Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøgelse tarmbetændelse i DSS-induceret Model af IBD

Published: February 1, 2012 doi: 10.3791/3678
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Farncombe Family Digestive Health Research Institute, Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University

Summary

Eksperimentelle modeller af inflammatorisk tarmsygdom har tilladt os at undersøge det komplekse medfødte og adaptive immunrespons i forbindelse med patogenese. Ved hjælp af histologiske scoring, kvantificering af pro-inflammatoriske cytokiner og myeloperoxidase aktivitet, kan man begynde at vurdere disse svar ses i inflammatorisk tarmsygdom.

Abstract

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) omfatter en række af tarm sygdomme, de mest almindelige af dem er colitis ulcerosa (UC) og Crohns sygdom (CD). Både UC og CD, når de findes i tyktarmen, generere en lignende symptom profil, der kan omfatte diarré, blødning fra endetarmen, mavesmerter og vægttab. 1 Selv om patogenesen af IBD er fortsat ukendt, er det beskrevet som en multifaktoriel sygdom, der involverer både genetiske og miljømæssige komponenter. 2

Der er mange og varierende dyremodeller af colon inflammation, der ligner flere funktioner af IBD. Dyremodeller af colitis spænder fra dem, der opstår spontant i følsomme stammer af visse arter til dem, der kræver administration af bestemte fusioner af colitis-inducerende kemikalier, som f.eks dextransulfat natrium (DSS). Kemisk-inducerede modeller af tarmen inflammation er den mest udbredte og bedst beskrives modeller af IBD. Adminidemonstration af DSS i drikkevandet producerer akut eller kronisk colitis, afhængigt af administrationen protokollen. 3 dyr, der fik DSS udviser vægttab og tegn på tynd afføring eller diarré, undertiden med tegn på blødning fra endetarmen. 4,5 Her beskriver vi de metoder, hvormed colitis udvikling og den deraf følgende inflammatoriske respons kan karakteriseres efter administration af DSS. Disse metoder omfatter histologisk analyse af hæmatoxylin / eosin farves kolon sektioner, måling af pro-inflammatoriske cytokiner, og bestemmelse af myeloperoxidase (MPO) aktivitet, som kan bruges som et surrogat markør for inflammation. 6

Omfanget af den inflammatoriske reaktion i sygdommen tilstand kan vurderes ved tilstedeværelse af kliniske symptomer eller ved ændring i histologi i slimhindevævet. Colon histologiske skader vurderes ved hjælp af et pointsystem, der betragter tab af krypt arkitektur, inflammatoriske celleinfiltration, muskel thickening, bæger celle depletion og krypt byld. 7 Kvantitativt kan niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner med akut inflammatoriske egenskaber, såsom interleukin (IL)-1β, IL-6 og tumornekrosefaktor (TNF)-α, bestemmes ved hjælp af konventionelle ELISA-metoder. Desuden kan MPO aktivitet måles ved hjælp af en kolorimetrisk analyse og bruges som et indeks af inflammation. 8

I eksperimentel colitis, er sygdommens sværhedsgrad ofte er korreleret med en stigning i MPO aktivitet og højere niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner. Colitis sværhedsgrad og betændelse-relaterede skader kan vurderes ved at undersøge afføring konsekvens og blødning, udover at vurdere den histopatologiske tilstand af tarmen ved hjælp af hæmatoxylin / eosin farves colonic vævssnit. Colon væv fragmenter kan bruges til at bestemme MPO aktivitet og cytokin produktion. Tilsammen kan disse foranstaltninger anvendes til at vurdere den intestinale inflammatorisk respons idyremodeller for eksperimentel colitis.

