Generazione di culture Raft organotipiche da cheratinociti umani primari

Summary

Un

Abstract

Lo sviluppo di culture organotipiche zattera epiteliali ha fornito ai ricercatori un efficiente sistema in vitro, che riassume fedelmente la differenziazione epiteliale. Ci sono molti usi per questo sistema. Ad esempio, la capacità di crescere colture tridimensionali zattera organotipiche di cheratinociti è un passo importante nello studio di papillomavirus umano (HPV) ^1. Il ciclo di vita di HPV è strettamente legata alla differenziazione dell'epitelio squamoso ^2. Organotipiche culture zattera epiteliali, come dimostrato qui riprodurre l'intero ciclo di vita papillomavirus, compresa la produzione di virus ^3,4,5. In aggiunta, queste culture zattera presentano lesioni displastiche simili a quelli osservati al momento in vivo con infezione da HPV. Quindi questo sistema può anche essere usato per studiare il cancro delle cellule epiteliali, nonché l'effetto dei farmaci sulla differenziazione delle cellule epiteliali in generale. Originariamente sviluppato da Asselineau e Prunieras et al. ^7, il sistema di coltura organotipica epiteliale zattera è maturato in generale, modello di coltura relativamente facile, che coinvolge la crescita di cellule su collagene tappi mantenuta al di interfaccia aria-liquido (Figura 1A). Nel corso di 10-14 giorni, le cellule stratificare e differenziare, formando un epitelio pieno spessore che produce la differenziazione-specifica citocheratine. Zattere raccolto può essere esaminato istologicamente, nonché mediante tecniche standard molecolari e biochimiche. In questo articolo, si descrive un metodo per la generazione di colture zattera da cheratinociti umani primari. La stessa tecnica può essere utilizzata con linee cellulari epiteliali, e può essere facilmente adattato per l'utilizzo con il tessuto epiteliale da biopsie normali o malati ^8. Molti virus bersaglio sia l'epitelio cutaneo o delle mucose, come parte del loro ciclo replicativo di vita. Nel corso degli ultimi anni, la possibilità di utilizzare cult zattera organotipicaURES come un metodo di studio virus-ospite interazioni cellulari è stato dimostrato per herpesvirus diverse, così come adenovirus, parvovirus, e poxvirus ^9. Culture zattera organotipiche può quindi essere adattato per esaminare patogenesi virale, e sono gli unici mezzi per testare nuovi agenti antivirali per quei virus che non sono coltivabili in linee cellulari permanenti.

Protocol

1. Preparazione Culture Raft organotipiche

1. Le griglie metalliche zattera molto prima essere trattata con acido cromico solforico per rimuovere eventuali residui che potrebbero interferire con il processo di differenziazione. Griglie metalliche immergere in un bicchiere di vetro contenente acido solforico per un'ora, quindi risciacquati in continuo per tutta la notte con acqua di rubinetto. Dopo il risciacquo durante la notte, griglie zattera devono essere risciacquati per 3-5 ore in acqua bidistillata.
2. Per fornire il supporto per le zattere, piegare tre lati della zattera circa 0,5 cm a uguale distanza l'uno dall'altro. Le griglie di metallo dovrebbe essere sterilizzati in autoclave.
3. Preparare il tampone 10X ricostituzione aggiungendo 2,2 g di NaHCO3 e 4,8 g Hepes. Sciogliere in 100 ml di 0,05 M NaOH. Filtrare sterilizzare e conservare in aliquote di 5 ml a -20 ° C.
4. Preparare il 10X DMEM senza bicarbonato di sodio. Filtrare sterilizzare e conservare in aliquote di 5 ml a -20 ° C.
5. Preparare il fattore di crescita epidermico mouse: Sciogliere 100 mg di EGF e 10 mg di BSA ciascuna in 10 ml ddh ₂ 0 deionizzata. Combinare EGF e BSA e aggiungere 80 ml ​​di acqua deionizzata ddh ₂ 0 per un volume totale di 100 ml. Filtro-sterilizzare, aliquota (5 ml) e conservare in -20 ° C. Per ogni litro di mezzo E aggiungono 5 ml di 1 mg / ml di EGF (concentrazione finale 5 ng / ml).

