Summary
En teknik til isolering af portal fibroblaster fra rottelever er beskrevet. Lever er perfunderet og fordøjes
Abstract
Leverfibrose er defineret ved overdreven aflejring af ekstracellulær matrix af aktiverede myofibroblaster. Der er flere forløbere for hepatiske myofibroblaster, herunder hepatiske stjerneformige celler, portal fibroblaster og knoglemarv afledt fibroblaster 1. Hepatiske stjerneformige celler har været det bedste undersøgt, men portalen fibroblaster anerkendes i stigende grad som vigtige bidragsydere til myofibroblast pool, især i biliær fibrose 2. Portal fibroblaster gennemgå spredning i respons på galde epitel skade, potentielt spille en central rolle i de tidlige stadier af galde ardannelse 3-5. En metode til at isolere portal fibroblaster ville tillade in vitro-undersøgelse af dette cellepopulation og føre til større forståelse af den rolle portalen fibroblaster spille i biliær fibrose.
Portal fibroblaster er blevet isoleret under anvendelse af forskellige teknikker, herunder udvækst 6, 7 og Liver perfusion med enzymatisk fordøjelse efterfulgt af størrelsesbestemmelse selektion 8. Fordelen ved fordøjelse og størrelsesselektion teknik i forhold til udvæksten teknik er, at celler kan studeres uden nødvendigheden af passage i kultur. Her beskriver vi en modificeret version af det oprindelige teknikken beskrevet af Kruglov og Dranoff 8 til isolering af portal fibroblaster fra rottelever som resulterer i en relativt ren population af primære celler.
Protocol
Hele proceduren udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
1. Fremstillinq af enzymopløsninger
- Fremstille enzymopløsninger ifølge tabel 1 og sterilt filter med et 0,22 um filter. Holde opløsningen 1 og opløsning 2 ved stuetemperatur og opløsningen 3 ved 4 ° C indtil brug. Alle opløsninger og udstyr, der kommer i kontakt med isolerede celler, skal være steril.
2. Fremstillinq af Perfusion udstyr
- Prime perfusionssystem med HBSS minus Ca2 + / Mg2 +, som er blevet opvarmet til 37 ° C. Bemærk: For at sikre, at perfusatet er 37 ° C, når det ankommer til leveren, er HBSS opvarmes i et vandbad indstillet til 37 ° C. Efter at det passerer gennem perfusion, går gennem en med kappe glas kondensator, som er forbundet til en vandcirkulator sæt til 40 ° C (Fig. 1).
- Sterilisering af kirurgisk atoler i et bægerglas med 70% ethanol.
3. Perfusion af leveren
- Bedøve en voksne Sprague-Dawley rotte af intraperitoneal injektion af Nembutal (50-100 mg / kg legemsvægt som nødvendigt for at opnå tilstrækkelig bedøvelse).
- Placer dyret i liggende stilling på en plastbakke og fastsætte lemmer til bakken med tape.
- Rengøre maven med 70% EtOH.
- Lave et lille snit i huden på abdomen i midterlinjen. Dissekere huden væk fra fascia ved at foretage en U-formet snit på maven. Skar bugmuskel med en saks efter samme form for at blotlægge det peritoneale hulrum.
- Udsæt portal vene ved hjælp af 2 vatpinde til forsigtigt at flytte indvolde fra bughulen til højre side.
- Pass to sterile 2,0 silkesuturer under portalen vene og binde løst.
- Kanyle portvenen med en 16-18 gauge IV kateteret og fastgøre kateteret på plads ved at stramme løst tied suturer fra det foregående trin (fig. 2).
- Injicere fortyndede Heparin gennem IV kateteret (1 ml heparin 5000 USP enheder / ml fortyndet med 4 ml HBSS minus Ca2 + / Mg2 +). Leveren skal blancher.
- Forbinde IV katetret til perfusionssystem. Perfundere med HBSS minus Ca2 + / Mg2 + med en hastighed på 20 ml / min i 10 minutter. Tværsnit IVC mindre end leveren for at tillade dræning af blod og perfusat. Aspireres poolet blod fra den abdominale kavitet.
- Ændre perfusionsvæske til en 0,3% collagenaseopløsning (150 mg af type 2 collagenase i 500 ml HBSS plus Ca2 + / Mg2 +) og perfundere i 25 minutter. Hold leveren fugtige ved at dække den med den tidligere dissekerede abdominale flap. Sætte en petriskål dæksel over abdominale klappen og placere en varmelampe over området for at opretholde det intra-abdominale temperatur på omkring 37 ° C.