Protocol

1. Murine model af DSS-induceret akut colitis

  1. Tilføj dextransulfat natrium (DSS) til autoklaveret drikkevand til den ønskede slutkoncentration (1-5%) (wt / vol) (dvs. at gøre en 5% DSS løsning, tilsættes 25 mg af DSS pulver til 500 ml autoklaveret vand) . Stamopløsning kan stå ved stuetemperatur i op til en uge eller ved 4 ° C indtil brug.
  2. I et biosikkerhed hætte, hæld lager DSS opløsning i 50 ml Falcon rør (en nødvendig pr bur). Hold stamopløsning at genopfylde rør når det er nødvendigt.
  3. Udskift drikkevandet i hvert mus bur med DSS opløsning (i 50 ml Falcon rør) (Varigheden vil afhænge af DSS regime, der bruges. For eksempel ved hjælp af 6-8 uger gamle mandlige C57BL / 6 mus vi administrere en 5% DSS løsning til i alt fem dage). Mus bør ikke have adgang til nogen anden vandkilde. Kontrol mus får autoklaveres drikkevand uden DSS.
  4. Afvej mus dagligt og registrere mængden af ​​DSS forbruges per dag. Top hverflaske til 50 ml efter optagelsen DSS niveauer. Dette er for at måle den omtrentlige mængde af DSS forbruges pr bur pr musen under hele forsøget. I vores studier, bruger vi en 5% DSS løsning til 5 dage med mandlige C57BL / 6 mus. Signifikant vægttab, ændret afføring konsistens og tegn på fækal blod er set så tidligt som dag 3 ved hjælp af denne særlige DSS regime. Under DSS administration, udviser mus markant vægttab (ca. 5-10% af deres oprindelige vægt på dag 5) med vægttab på mere end 20% af den oprindelige vægt med dehydrering og diarré til at være betydelige fysiologiske indikator for, at et dyr er på eller nær endpoint. Hvis dyret får adgang til normalt vand efter de 5 dage 5% DSS, vil det komme inden for 7 dage. Alle forsøg skal godkendes af institutionens dyreetik udvalg og være i overensstemmelse med den godkendte Animal Udnyttelse Protocol (AUP).
  5. I løbet af eksperimentet, en sygdom aktivitet indeks (DAI)score kan vurderes til at vurdere den kliniske udvikling af colitis. DAI er den samlede score på vægttab i forhold til oprindelige vægt, fæces konsistens og blødning. Scores er defineret som følger: vægttab: 0 (uden tab), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%), og 4 (> 20%); afføring konsistens: 0 (normal), 2 (løs afføring), og 4 (diarré), og blødning: 0 (ingen blod), 1 (Hemoccult positiv), 2 (Hemoccult positive og synlige pellet blødning), og 4 (grov blødning, blod rundt anus). DAI kan scores dagligt i løbet af DSS behandlingen.
  6. På det tidspunkt af valg, vejer og offer mus. Mus kan aflives ved dislokation af halsen efter inhalation af isofluran eller på anden måde godkendt af institutionens dyr facilitet.

2. Saml colon vævsprøver

  1. Expose den ventrale side af dyret og våde underlivet området med en 70% ethanol opløsning. På dette tidspunkt, se tabel 1, og gør sig enNY tegn på rektal blødning (blod til stede ved den anale åbning) eller rektal prolaps i hvert enkelt dyr.
  2. Brug standard dissekere en saks til incise maven ved at lave en ventral midterlinjen snit.
  3. Find kolon og transekt tyktarmen så tæt på kolorektal margin som muligt for at frigøre den distale colon.
  4. Forsigtigt og langsomt trækkes ud hele tyktarmen, afmontere det fra de omkringliggende mesenterium.
  5. Transect tyktarmen på colonocecal margin til fri den proksimale ende af tyktarmen. Afføring kan fjernes ved at skylle kolon med steril PBS ved hjælp af en sonde nål fastgjort til en 3 eller 5 ml sprøjte eller ved forsigtigt at klemme den ud ved hjælp af et par bøjede pincet / tang. Brug af hele tyktarmen, for skader vurdere (se afsnit 3.1)
  6. Væv udtagning af prøver til histologisk analyse og andre analyser kan gøres ved at skære 0,5 cm til 1,0 cm lange colon fragmenter gøre notat af hvilket område prøven er fra (dvs. proximal, midten eller distal).
  7. Vævsprøverder skal bruges til analyser kan individuelt placeres i 1,5 ml Eppendorf rør og frosset i flydende kvælstof og opbevares indtil brug ved -70 ° C.

