Generering av Organotypiska Raft kulturer från Primary humana keratinocyter

Summary

En

Abstract

Utvecklingen av organotypiska epiteliala flotte kulturer har gett forskarna med ett effektivt in vitro-system som troget rekapitulerar epitelial differentiering. Det finns många användningar för detta system. Till exempel har förmågan att växa tredimensionella organotypiska flotte kulturer av keratinocyter varit en viktig milstolpe i studiet av humant papillomvirus (HPV) ^1. Livscykeln för HPV är tätt knuten till differentieringen av skivepitel ^2. Organotypiska epiteliala flotte kulturer som visas här återge hela cykeln papillomvirus liv, inklusive virusproduktion ^3,4,5. Dessutom är dessa flotte kulturer uppvisar dysplastiska lesioner liknar de som observeras vid in vivo-infektion med HPV. Följaktligen detta system kan också användas för att studera epitelcellsystem cancrar, såväl som effekten av läkemedel på epitelial celldifferentiering i allmänhet. Ursprungligen utvecklad av Asselineau och Prunieras et al. ^7, har den organotypiska epitelial flotten odlingssystem mognat till en generellt relativt lätt kultur modell, som involverar odling av celler på kollagen pluggar hölls vid en luft-vätske-gränssnittet (figur 1A). Under loppet av 10-14 dagar, cellerna skiktas och differentiera och bilda en full tjocklek epitel som producerar differentiering-specifika cytokeratiner. Skördade flottar kan undersökas histologiskt, såväl som genom standardmetoder molekylära och biokemiska tekniker. I den här artikeln beskriver vi en metod för generering av flotte kulturer från primära humana keratinocyter. Samma teknik kan användas med etablerade epitelcellinjer, och kan enkelt anpassas för användning med epitelial vävnad från normala eller sjuka biopsier ^8. Många virus mål antingen hud-eller slemhinneepitelet som en del av replikativa livscykel. Under de senaste åren, möjligheten att använda organotypisk flotte sektgärder som en metod för att studera virusvärdsystem cellinteraktioner har visats för flera herpesvirus samt adenovirus, parvovirus, poxvirus och ^9. Organotypiska flotte kulturer kan således anpassas för att undersöka viral patogenes, och är det enda sättet att testa nya antivirala medel för de virus som inte är odlingsbar i permanenta cellinjer.

Protocol

1. Förberedelse för Organotypiska Raft kulturer

1. Metall flotte gallren mycket först behandlas med kromsyra svavelsyra för att avlägsna eventuella rester som skulle kunna störa differentiering processen. Doppa metallgaller i en glasbägare innehållande svavelsyra i en timme, därefter kontinuerligt sköljdes över natten med kranvatten. Efter över natt sköljning bör flotte galler sköljas i 3-5 timmar i dubbeldestillerat vatten.
2. Att tillhandahålla stöd för de flottar, böj tre sidor av flotten ca 0,5 cm på samma avstånd från varandra. De metallgaller bör därefter autoklaveras.
3. Förbered 10X rekonstituering bufferten genom att lägga till 2,2 g NaHCO3 och 4,8 g Hepes. Lös upp i 100 ml 0,05 M NaOH. Filtersterilisera och lagra vid 5 ml alikvoter vid -20 ° C.
4. Förbered 10X DMEM utan natriumbikarbonat. Filtersterilisera och lagra vid 5 ml alikvoter vid -20 ° C.
5. Framställa mus epidermal tillväxtfaktor: Lös 100 mg av EGF och 10 mg av B-SA var i 10 ml avjoniserat ddHaO ₂ 0. Kombinera EGF och BSA och tillsätt till 80 ml ​​avjoniserat ddHaO ₂ 0 för en total volym av 100 ml. Filter-sterilisera, alikvot (5 ml) och förvara i -20 ° C. För varje liter E-medium tillsätt 5 ml av 1 mg / ml EGF (slutlig koncentration 5 ng / ml).

