 70 konfluense büyüdü edilmelidir. Her salı 1-2x10 6 keratinositler gerektirir. Keratinositler Trypsinize ve EGF ile E orta ile nötralize. Yapılabilir sallar numarasını belirlemek için hücreleri hesaplama. Düşük SPE olarak hücreleri aşağı Spined. Hesaplanan her sal kültürü için EGF ile E ortamın 1 ml pelletini.
- Eğerek 6 sıra plaka ile kollajen jel gelen orta aspire. Her jel EGF taze E orta 2 ml ekleyin. Her jel için, dikkatle de zaten mevcut E orta 2 ml süspanse keratinositlerin 1 ml ekleyin. Sonra yavaşça pipet keratinositlerin artı medyanın 2 ml ve sonbahar açılan akıllıca geri jel üzerine izin verin. Çalkalama veya plaka sallanan kollajen jel bir tarafında hücrelerinin düzensiz dağılımı ile sonuçlanabilir. 37 ° C inkübatörde plakası yerleştirin.
- Hücreler günlük E orta yerine, konfluent için yetiştirilen edilmelidir. Hücreler konfluent olduğunda, orta bir değişiklikten sonra sarı bir gün için orta değişir. Bu genellikle 2-4 gün sürer. Orta günde dört tarafından değişmedi, bir sonraki adıma geçin.
4. Radye Kültürler yapma
- Steril bir metal sal ızgara yerleştirmek için steril forseps kullanma, taraf eğildi, Bir 10 cm çanak içine. Kollajen jelden orta aspire. İyi bir taraftan jel gevşetmek için, hareketli bir yukarı ve aşağı kullanılarak steril bir spatula ile jel çevresi etrafında gider. Kollajen jel kaldırmak için hafifçe eğin plaka ve bir spatula altına koyarak kaldırın. Izgara ve jel arasındaki kabarcıklar oluşturmadan metal ızgara üzerinde kollajen jel yatırın. İki jeller her ızgara üzerine yerleştirilebilir.
- Bir hava-sıvı arayüz hale getirmek için, sal ızgara ortam dokunmadan böylece tabağın tabanına kadar yavaş EGF olmadan E orta ilave fakat kollajen jel değildir. Medya kılavuzunda deliklerden gelmemeli. Bu tip farklılaşmasını önlemek olacak şekilde, kılavuz altında kabarcıkları üretmek önlemek için yavaş yavaş ortam ekleyin. 37 ° C'de inkübe sallar ve hava-sıvı arayüzü koruyarak her geçen gün orta değiştirin. 14 gün sonra hasat sallar.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Zaman tO protokolü primer keratinositler ile düzgün bir şekilde gerçekleştirilir, bu işlem cilt katman değişik belirgindir iyi farklılaşmış epitel neden olacaktır. Bu Şekil 1B gösterildiği hematoksilen ve eozin (H & E) sal kültürler, bölümleri boyanarak histolojik inceleme ile elde edilebilir. H & E boyama sallar ve tabakalandırmak ve ayırt hücrelerinin yeteneği üzerinde virüs veya antiviral bileşiklerin etkisi morfolojisini incelemek de faydalıdır. Örneğin, HPV-ölümsüzleştirdi birincil insan keratinositleri (HFK-31) yapılan sallar özellikle kalın çoğalması oranında herhangi bir artış ve farklılaşma hücreleri aktif tutmak için HPV proteinlerin yeteneğini yansıtan, normal insan sünnet derisi keratinositleri (HFK) yapılan sallar karşılaştırıldığında hücre döngüsü içinde (Şekil 1B) 10. Epitel boyunca çekirdeklerin tutulması Bu sonuç, normal keratinositlerin bir arıza ile sonuçlanan farklılaşma üzerine hücre döngüsü çıkmak iseçekirdek zarı. Daha yakından incelemek için farklılaşma, immünhistokimya Sitokeratin yanı sıra involukrin ve filagrin gibi özel farklılaşma belirteçler, incelemek için yapılabilir. Farklı Sitokeratin farklılaşma 7 spesifik aşamaları ile ifade edilir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, sitokeratin 10 (K10) taban katmanı olarak ifade değildir ve tek aşamalı olarak ayırt hücreleri içerir suprabasal tabakalar halinde bulunur. HPV pozitif sallar olarak, K10 ifadesi tekrar keratinosit farklılaşma HPV proteinlerinin etkisini yansıtan Normal keratinositler kıyasla gecikir. İmmünohistokimya da viral genlerin ifadesi profili incelemek için kullanılabilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi ifade epitelinin üst tabaka ile sınırlıdır geç bir proteindir HPV proteini E1 ^ E4, ifade inceleyerek bir temsilcisi olan boyama. Beklenildiği gibi, herhangi bir boyama, normal huma gelen sal kültürlerinde görülmektedirSünnet derisi keratinositler n.