3. Vurdering af colitis sværhedsgrad

  1. Makroskopiske eller sygdommens sværhedsgrad score vurderes uhelbredeligt af en uvildig observatør ved hjælp af en tidligere offentliggjort pointsystem (Tabel 1). 9 Skammel konsistens kan vurderes ved hjælp af et par pincet og trykke ned på afføring til at bestemme konsistens. For at bestemme en score for blod i fæces, bemærk farven på afføring (dvs. sort afføring versus lysebrun fæces) og yderligere validere ved hjælp af en Hemoccult test. Ved hjælp af pointsystem, en score for hver af de betingelser bestemme. Det endelige makroskopiske score for hvert dyr er summen af ​​de enkelte score.
  2. At evaluere histologiske skader af colitis sværhedsgrad, klippe et lille fragment (0,5 cm) i tyktarmen, sted i et væv kassette og nedsænkes i bufferet 10% formalin løsning. Forbered 5μm paraffinindlejret tværsnit og plette sektioner med hæmatoxylin / eoxin (H & E) ved hjælp af de relevante procedurer. Colon fragmenter kan tages fra den proksimale, Mid-colon eller distale del af tyktarmen.
  3. H & E farvet colon vævssnit er scoret af en blindet observatør ved hjælp af en tidligere offentliggjort system til følgende foranstaltninger: crypt arkitektur (normal, 0 - svær krypt forvrængning med tab af hele krypter, 3), graden af ​​inflammatoriske celleinfiltration (normal, 0 - tætte inflammatoriske infiltrere, 3), muskel fortykkelse (base af krypt sidder på muscularis slimhinder, 0 - markerede muskler fortykkelse stede, 3), bæger cellereduktion (fraværende, 0 - til stede, 1) og crypt absces (fraværende, 0 - nuværende , 1). 7 Den histologiske skader score er summen af de enkelte score. Det skal bemærkes, at i modsætning til menneskets UC, krypt bylder er ikke karakteristisk for denne model og ses sjældent, mikroskopiske sår er også sjældne. Hvis flere kolon sektioner blevplettet, histologiske score mellem lignende afsnit bør anvendes til at bestemme den endelige score for hvert område (dvs. histologiske score i proksimale colon versus histologiske score i distal colon).

4. Forbered stamopløsninger af reagenser til analyser

  1. Forbered en 50 mM opløsning af kaliumfosfat buffer ved at tilsætte opløsning B (K 2 HPO 4, 8,7 g dikaliumphosphat i 1 L af dH 2 O) til opløsning A (KH 2 PO 4, 6,8 g monobasisk kalium fosfat i 1L af dH 2 O), indtil et pH på 6,0 er opnået. Resterende løsninger kan opbevares i køleskab (2-8 ° C), indtil den fremtidige brug.
  2. Forbered hexadecyltrimethylammonium bromid (HTAB) buffer ved tilsætning af 5 g HTAB i 1 L af kalium fosfat buffer (50 mM, pH = 6,0). Forsigtigt varme for at opløse og opbevares ved 2-8 ° C indtil brug. Når det er påkrævet, opvarmes til genopløses.
  3. Forbered lysisbuffer for vævs homogenisering for protein analyse vedtilsætte 10 ml 1M tris-saltsyre (pH = 8,0), 6 ml 5M natriumklorid og 2 ml Triton X-100 til 182 mL steriliseret destilleret vand. Triton X-100 er meget tyktflydende ved stuetemperatur, og derfor bør opvarmes forsigtigt før brug. De forberedte lysisbuffer kan opbevares ved -20 ° C indtil brug.

5. Prøveforberedelse for assays

  1. Prøveforberedelse for MPO analyse.
    1. Tag prøver fra -70 ° C, og anbring på is. Man noterer vægten af ​​hver prøve efter fjernelse nogen synlig afføring eller fedt ved hjælp af en bøjet forcep / pincet og læg ind i en 2 ml Eppendorf Safe-Lock mikrocentrifugerør (eller en slange, der kan bruges sammen med en homogenisator). Prøverne skal opbevares på is på alle tidspunkter. Det er vigtigt at bemærke, at lignende colon fragmenter bør anvendes fra hver biologiske replikere (dvs. distale afsnit alene eller proksimale sektioner kun).
    2. Tilføj homogenisator perle til hvert prøveglas.
    3. Tilsæt en passende mængde HTAB BUFFer ifølge væv vægt. Hvis vævet vejer mindre end 25 mg, tilføje buffer i forholdet 12.5mg/mL, hvis vævet vægten er mellem 25-50, tilføjer i forholdet 25mg/mL. Hvis vævet vægten er større end 50, skal du tilføje buffer i forholdet 50mg/ml.
    4. Homogeniseres med en serviet homogenisator for 4 minutter ved 30 Hz. Gentag, hvis vævet ikke er fuldt homogeniseret.
    5. Fjern homogenisator perle og centrifuger løsning i 6 min (13.400 xg, 4 ° C).
    6. Saml supernatanten og kassér den resulterende pellet. Supernatent kan opbevares ved -70 ° C indtil brug.
  2. Prøveforberedelse for cytokin analyse.
    1. Gentag trin 5.1.1. til 5.1.2.
    2. Tilsæt 50 μl af proteasehæmmer cocktail (PIC) til 10 mL af tilberedt lysisbuffer.
    3. Tilsæt 1 mL af PIC og lysisbuffer løsning til hver prøve, uanset vægt.
    4. Homogeniseres i 5 min ved 30 Hz. Gentag, hvis vævet ikke er fuldt homogeniseret.
    5. Fjern homogenisator perle og centrifuge solutii 5 minutter ved 3300 x g.
    6. Saml supernatanten og kassér den resulterende pellet. Supernatanten kan opbevares ved -70 ° C indtil brug.