2. Framställning av kollagengeler

1. En kollagengel krävs för varje rad. Kollagenet bör hållas på is för att förhindra den från att stelna. Varje kollagengel kräver 3 ml kollagen blandning bestående av: 2,4 ml kall Rat-svans kollagen typ I (slutlig koncentration 3-4 mg / ml), 0,3 ml 10X rekonstitution buffert, 0,3 ml 10X DMEM och1-2 X 10 ⁶ mus 3T3 J2 i fibroblaster som matarceller. För höga koncentrationer lösningar av råttsvanskollagen, späd med 0,02 M ättiksyra för att uppnå den korrekta arbetskoncentration.
2. Bestäm antalet kollagengeler (flottar) du behöver och sedan beräkna ett huvudblandning för mängden kollagen, 10X rekonstitutionmepannor buffert 10X DMEM och J2 fibroblaster krävs. Inkludera nog i varje Master Mix i 3-4 extra geler på grund av viskositeten hos kollagen.
3. För att förbereda kollagengelen, Trypsinisera de J2 fibroblaster och neutralisera med medium. Kombinera alla fibroblaster och en plats i en 50 ml koniskt flaska. Räkna cellerna för att bestämma antalet flottar som kan göras. Återigen är 1-2x10 ⁶ fibroblaster som erfordras per kollagengel och sålunda per flotte. Centrifugera ner cellerna vid låg hastighet.
4. Aspirera mediet från fibroblast pelleten och återsuspendera i den lämpliga mängden av 10X rekonstitution buffert, 10X DMEM och kollagen för antalet beräknade flottar. Tillsätt kollagen sista att förhindra gelén från att stelna för snabbt. När väl kollagen tillsätts, blandas snabbt, men försiktigt för att förhindra införande av bubblor in i gelén. Gelén bör vara en rödorange färg, som indikerar det korrekta pH-värdet. Om gelén blandningen är för gul, tillsätt ett par droppar filtersteriliserades 1NNaOH och blanda försiktigt för att få rätt färg.
5. Tillsätt 3 ml av kollagen: fibroblast blandningen till brunnarna i en 6-brunnars odlingsskål. Kollagenet Blandningen bör pipetteras långsamt nedför sidan av varje brunn för att undvika alstring av bubblor. Placera plattan i en 37 ° C vävnadsodlingsinkubator och tillåta att stelna under 30 minuter.
6. Efter 30 minuter tillsattes 3 ml av E-medium med EGF till toppen av den stelnade kollagengel och återföra plattan till inkubatom. Gelerna bör hållas vid 37 ° C under minst en dag men används inom fyra dagar. Optimala resultat uppstår efter två dagars inkubation.

3. Förbereder Keratinocyter för differentiering

1. Låga passage keratinocyter bör odlas till cirka 70% konfluens. Varje flotte kräver 1-2x10 ⁶ keratinocyter. Trypsinisera keratinocyterna och neutralisera med E medium med EGF. Räkna cellerna för att bestämma antalet flottar som kan göras. Centrifugera ner cellerna vid låg spered. Återsuspendera pelleten i 1 ml av E-medium med EGF för varje beräknad flotten kultur.
2. Aspirera mediet från kollagengeler genom att luta 6 brunnar. Tillsätt 2 ml färskt E-medium med EGF till varje gel. För varje gel, tillsätt försiktigt 1 ml återsuspenderade keratinocyter till 2 ml av E-medium som redan är närvarande i brunnen. Försiktigt Pipettera keratinocyterna plus 2 ml av media och sedan låta falla droppvis tillbaka på gelen. Skakning eller gunga plattan kan resultera i ojämn fördelning av celler till en sida av kollagengel. Placera plattan i 37 ° C inkubator.
3. Cellerna bör odlas till konfluens, som ersätter E-medium dagligen. Cellerna är konfluenta när mediet ändras till gul en dag efter en förändring i mediet. Det tar vanligtvis 2-4 dagar. Om mediet inte har ändrats efter dag fyra, gå vidare till nästa steg.

4. Göra Raft kulturer

1. Använd sterila pincett för att placera ett sterilt galler av metall flotte, böjde sidorna ner, I en 10 cm skål. Aspirera mediet från kollagengel. För att lossa gelen från sidorna av brunnen, gå runt omkretsen av gel med en steril spatel med en upp och ner rörelse. För att ta bort kollagengelen, luta plattan något och lyft genom att placera en spatel under. Låg kollagengelen på metallen gallret utan att generera bubblor mellan gallret och gelén. Två geler kan placeras på varje galler.
2. För att göra en luft-vätske-gränssnittet, tillsätt E-medium utan EGF långsamt till botten av skålen så att flotten gallret är i kontakt mediet men kollagengelen inte är det. Medierna bör inte komma genom hålen i nätet. Lägg till mediet långsamt för att undvika att skapa bubblor under gallret, eftersom detta kommer att förhindra en enhetlig differentiering. Inkubera flottar vid 37 ° C och ändra det medium varannan dag bibehålla luft-vätske-gränssnittet. Skörda flottar efter 14 dagar.

5. Representativa resultat

När tHan protokollet utförs korrekt med primära keratinocyter, kommer detta förfarande att resultera i en väl differentierad epitel där de olika hudlagren är uppenbara. Detta uppnås genom histologisk undersökning genom färgning sektioner av flottens kulturer för hematoxylin och eosin (H & E), såsom visas i figur 1B. H & E-färgning är också användbar för att undersöka morfologin hos flottar och effekten av virus eller antivirala föreningar på förmågan hos celler att skikta och differentiera. Till exempel är flottar tillverkade av HPV immortaliserade-primära humana keratinocyter (HFK-31) synnerhet tjockare jämfört med flottar tillverkade av normala humana förhudsfibroblaster keratinocyter (HFK), vilket återspeglar en ökad hastighet av proliferation och förmågan hos HPV-proteiner för att bibehålla differentierande cellerna aktiva i cellcykeln (figur 1B) ^10. Detta resulterar i retention av kärnor genom epitelet, medan normala keratinocyter kommer ut ur cellcykeln efter differentiering, vilket resulterar i en nedbrytning avkärnhöljet. Att närmare undersöka differentiering kan immunohistokemi utföras för att undersöka särskilda differentieringsmarkörer, inklusive cytokeratiner, samt involukrin och filaggrin. Olika cytokeratiner uttrycks i vissa stadier av differentiering ^7. Såsom visas i figur 2, är cytokeratin 10 (K10) inte uttrycks i basalskiktet, och förekommer endast i de suprabasala skikten som består av celler successivt differentierande. I HPV positiva flottar, är uttrycket av K10 fördröjd jämfört med den för normala keratinocyter, återigen återspeglar inverkan av HPV-proteiner på keratinocytdifferentieringen. Immunohistokemi kan också användas för att undersöka uttrycket profilen av virala gener. Visas i figur 3 är en representativ färgning undersöka uttrycket av HPV-proteinet E1 ^ E4, vilken är en sent protein vars uttryck är begränsat till de översta skikten av epitelet. Som förväntat, ingen färgning observeras i flotte kulturer från normalt human förhudsceller keratinocyter.

Figur 1. A) Sammanfattning av metod för framställning av organotypiska flotte kulturer från primära keratinocyter eller epiteliala cellinjer. B) Hematoxylin-och eosin-färgning av organotypiska odlingar flotte genererade från human förhud keratinocyter stabilt bibehållande HPV-31 (HFK-31) episomer eller från normala humana förhudsfibroblaster keratinocyter (HFK). De individuella epiteliala skikten kan identifieras, samt kollagen pluggen.

Figur 2. Cytokeratin 10 (K10) uttryck är begränsat till de suprabasala skikten av epitelet. Immunohistokemi utfördes på tvärsnitt av organotypiska odlingar flotte genererade från HFK-31-celler, såväl som normala HFKs användning av en antikropp till K10. Cellulärt DNA motfärgades med DAPI. Bilderna tagna med confOKALA fluorescensmikroskopi. Pilarna indikerar de basala skiktet av epitel.

Bild 3. HPV E1 ^ E4 protein produceras sent i den produktiva fasen av virusets livscykel. Immunohistokemi utfördes på tvärsnitt av organotypiska odlingar flotte genererade från HFK-31-celler, såväl som normala HFKs med användning av antikroppar till E1E4. Cellulärt DNA motfärgades med DAPI. Bilderna har tagits med konfokal fluorescensmikroskopi. Pilarna indikerar de basala skiktet av epitel.

Discussion

Vi beskriver här en metod som kan användas för att studera epiteldifferentiering i allmänhet, men kan också lätt anpassas för att studera viral patogenes, såväl som effekten av potentiella läkemedel. Många virus rikta epitelceller antingen som den primära platsen för infektion, som i fallet med HPV, eller vid någon punkt i virusets livscykel, som med herpesvirus. Även om allt organotypiska flotte kulturer är tidskrävande, förmågan att troget rekapitulera in vivo epitelial differentiering ger en mycket användbar metod för att undersöka virus: värdcellens interaktioner. För att framgångsrikt odla en helt differentierad epitel finns det några viktiga steg som skall bekräftas. För att bibehålla förmågan att differentiera i flotte kulturer, måste man ha ett tillräckligt antal fibro matare i kollagengel för att bibehålla keratinocyt-monoskiktet. Dålig differentiering flotte kulturer kan också bero på alltför låg en densitet av keratinocyterpå kollagen: fibroblast gel, felaktig flotte konstruktion, eller underlåtenhet att ändra media varje dag. En ytterligare aspekt som man måste beaktas för att säkerställa kvaliteten på epiteldifferentiering är den typ av fibroblast används feeder. För det förfarande som beskrivs här, var mus 3T3 J2 fibroblaster används. Medan andra fibroblaster kan användas som matare, rekommenderas det att fibroblaster som delar sig snabbt, eller skulle kunna migrera till den dermala ytan inte used7. Även om detta protokoll kräver skörd av flottarna efter 14 dagar kan flottar skördas före denna tidpunkt, och efter. Men efter 14 dagar flottarna kommer att bli tunnare. Förutom att sektionering flotte kulturer för immunohistokemisk analys, kan flottar också skördas för RNA och DNA, såväl som virusproduktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma-Aldrich	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010