4. Fremstillinq af the galdetræet
- Fjerne leveren ved at løfte den ud af bughulen med en pincet og anbringes i en steril vævskulturskål fyldt med koldt Leibovitzs L-15 medie.
- Arbejde i vævskultur hætte, skrælle leverkapslen og forsigtigt drille leverparenkym hinanden med en pincet. Flyt leveren gennem flere retter fyldt med Liebovitz L-15 medier, samtidig med at drille væk parenkym, indtil endelig tilbage med det isolerede galdetræet. Den leverparenkym er gyldenbrunt, mens den resterende galdetræet er hvid.
- Anbring det isolerede galdetræet i et 50 ml Falcon-rør fyldt med 10 ml penicillin / streptomycin (10.000 IU / ml penicillin og 10.000 ug / ml streptomycin); efterlade på is i 15 minutter.
5. Isolering af Portal Fibroblast Fraktion
- Anbring det biliære træ i et sterilt 50 ml Falcon-rør og hakket med sterile sakse.
- Tilsættes en lille mængde enzym solution # 1 i røret (ca. 5 ml) og fortsæt med at hakke det biliære træ, indtil den når sammenhængen af en opslæmning.
- Hæld opslæmningen i en steril glasflaske. Skyl falk rør med den resterende opløsning # 1, og derefter hælde det ned i glasflaske. Inkuber ved 37 ° C med rystning ved 100 opm i 30 minutter.
- Filtreres opslæmningen gennem et bægerglas dækket med et enkelt lag af nylon mesh (30 mikron porestørrelse).
- Overføre væv forbliver på toppen af mesh til en steril glasflaske ved vask af indgreb med enzymopløsningen # 2. Begynder ved at hælde halv (25 ml) af opløsningen i et sterilt 15 cm petriskål. Forsigtigt fjernes mesh fra bægeret ved at holde kanterne af nettet uden at forurene det centrale område, og derefter vende mesh og dyppe det i opløsningen i petriskålen for at fjerne eventuel resterende væv på mesh. Kassér masken. Overføres opløsningen i petriskålen til en steril glasflaske. Skyl petriskålen med Remalingen 25 ml opløsning # 2 og overføre den til samme glasflaske. Inkuber ved 37 ° C med rystning ved 100 opm i 30 minutter.
- I mellemtiden tages filtratet i bægerglasset og hældes i en 50 ml Falcon-rør. Centrifuger ved 1600 rpm (460 x g) i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer medier og pellet resuspenderes i 25 ml opløsning # 3.
- Tag opløsningen fra trin 5.5 og filtreres i en anden steril bægerglas dækket med 30 mikron mesh.
- Kassér masken. Centrifugeres filtratet ved 1600 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer og resuspender pelleten i 25 ml opløsning # 3, som blev gjort i trin 5.7.
- Kombiner 2 fraktioner fra trin 5.7 og 5.9 og centrifugeres igen ved 1600 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer medier og resuspender pelleten i 10 ml portal fibroblast dyrkningsmedier (DMEM/F12 suppleret med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, 0,3% gentamycin og 0,2% fungizon).
- Tæl cellerne for levedygtighed og pladen i vævskulturskåle. Afhængigt af den ønskede anvendelse, 0,5 til 5 x 10 6 celler pr 10 cm vævskulturplade er passende. Fra en voksen Sprague-Dawley rotter, typisk vi opnå 2 til 10 millioner levedygtige celler.
- Erstatte dyrkningsmedier næste dag for at fjerne ikke-adhærerende debris. Derefter erstatter dyrkningsmedier hver 2. dag.
6. Repræsentative resultater
Primære portal fibroblaster isoleret fra voksne rotter leveren er vist ved 1, 3 og 7 dage efter isolering (fig. 3). Bemærke, at cellerne langstrakte, med morfologi karakteristisk for fibroblaster. Celler kan farves med anti-elastin-antistof (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) for at bekræfte renheden. Portal fibroblaster gennemgå myofibroblastic differentiering i kultur. Dette kan påvises ved immunfarvning for α-glat muskel-actin (α-SMA, A2547, Sigma, St. Louis, MO).
Tabel 1. Enzymopløsninger.
Figur 1. Perfusion oprettet. A. Vandcirkulator til opvarmning kolonne. B. søjle indeholdende perfusion medier. C. Stophane styring af pumpe udstrømning. D. Pumpe indstrømning. E. Variabel hastighed peristaltisk pumpe. F. Termokande med Bio-Clean rengøringsmiddel. G. varmelampe. H. Vandbad til opvarmning perfusion medier.