6. Kvantificering af inflammatoriske markører

  1. MPO aktivitet assay
    1. Forbered o-Dianisidin dihydrochlorid (o-Dianisidin) løsning ved at kombinere 16,7 mg af o-Dianisidin dihydrochlorid, 90 ml dH 2 O, og 10 ml af kalium fosfat buffer. Denne løsning bør være forberedt frisk for hver analyse.
    2. Tilføj 7 μL af væv homogenatet (udarbejdet i afsnit 5.1) i tre eksemplarer til en 96-brønds plade.
    3. Tilsæt 50 μL fortyndet H 2 O 2 (4 μL af 30% H 2 O 2 fortyndet i 96 μL af dH 2 O) til o-Dianisidin blanding.
    4. Brug et multi-kanal pipette til tilsættes 200 μL af O-Dianisidin blanding, der indeholder H 2 O 2 til hver af brøndene.
    5. Mål absorbans ved 450 nm ved hjælp af en spectrophotometer. Tag tre behandlinger med 30 sekunders mellemrum.
    6. Beregn MPO aktivitet. MPO aktivitet er målt i enheder (E) af MPO / mg væv, hvor en enhed af MPO er defineret som det nødvendige beløb til at forringe 1 mmol H 2 O 2 pr minut ved stuetemperatur. I betragtning af at en enhed (U) af MPO = 1 mmol H 2 O 2 split, og at 1 mikromol af H 2 O 2 giver en ændring i absorbans på 1,13 x 10 -2 nm / min, er enheder af MPO i hver stikprøve, som fastlægges som ændring i absorbans [ΔA (T 2-T 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). For at få enheder pr mg væv, skal du bruge væv: buffer-forholdet. For eksempel, hvis et væv:, buffer-forholdet på 50 mg / ml blev brugt i 7 μL af homogenatet, er der 0,35 mg af væv. Derfor, for at få enheder pr mg væv, opdele enheder af MPO med 0,35. Et eksempel på beregning ved hjælp absorbansværdier (nm) er inkluderet nedenfor (under forudsætning af, at prøven er blevet tilføjet i tre eksemplarer):
Sample Tid 0 sek Tid 30 sek Tid 60 sek
En 1 2 3 1 ' 2 ' 3 ' 1 " 2'' 3 "
0,048 0,048 0,051 0,061 0,061 0,065 0,074 0,073 0,078
  1. Gennemsnitlig til tiden 0 sek = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 nm
  2. Gennemsnit på 30 sek = 0,0623 nm
  3. Average at Time 60 sek = 0,075 nm
  4. Ændring i absorbans (ΔA) fra 0 til 30 sek / mg væv (under antagelse af 50 mg / ml af væv: buffer ratio) = [(0,0623 til 0,049) / (1,13 x 10 -2)] / 0,35 = 3,363
  5. Ændring i absorbererning (ΔA) fra 30 til 60 sek / mg væv = 3,211
  6. * MPO aktivitet (U / mg væv) = gennemsnit af ΔA (0-30) og ΔA (30-60) = 3,287
  1. Kvantificering af pro-inflammatoriske cytokiner ved ELISA
    1. Cytokin (IL-1β, IL-6 og TNF-α) niveauer bestemmes ved hjælp af kommercielt tilgængelige enzymmaerket assay (ELISA) kit (Quantikine murine, R & D Systems).
    2. Absorbansværdier fra hver ELISA er normaliseret ved hjælp af en Bradford protein assay respektive til hver prøve og udtrykkes i enheder af pg / mg protein.