2. Preparazione del gel di collagene

1. Un gel di collagene è richiesto per ogni zattera. Il collagene deve essere tenuti in ghiaccio per evitare che la solidificazione. Ogni gel di collagene prevede 3 ml di miscela consistente in collagene: 2,4 ml di freddo Rat-tail collagene di tipo I (concentrazione finale di 3-4 mg / ml), 0,3 ml di tampone di ricostituzione 10X, 10X 0,3 ml DMEM e1-2 x 10 ⁶ topo J2 fibroblasti 3T3 come cellule di alimentazione. Per le soluzioni ad alta concentrazione di collagene ratto coda, diluire in 0,02 M di acido acetico per ottenere la corretta concentrazione di lavoro.
2. Determinare il numero di gel di collagene (zattere) avrete bisogno e quindi calcolare una master mix per la quantità di collagene, reconstit 10Xtampone distribuzione pesi, 10X DMEM e J2 fibroblasti richiesto. Include sufficiente in ciascun master mix per 3-4 gel extra a causa della viscosità del collagene.
3. Per preparare il gel di collagene, Tripsinizzare le J2 fibroblasti e neutralizzare con medium. Mescolare tutti i fibroblasti e metterlo in un flaconcino da 50 ml. Contare le cellule per determinare il numero delle zattere che possono essere apportate. Ancora, 1-2x10 ⁶ fibroblasti sono necessari per gel di collagene e quindi per zattera. Centrifugare le cellule a bassa velocità.
4. Aspirare il mezzo dal fibroblasti pellet e risospendere in quantità appropriata di tampone di ricostituzione 10X, 10X DMEM e collagene per il numero delle zattere calcolati. Aggiungere il collagene ultimo per evitare che il gel di solidificazione troppo rapidamente. Una volta che il collagene è aggiunto, mescolare velocemente, ma con cura per evitare l'introduzione di bolle nel gel. Il gel deve essere un colore rosso arancio, indicativo del pH corretto. Se la miscela di gel è troppo gialla, aggiungere un paio di gocce di filtro sterilizzato 1NNaOH e mescolare delicatamente per ottenere il colore corretto.
5. Aggiungere 3 ml di collagene: miscela fibroblasti nei pozzetti di una piastra da coltura da 6 pozzetti. La miscela di collagene devono essere pipettati lentamente lungo il lato di ogni bene per evitare di generare bolle. Porre la piastra a 37 ° C tessuto incubatore per colture e far solidificare per 30 minuti.
6. Dopo 30 minuti, aggiungere 3 ml di terreno E con EGF per la parte superiore del gel di collagene solidificato e riportare la piastra nell'incubatore. I gel devono essere mantenute a 37 ° C per almeno un giorno, ma entro quattro giorni. I risultati ottimali si verificano dopo due giorni di incubazione.

3. Cheratinociti Preparazione per la differenziazione

1. Cheratinociti passaggio bassi dovrebbe essere cresciuto fino a circa il 70% di confluenza. Ogni zattera richiede 1-2x10 ⁶ cheratinociti. Tripsinizzare dei cheratinociti e neutralizzare con media E con EGF. Contare le cellule per determinare il numero delle zattere che possono essere apportate. Centrifugare le cellule a bassa speed. Risospendere il pellet in 1 ml di terreno E con EGF per ogni coltura zattera calcolato.
2. Aspirare il mezzo dai gel di collagene inclinando la piastra da 6 pozzetti. Aggiungere 2 ml di terreno fresco con EGF E ad ogni gel. Per ogni gel, accuratamente aggiungere 1 ml di cheratinociti risospeso a 2 ml di terreno E già presenti nel pozzo. Pipettare delicatamente i cheratinociti più il 2 ml di media e poi lasciato cadere goccia a goccia di nuovo sul gel. Agitando o oscillare la piastra può provocare distribuzione irregolare delle cellule a un lato del gel di collagene. Collocare la piastra nel 37 ° C incubatore.
3. Le cellule devono essere coltivate a confluenza, sostituendo il mezzo E giornaliera. Le cellule sono confluenti quando le modifiche medio giallo per un giorno dopo un cambiamento in mezzo. Questo richiede di solito 2-4 giorni. Se il mezzo non è cambiato da quattro giorni, procedere al passo successivo.

4. Esecuzione delle Culture Raft

1. Utilizzare pinze sterili per inserire un sterile griglia zattera di metallo, piegato verso il basso i lati, In un piatto 10 cm. Aspirare il mezzo di gel di collagene. Per allentare il gel dalle pareti del pozzo, passare attorno al perimetro del gel con una spatola sterile utilizzando un movimento su e giù. Per rimuovere il gel di collagene, inclinare leggermente la piastra e sollevare mettendo sotto una spatola. Disporre il gel di collagene sulla griglia metallica senza generare bolle tra la griglia e il gel. Due gel può essere posizionato su ogni griglia.
2. Al fine di effettuare una interfaccia aria-liquido, aggiungere mezzo senza EGF E lentamente verso il fondo del piatto in modo che la griglia zattera sta toccando i supporti, ma il gel di collagene non è. I media non devono entrare attraverso i fori nella griglia. Aggiungere lentamente il mezzo per evitare di generare bolle sotto la griglia, in modo da evitare differenziazione uniforme. Incubare le zattere a 37 ° C e modificare il mezzo ogni altro giorno mantenendo l'interfaccia aria-liquido. Raccogliere le zattere dopo 14 giorni.

5. Risultati rappresentativi

Quando tegli protocollo viene eseguito correttamente con cheratinociti primari, questa procedura si tradurrà in un ben differenziato epitelio in cui i diversi strati della pelle sono evidenti. Questo essere ottenuto attraverso l'esame istologico di colorazione sezioni di colture zattera ematossilina ed eosina (EE), come mostrato in figura 1B. Colorazione H & E è anche utile esaminare la morfologia zattere e l'effetto di virus o composti antivirali sulla capacità delle cellule di stratificare e differenziare. Ad esempio, zattere fatte da HPV-immortalizzate cheratinociti umani primari (HFK-31) sono notevolmente più spesso rispetto alle zattere fatte dal prepuzio cheratinociti umani normali (HFK), riflettendo un aumento del tasso di proliferazione e la capacità delle proteine ​​di HPV per mantenere le cellule differenzianti attivo nel ciclo cellulare (figura 1B) ^10. Ciò si traduce in ritenzione nuclei tutta dell'epitelio, mentre cheratinociti normali uscire dal ciclo cellulare sulla differenziazione, con conseguente rottura delinvolucro nucleare. Per approfondire la differenziazione, l'immunoistochimica può essere eseguito per esaminare marcatori di differenziazione specifiche, incluse citocheratine, così come involucrina, e filaggrina. Citocheratine Diverse sono espressi in specifici momenti di differenziazione ^7. Come mostrato in figura 2, citocheratina 10 (K10) non è espressa nello strato basale, e si trova solo negli strati soprabasali che consistono di cellule progressivamente differenziazione. In zattere HPV positivi, l'espressione di K10 è ritardato rispetto a quella dei cheratinociti normali, nuovamente riflettono l'influenza di proteine ​​HPV sulla differenziazione dei cheratinociti. Immunoistochimica può anche essere usato per esaminare il profilo di espressione di geni virali. In figura 3 è una colorazione rappresentativo esaminare l'espressione della proteina HPV E1 ^ E4, che è una proteina in ritardo la cui espressione è limitata alle strati superiori dell'epitelio. Come previsto, non si colorazione osservata in colture zattera dal normale human cheratinociti prepuzio.

Figura 1. Schema A) del procedimento per la preparazione di colture di cheratinociti zattera organotipiche primarie o linee cellulari epiteliali. B) colorazione ematossilina ed eosina delle culture zattera organotipiche generati da cheratinociti del prepuzio umano mantenendo stabilmente HPV-31 (HFK-31) episomi, o da cheratinociti umani (HFK prepuzio). I singoli strati epiteliali sono identificati, nonché la spina collagene.

Figura 2. Cytokeratin 10 (K10) espressione è limitata agli strati soprabasali dell'epitelio. L'immunoistochimica è stata eseguita su sezioni di culture zattera organotipiche generati da HFK-31 cellule, nonché HFKs normali, utilizzando un anticorpo a K10. Il DNA cellulare è stato controcolorate con DAPI. Le immagini sono state catturate utilizzando confLOCALE microscopia a fluorescenza. Le frecce indicano lo strato basale dell'epitelio.

Figura 3. La proteina E1 HPV ^ E4 è prodotta ritardo nella fase produttiva del ciclo vitale del virus. L'immunoistochimica è stata eseguita su sezioni di culture zattera organotipiche generati da HFK-31 cellule, nonché HFKs normali usando anticorpi E1E4. Il DNA cellulare è stato controcolorate con DAPI. Le immagini sono state catturate utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza. Le frecce indicano lo strato basale dell'epitelio.

Discussion

Descriviamo qui un metodo che può essere usato per studiare differenziazione epiteliale in generale, ma può anche essere facilmente adattato per studiare la patogenesi virale, come pure l'efficacia della terapia potenziali. Molti virus bersaglio le cellule epiteliali sia come sito primario di infezione, come nel caso di HPV, o ad un certo punto nel ciclo vitale del virus, come con herpesvirus. Sebbene in crescita culture zattera organotipiche richiede molto tempo, la capacità di ricapitolare fedelmente in vivo differenziazione epiteliale fornisce un metodo molto utile per esaminare virus: interazioni della cellula ospite. Per crescere con successo un epitelio completamente differenziata ci sono alcuni passaggi critici che devono essere riconosciuti. Al fine di mantenere la capacità di differenziare in culture zattera, si deve avere un numero sufficiente di alimentatori fibroblasti nel gel di collagene per mantenere il monostrato cheratinociti. Scarsa differenziazione in culture zattera può anche essere dovuto a troppo bassa densità di cheratinocitisul collagene: gel fibroblasti, costruzione zattera in modo improprio o per cambiare i mezzi di comunicazione di tutti i giorni. Un ulteriore parametro che deve essere considerata per garantire la qualità di differenziazione epiteliale è il tipo di alimentatore utilizzato fibroblasti. Per la procedura descritta qui, J2 fibroblasti 3T3 di topo sono stati utilizzati. Mentre fibroblasti altri possono essere utilizzati come alimentatori, si raccomanda che i fibroblasti che si dividono rapidamente, o potrebbe potenzialmente migrare verso la superficie cutanea non essere used7. Sebbene questo protocollo richiede per la raccolta dei canotti dopo 14 giorni, zattere possono essere raccolte prima questo punto di tempo, così come dopo. Tuttavia, dopo 14 giorni le zattere progressivamente diventano più sottili. Oltre a sezionare colture zattera per l'analisi immunoistochimica, zattere può anche essere raccolte per RNA e DNA, così come la produzione di virus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010