Şekil 1. Primer keratinositler ya epitel hücre hattından organotipik sal kültürler hazırlanması için yöntem A) içeriği. Stably HPV-31 (HFK-31) episomes veya normal insan sünnet derisi keratinositleri (HFK) den korumak, insan sünnet derisi keratinositlerinden oluşturulan organotipik sal kültür B) Hematoksilen ve eozin boyanma. Bireysel epiteliyal tabakalar yanı kollajen tıkaç olarak tespit edilir.
Şekil 2. Sitokeratin 10 (K10) ifade epitelin suprabasal katmanları ile sınırlıdır. İmmünohistokimya K10 için bir antikor kullanılarak HFK-31 hücreleri, hem de normal bir HFKs elde organotipik sal kültürlerin kesitleri üzerinde yapıldı. Hücresel DNA DAPI ile zıt edildi. Görüntüler conf kullanılarak çekilenÖcal floresan mikroskobu. Oklar epitelin bazal tabaka göstermektedir.
Şekil 3. HPV E1 ^ E4 proteini geç virüs ömrü çevrimi ile verimli bir faz olarak üretilir. İmmünohistokimya E1E4 karşı antikorlar kullanılarak HFK-31 hücreleri, hem de normal bir HFKs elde organotipik sal kültürlerin kesitleri üzerinde yapıldı. Hücresel DNA DAPI ile zıt edildi. Görüntüler konfokal floresan mikroskobu kullanarak ele geçirildi. Oklar epitelin bazal tabaka göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada genel olarak epitelyal farklılaşma incelemek için kullanılabilecek bir yöntem tarif eder, fakat, aynı zamanda kolaylıkla viral patogenezine gibi potansiyel terapötik etkinlik incelemek için adapte edilebilir. Birçok virüs herpesvirüslerinin ile olduğu gibi, HPV durumunda olduğu gibi, ya da virüs ömrü çevrimi içinde bir noktada, enfeksiyon primer olarak ya epitel hücreleri hedef. Konak hücre etkileşimleri: organotipik sal kültürler büyüyen zaman alıcı, virüsü incelemek için son derece yararlı bir yöntem sağlar sadakatle vivo epitel farklılaşmasını recapitulate yeteneği olmasına rağmen. Başarılı bir şekilde tamamen farklılaşmış epitel büyümek için kabul edilmesi gereken bazı önemli adımlar vardır. Sal kültürlerde ayırt etmek için yeteneği muhafaza etmek için, bir tek tabakalı keratinosit korumak için kollajen jel fibroblast besleyiciler yeterli sayıda olması gerekir. Sal kültürlerde kötü diferansiyasyon da keratinositlerin yoğunluğu çok düşük nedeni olabilirkollajen üzerinde: fibroblast jel, yanlış sal inşaat, veya medya günlük değiştirmek için başarısız. Epitelyal farklılaşma kalitesini sağlamak için dikkat edilmesi gereken ek bir parametre kullanılan fibroblast besleyici türüdür. Burada anlatılan işlemde, fare 3T3 J2 fibroblastlar kullanılmıştır. Diğer fibroblastlar besleyiciler olarak kullanılabilmesine rağmen, bu hızla bölme fibroblastlar olduğu önerilir, veya potansiyel used7 olmayabilir dermal yüzeyine kadar geçirmek olabilir. Bu protokol 14 gün sonra sallar hasat için çağırır rağmen, bu zaman salların noktadan önce, hem de hasat sonrası edilebilir. Ancak, 14 gün sonra sallar giderek daha ince olacak. Immünhistokimyasal analizi için sal kültürler kesit ek olarak, aynı zamanda sal RNA ve DNA gibi virüs üretimi için toplanabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar E1E4 antikor tür hediye için Sally Roberts (University of Birmingham, Birmingham UK) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (4R00CA137160-03) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM without NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 | |
| NaHC03 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Hepes | Calbiochem | 391338 | |
| Stainless Steel metal grids | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S | |
| E medium11 | |||
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354010 |
References
- Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. The British Journal of Dermatology. 111, Suppl . 27. 219-222 (1984).
- Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , Caister Academic Press. Norfolk. (2006).
- Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes. Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).
- Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF. Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).
- Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).
- Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).
- Longworth, M. S., Laimins, L. A. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia. Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).
- Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation. Science. 257, 971-973 (1992).
- Wilson, R., Laimins, L. A. Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , Humana Press Inc. Totowa. 119-119 (2006).
- zur Hausen, H. Papillomavirus infections--a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).