7. Repræsentative resultater

Administration af den relevante DSS regime vil medføre akut colitis hos mus. Under varigheden af ​​DSS behandling, kan DAI anvendes til at vurdere og evaluere klinisk progression af sygdommen. Dyr behandlet med DSS vil vise signifikant vægttab i forhold til deres oprindelige vægte, løs afføring og fækalblødning (Figur 1). Efter offer og undersøgelse af tyktarmen, er alvorligheden af colitis makroskopisk scorede baseret på afkortning af colon længde, colon blødning, fækal blødning, løsning af fæces konsistens, og tegn på rektal blødning i forhold til kontrolgruppen behandlet med almindeligt postevand (figur 2 og tabel 1). Tværsnit af colon vævsprøver farves med H & E vil have højere histologiske scoringer for DSS-behandlede koloner versus vand behandlet med kontrol (Figur 3). For yderligere at karakterisere omfanget af betændelse i DSS-behandlede mus, kan MPO aktivitet vurderes ud fra homogeniseres colonic vævsprøver. DSS-behandlet koloner vil have højere MPO aktivitet i forhold til kontrolgruppen (Figur 4). Desuden er dette forbundet med øgede niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Figur 5).

Figur 1.
Figur 1. Mand blev C57BL / 6 mus, der fik 5% DSS i drikkevandet i 5 dage. DAI scoringer blev vurderet dagligt for hvert dyr, og de blev i gennemsnit per dag for hver gruppe (gennemsnit ± SEM, n = 4 mus / gruppe).

Figur 2.
Figur 2. C57BL / 6 mus blev givet 5% DSS i drikkevandet i 5 dage. Kontrol mus fik vand uden DSS. Makroskopisk skader score / sygdommens alvorlighed scoringer var blindt vurderet på dag 5 efter DSS-induceret colitis. Kolon isoleret fra mus, der fik DSS har højere makroskopiske skade scores (rektal blødning, rektal prolaps, diarré, colon blødning), der angiver større sygdommens sværhedsgrad (gennemsnit ± SEM, n = 4 mus / gruppe).

Figur 3
Figur 3. C57BL / 6 mus blev givet 5% DSS opløsning i drikkevand med henblik på at fremkalde colitis. Kontrol mus modtages vand uden DSS. (A) Histologisk scoringer var blindt scoret med H & E farvet colon vævssnit indsamlet på dag 5 post-DSS administration. (B) DSS-behandlede prøver vise mere histologiske skader (mere celleinfiltration, mere bæger cellereduktion, større forvrængning / skade på krypt arkitektur) sammenlignet med (C) kontrol (gennemsnit ± SEM, n = 4 mus / gruppe). I (B) og (C), stjerne (*) angiver område af pokalen celle depletion og forvrængning af krypt arkitektur, antal tegn (#) angiver celleinfiltration.

Figur 4.
Figur 4. Alle mus blev aflivet på dag 5 efter administration af DSS og colon vævsprøver blev indsamlet for at vurdere MPO aktivitet. Sværhedsgraden af ​​DSS induceret colitis er forbundet med højere niveauer af MPO aktivitet i forhold til kontrolgruppen (gennemsnit ± SEM, n = 4 mus / gruppe).

_upload/3678/3678fig5.jpg "/>
Figur 5. Ud over højere MPO niveauer, alvorligheden af DSS-induceret colitis er også forbundet med en øget grad af pro-inflammation cytokiner såsom IL-1β, IL-6, TNF-α (gennemsnit ± SEM, n = 4 mus / gruppe).

Tabel 1. Makroskopisk / Sygdom Severity Score

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DSS colitis er en meget anvendt kemisk induceret model af tarmbetændelse. I denne model er mus, der fik drikkevand suppleret med DSS, som menes at være giftige for tarm epitel celler og forstyrre integritet mucosal barriere. 10 Administration af DSS inducerer et akut colitis, der er karakteriseret ved løs afføring, fækal blødning, og infiltration med granulocytter. 10 Under DSS administration er colitis normalt forbundet med signifikant vægttab og tilstedeværelse af blod i afføringen, hvilket kan vurderes af en fækal okkult blodprøve. 5.10,11 Efter indsamling af colon vævsprøver, kan colitis sværhedsgraden være kendetegnet ved makroskopisk undersøgelse af tyktarmen og histologisk analyse af H & E farvet colon tværsnit ved hjælp af tidligere fastsatte pointsystemer. 9