FiguAd 2. In situ perfusion. A. IV kateter indsat i vena, fastgjort med sutur, og forbundet til perfusionsslange via stophane. B. glaspipette forbundet til vakuum kolbe og væggen sugning for at fjerne perfusionsvæske dræning af transficerede IVC. I. tarmene. L. leveren.
Figur 3. Fasekontrast og immunofluorescens-farvning af rotte portal fibroblaster i kultur. Portalen fibroblaster dyrket i 1, 3 og 7 dage efter isolering blev fikseret og farvet for elastin, α-SMA og DAPI.
Discussion
Portal fibroblaster spiller en vigtig rolle i galde fibrose. Her beskriver vi en modifikation af den oprindelige protokol offentliggjort af Kruglov og Dranoff 8 til isolering portal fibroblaster fra rottelever, hvilket giver en enkel måde at undersøge denne cellepopulation in vitro.
Denne fremgangsmåde anvender protease-fordøjelse og størrelse baseret filtrering. Den primære fordel ved fremgangsmåden er, at en relativt ren population af celler kan opnås uden passage i kultur, således at undersøgelsen af genekspression eller funktionelle celle adfærd flere dage efter isolering. Denne teknik giver også mulighed for at isolere celler fra både raske og syge lever.
Et af de mest kritiske trin i denne protokol, er den enzymatiske nedbrydning af den hepatiske parenchym. For at sikre vellykket fordøjelse, er det vigtigt at bekræfte, at blod er fuldstændig drænet ud af leveren under den indledende perfuonen ved at sørge for, at der overhovedet er blegning af leveren. For at lette dette, er det muligt at bruge en vatpind til forsigtigt at massere leveren, mens perfusion. Over-fordøjelse af leverparenkym resulterer i et lavt udbytte af levedygtige celler, mens under-fordøjelse vil gøre det vanskeligt at adskille leverparenkym fra det biliære træ. Idet præparater med pronase har variationer i enzymatisk aktivitet mellem forskellige partier, optimering af den anvendte mængde kan være nødvendig, når der er lavt udbytte af levedygtige celler.
Denne protokol kan modificeres til isolering af portal fibroblaster fra muselever eller unge rottelever ved anvendelse af en mindre sporvidde IV kateter til kanyle portvenen, nedsætte mængden af perfusionsopløsninger i forhold til dyrets vægt og faldende leveren perfusionshastigheden til omkring 10 ml / min.
Portal fibroblaster i kultur undergår myofibroblastic differentiering i 10-14 dage, som det fremgår af α-SMA exdepression 9. Forskellige markører er blevet anvendt til at skelne portal fibroblaster fra hepatiske stjerneformige celler, herunder fibulin-2, IL-6, elastin, nucleosidtriphosphat diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 og neuronale proteiner såsom synaptophysin 2, 6, 10, 11 . Vi har fundet, at elastin er en god markør for portal fibroblaster, selv efter myofibroblastic differentiering, mens NTPDase2 tabt efter portal fibroblaster har undergået kultur efter flere dage 9. Derfor har vi typisk bekræfter isolering af portal fibroblaster ved hjælp af immunfluorescens-farvning for elastin.
Begrænsning ved denne teknik er, at umiddelbart efter portal fibroblast isolation, der er en lille brøkdel af kontaminerende celler, herunder Kupffer-celler og biliære celler. Portal fibroblaster vil vokse disse kontaminerende celler inden for 2-3 dage, men giver en relativt ren population (> 98%) 9.
SiIOU portal fibroblaster i kultur gennemgå myofibroblastic differentiering på vævsdyrkningsplast, vi typisk studere disse celler senest 7 dage efter isolation. Cellerne holdes i portal fibroblast dyrkningsmedier indeholdende 10% føtalt bovint serum, som beskrevet i metodeafsnittet. Imidlertid vil disse celler overlever i vækstmedier indeholdende 2% føtalt bovint serum i flere dage. Vi typisk bruger ikke lave serum-medier, før mindst 24 timer efter isolation. Når portal fibroblaster undergår myofibroblastic differentiering, kan de passager flere gange og opbevares som frosne lagre af myofibroblaster.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH R01 DK05823 (til RGW), F32 DK083213 (til JWW), F30 DK081265 (til ALO), og ved et tilskud fra Fred og Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (til RGW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 | |
| Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 | |
| Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 | |
| HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM | |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM | |
| Leibovitz's L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 | |
| Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |
References
- Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
- Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
- Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
- Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
- Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
- Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
- Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
- Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
- Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
- Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
- Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).