Når der efter denne protokol, er det vigtigt at bemærke, at sværhedsgraden af ​​colitis forårsaget afDSS er art og stamme specifik. 12 Desuden kan forskelle i tarmens mikroflora mellem forskellige dyrefaciliteter og boliger værelser ændre udfaldet af DSS administration. 13,14 Derfor kan indledende undersøgelser ved hjælp af DSS være forpligtet til at optimere dosering og varighed af DSS behandling. Undladelse af at optimere disse variabler kan resultere i en høj forekomst af dødsfald eller lidt at ingen colitis. Når optimeret, kan denne model bruges som en meget reproducerbar model af colitis med en lav dødelighed. Derudover er det vigtigt at bruge DSS af den angivne molekylevægt (Se tabel af reagenser). Andre former for DSS salt reagens må ikke producere tyktarmsbetændelse eller kan føre til høje forekomst af dødsfald.

Induktion af colitis at bruge denne model resulterer i alvorlige makroskopiske og histologiske skader, der er forbundet med øget MPO aktivitet samt højere niveauer af pro-inflammatoriske cytokin produktion. Agranulocytes, såsom lymfocytter end monocytter, er vigtige kilder til pro-inflammatoriske cytokiner, mens MPO er et enzym, der er indeholdt i granulocytter, såsom neutrofile (og i mindre omfang monocytter og makrofager). Denne protokol kan også bruges til at måle MPO aktivitet i colon vævsprøver behandles med dinitrobenzen sulfonsyre (DNBS) -. Induceret colitis 15 DNBS-induceret colitis er et velkarakteriseret T-celle-medierede transmural betændelse i tyktarmen, der administreres af intrarectal instillation af DNBS stoffet i ethanol. 16 Ethanol bruges til at nedbryde slimhinden barriere, der giver mulighed for DNBS at haptenize til autolog eller mikrobiota proteiner stimulere en vært immunrespons på hapten-modificerede selv-antigener. 16 En fordel ved denne model over DSS-inducerede model er, at fremkalde agenten er kendt. Den mekanisme, hvormed DSS indviede colitis, dog stadig at blive fastlagt. Interessant nok har undersøgelser vist, at DSS administration forårsager colitis i naturlige dræberceller celle-mangel, og T-og B-celle mangelfuld mus, tyder på, at disse celler (i forbindelse med adaptive immunsystem) ikke kan være kritisk i induktion af colitis og dermed kan denne model være egnet til at studere rolle i det medfødte immunsystem i den generation af colitis. 4,17

For den mest nøjagtige måling af MPO aktivitet, har vi fundet, at uanset hvilket colitis model anvendes, bør MPO niveauer bestemmes inden for den første uge af væv samling som MPO aktivitet tendens til at falde over tid. MPO aktivitet kan bruges som et surrogat markør for inflammation. Men kvantificering af væv cytokiner og histologiske scoring er en integreret del at lette fuldstændig vurdering af inflammatoriske respons i løbet af colitis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af tilskud fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR) og Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC).

Materials

Score Rektal blødning Rektal prolaps Skammel Overensstemmelse Blood
0 Ingen Ingen Normal Normal
1 Rød Tegn på prolaps Soft Rød
2 Mørke Rød Klar prolaps Meget blød Mørkerød
3 Gross Blødning Omfattende prolaps Diarré Sort
Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) Eppendorf 0030 120.094
Biotek EL808 Absorbance plate reader BioTek EL808
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) MP Biomedicals 160110
Gen5 (software) BioTek Version 1.10.8
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water Sigma-Aldrich 216763 Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom Sarstedt Ltd 82.1581 For single use only
o-Dianisidine Sigma-Aldrich D-3252 Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic Caledon 6620-1
Potassium phosphate, monobasic EMD Millipore PX1565-1
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Store at -20°C
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II Qiagen 69997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sands, B. E. From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation. Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).
  2. Danese, S., Fiocchi, C. Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases. World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).
  3. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
  4. Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).
  5. Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency. Digestion. 62, 240-248 (2000).
  6. Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).
  7. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).
  8. Smith, J. W., Castro, G. A. Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation. Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).
  9. Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model. Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).
  10. Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).
  11. Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).
  12. Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).
  13. Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).
  14. Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice. Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).
  15. Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis. Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).
  16. Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance. J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).
  17. Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).

Tags

Medicin inflammation myeloperoxidase (MPO) akut colon skader granulocyt kolon dextransulfat natrium (DSS) neutrofil
Undersøgelse tarmbetændelse i DSS-induceret Model af IBD
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha,… More

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter