Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

חקירת דלקת מעיים במודל DSS-Induced של IBD

doi: 10.3791/3678 Published: February 1, 2012

Summary

דגמים ניסיוניים של מחלות מעי דלקתיות אפשרו לנו לבחון את התגובות מורכב החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות הקשורים בפתוגנזה. באמצעות הניקוד היסטולוגית, כימות של תומכי ציטוקינים דלקתיים ופעילות myeloperoxidase, אפשר להתחיל להעריך את התגובות הללו לראות מחלות מעי דלקתיות.

Abstract

מחלות מעי דלקתיות (IBD) כוללת מגוון של מחלות מעיים, הנפוצה ביותר מהם קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD). שני UC ו-CD, כאשר קיימת במעי הגס, ליצור פרופיל סימפטום דומה אשר יכול לכלול, שלשולים דימום רקטלי, כאבי בטן, וירידה במשקל. 1 למרות בפתוגנזה של IBD נותר עלום, הוא תיאר כמחלה multifactorial המערבת שני מרכיבים גנטיים וסביבתיים. 2

ישנם מודלים של בעלי חיים רבים משתנה של דלקת המעי הגס הדומות מספר תכונות של IBD. מודלים של מגוון בעלי חיים קוליטיס מאלה הנובעות באופן ספונטני זנים רגישים של מינים מסוימים הממשל הנזקקים של ריכוזים ספציפיים של קוליטיס וישכנע כימיקלים, כגון נתרן סולפט dextran (DSS). כימית-Induced מודלים של דלקת במעיים הם הדגמים הנפוצים ביותר ואת הדרך הטובה ביותר לתאר של IBD. Adminiהקהילתיים, החברתיים של DSS במי שתייה מייצרת קוליטיס אקוטית או כרונית, תלוי בפרוטוקול הממשל. 3 חיות נתון התערוכה DSS במשקל וסימני שרפרף רופף או שלשולים, לפעמים עם עדות דימום רקטלי. 4,5 כאן, אנו מתארים את השיטות שבהן התפתחות קוליטיס ואת התגובה הדלקתית וכתוצאה מכך ניתן לאפיין הממשל הבא של DSS. שיטות אלה כוללות ניתוח היסטולוגית של hematoxylin / eosin סעיפים במעי הגס מוכתם, מדידה של תומכי ציטוקינים דלקתיים, והנחישות של myeloperoxidase (MPO) פעילות, אשר יכול לשמש כסמן פונדקאית של דלקת. 6

היקף התגובה הדלקתית במצב המחלה ניתן להעריך על ידי נוכחות של סימפטומים קליניים או על ידי שינוי ב היסטולוגיה ברקמה הרירית. הנזק מוערך היסטולוגית הגס באמצעות שיטת הניקוד הרואה הפסד של האדריכלות הקריפטה, חדירה לתא דלקתיות, שריר לאhickening, תא דלדול הגביע, וגם בקריפטה מורסה. 7 כמותית, רמות ציטוקינים דלקתיים הפרו עם מאפיינים דלקת חריפה, כגון אינטרלוקין (IL)-1β, IL-6 ו נמק הגידול גורם (TNF)-α, ניתן לקבוע באמצעות שיטות קונבנציונליות ELISA. בנוסף, פעילות MPO ניתן למדוד באמצעות assay colorimetric ומשמש כמדד של דלקת. 8

ב קוליטיס ניסיוני, חומרת המחלה קשורה לעיתים קרובות עם גידול בפעילות MPO ורמות גבוהות יותר של תומכי ציטוקינים דלקתיים. חומרת קוליטיס ודלקת הקשורים הנזק ניתן להעריך על ידי בחינת עקביות צואה ודימום, בנוסף להערכת מצב histopathological של המעי באמצעות hematoxylin / eosin סעיפים מוכתם רקמת המעי הגס. שברי רקמת המעי הגס יכול לשמש כדי לקבוע פעילות MPO ייצור ציטוקינים. יחדיו, אמצעים אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את התגובה הדלקתית של המעימודלים בבעלי חיים של קוליטיס ניסיוני.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. מודל Murine של קוליטיס DSS-Induced חריפה

  1. הוסף dextran נתרן סולפט (DSS) למי שתייה autoclaved לריכוז הסופי הרצוי (1-5%) (wt / כרך א) (כלומר כדי להפוך את פתרון DSS 5%, להוסיף 25 מ"ג של אבקת DSS 500 מ"ל מים autoclaved) . פתרון במלאי ניתן להשאיר בטמפרטורת החדר עד שבוע או 4 ° C עד השימוש.
  2. במנדף biosafety, לשפוך DSS פתרון המניות לתוך 50 מ"ל פלקון צינורות (אחד לכל צורך בכלוב). שמור את הפתרון המניות צינורות מילוי בעת הצורך.
  3. החלף מי שתייה בכלוב אחד עם העכבר הפתרון DSS (ב 50 מ"ל פלקון צינורות) (משך הזמן תלוי במשטר DSS המשמש. לדוגמה, באמצעות 6-8 C57BL בן שבוע זכר / 6 עכברים, אנו לנהל DSS פתרון 5% עבור סכום כולל של חמישה ימים). עכברים לא צריכה להיות גישה לכל מקור מים אחר. עכברים בקרת מקבלים מי שתייה autoclaved ללא DSS.
  4. לשקול עכברים יומי ולהקליט את כמות DSS צרכו ליום. למעלה כלהבקבוק 50 מ"ל לאחר ההקלטה רמות DSS. זה כדי למדוד את נפח המשוער של DSS נצרך לכל כלוב לכל עכבר לכל אורך הניסוי. במחקרים שלנו, אנו משתמשים בפתרון DSS 5% במשך 5 ימים עם C57BL זכר / 6 עכברים. ירידה משמעותית במשקל, עקביות שרפרף שינו סימנים של דם בצואה נתפסים כבר ביום 3 באמצעות משטר DSS בפרט. במהלך ממשל DSS, עכברים התערוכה ירידה במשקל בולטת (סביב 5-10% מהמשקל ההתחלתי שלהם ביום 5) עם ירידה במשקל יותר מאשר 20% מהמשקל ההתחלתי עם התייבשות שלשול להיות אינדיקטור פיזיולוגיים משמעותיים בבעלי חיים נמצא או ליד נקודת הסיום. אם החיה ניתנת גישה למים נורמלי אחרי 5 ימים של DSS 5%, זה יתאושש בתוך 7 ימים. ניסויים כל צריך להיות מאושר על ידי בעלי חיים אתיקה של מוסד הוועדה להיות בהתאם לפרוטוקול שאושר ניצול בעלי חיים (AUP).
  5. במהלך תקופת הניסוי, מדד פעילות המחלה (דאי)הניקוד ניתן להעריך על מנת להעריך את התקדמות קלינית של קוליטיס. דאי הוא הציון המשולב של ירידה במשקל לעומת המשקל ההתחלתי, עקביות שרפרף, ודימום. עשרות מוגדרים כדלקמן: ירידה במשקל: 0 (ללא הפסד), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%) ו 4 (> 20%); עקביות צואה: 0 (נורמלי), 2 (שרפרף רופף), ו 4 (שלשול); ודימום: 0 (ללא דם), 1 (Hemoccult חיובי), 2 (Hemoccult חיובית חזותי דימום גלולה), ו 4 (ברוטו דימום, דם מסביב פי הטבעת). דאי יכול להיות קלע יום במהלך תקופת הטיפול DSS.
  6. בנקודת הזמן של בחירה, לשקול והקרבה עכברים. עכברים יכולים להיות מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם בעקבות שאיפה של שיטה אחרת isoflurane או אושר על ידי בעלי חיים במתקן של המוסד.

2. איסוף דגימות רקמות המעי הגס

  1. לחשוף את הצד הגחוני של החיה ורטוב באזור הבטן עם פתרון אתנול 70%. בשלב זה, עיין טבלה 1 ולעשות לבny סימנים של דימום רקטלי (בהווה דם פתח פי הטבעת) או צניחה רקטלית של כל חיה.
  2. השתמש במספריים לנתח רגיל לחתוך את הבטן על ידי ביצוע חתך קו האמצע הגחון.
  3. אתר את המעי הגס transect המעי הגס קרוב לשוליים הגס ככל האפשר כדי לשחרר את המעי הדיסטלי.
  4. לאט ובזהירות להוציא את המעי הגס כולו, לנתק אותו מן mesentery שמסביב.
  5. Transect המעי הגס בשוליים colonocecal לשחרר את הקצה הפרוקסימלי של המעי הגס. צואה ניתן להסיר על ידי שטיפת המעי הגס עם PBS סטרילי באמצעות מחט gavage מצורף מזרק 3 או 5 מ"ל או בזהירות לסחוט אותו החוצה בעזרת פינצטה / מלקחיים כפופות. שימוש המעי הגס כולו, להעריך את הנזק (ראה סעיף 3.1)
  6. דגימת רקמה לבדיקה היסטולוגית מבחני אחרות ניתן לעשות זאת על ידי חיתוך 0.5 ס"מ עד 1.0 ס"מ שברי הגס ארוך שהופך לב באיזה אזור המדגם הוא מ (כלומר הפרוקסימלי, האמצעי או הדיסטלית).
  7. דגימות רקמותלשמש מבחני ניתן להציב בנפרד 1.5 צינורות מ"ל Eppendorf קפואים בחנקן נוזלי ומאוחסנים עד לשימוש ב -70 ° C.

3. הערכת חומרת קוליטיס

  1. ציון חומרת מקרוסקופית או מחלה סופנית נבחנת על ידי משקיף בלתי משוחד באמצעות מערכת ניקוד שפורסם בעבר (טבלה 1). 9 עקביות צואה ניתן להעריך באמצעות זוג מלקחיים ולחיצה על הצואה כדי לקבוע עקביות. כדי לקבוע ציון דם בצואה, לציין את צבע הצואה (שרפרף כלומר שחור מול שרפרף חום בהיר) ו נוספת לאמת באמצעות בדיקת Hemoccult. שימוש במערכת ניקוד, לקבוע ציון לכל אחד התנאים. הציון הסופי מאקרוסקופיים כל חיה הוא סכום ניקוד בנפרד.
  2. כדי להעריך את חומרת הנזק היסטולוגית קוליטיס, לחתוך קטע קטן (0.5 ס"מ) של המעי הגס, מקום קלטת רקמות לצלול בפתרון שנאגרו פורמלין 10%. הכן 5פרפין מיקרומטר מוטבע חתכים וחתכים עם כתם hematoxylin / eoxin (H & E) באמצעות נהלים מתאימים. שברי קולון ניתן לקחת מן המעי הגס אמצע הפרוקסימלי, או סעיף דיסטלי של המעי הגס.
  3. H & E חלקים מוכתם רקמת המעי הגס הם הבקיע ידי משקיף סינוור באמצעות מערכת שפורסמו בעבר עבור מהאמצעים הבאים: ארכיטקטורה בקריפטה (רגיל, 0 - חמור עיוות הקריפטה עם הפסד של מאורות כולו, 3), מידת חדירת תאים דלקתיים (רגיל, 0 - דלקת צפופה לחדור, 3), התעבות שריר (בסיס של הקריפטה יושב על mucosae muscularis, 0 - נוכח המסומנים עיבוי שריר, 3), תא הגביע דלדול (נעדר, 0 - בהווה, 1) ו מורסה בקריפטה (נעדר, 0 - היום , 1). 7 הציון נזק היסטולוגית הוא סכום ניקוד בנפרד. יצוין כי בניגוד האדם UC, מורסות הקריפטה לא מאפיין של הדגם הזה הם רק לעתים רחוקות; כיבים מיקרוסקופיים גם הם נדירים. אם היו מרובות סעיפים במעי הגסמוכתם, עשרות היסטולוגית בין חלקים דומים יש להשתמש כדי לקבוע את התוצאה הסופית עבור כל אזור (כלומר ציון היסטולוגית במעי הגס הפרוקסימלי לעומת ציון היסטולוגית במעי הגס הדיסטלי).

4. הכינו מלאי של פתרונות ריאגנטים עבור מבחני

  1. הכן פתרון 50 מ"מ של חיץ פוספט אשלגן ידי הוספת פתרון B (K 2 HPO 4, 8.7 גרם של אשלגן זרחתי dibasic ב L 1 של DH 2 O) לפתרון (KH 2 PO 4, 6.8 גרם של אשלגן זרחתי monobasic 1 ליטר של DH 2 O) עד pH של 6.0 מושגת. פתרונות נותרת ניתן לאחסן במקרר (2-8 מעלות) עד לשימוש עתידי.
  2. הכן ברומיד hexadecyltrimethylammonium (HTAB) חיץ ידי הוספת 5 גרם HTAB לתוך L 1 של חיץ פוספט אשלגן (50 מ"מ, pH = 6.0). לחמם בעדינות כדי לפזר ולאחסן בבית 2-8 ° C עד השימוש. כאשר נדרש חום כדי להמיס מחדש.
  3. הכן חיץ תמוגה עבור homogenization רקמות לניתוח חלבונים על ידיהוספת 10 מ"ל של חומצה הידרוכלורית טריס-1M (pH = 8.0), 6 מ"ל של נתרן כלורי 5M ו - 2 מ"ל של טריטון X 100 מ"ל ל 182 של מים מזוקקים מעוקרים. טריטון X-100 הוא צמיג מאוד בטמפרטורת החדר, ולכן, יש לחמם בעדינות לפני השימוש. המאגר תמוגה מוכנים ניתן לאחסן ב -20 ° C עד השימוש.

5. לדוגמא לקראת מבחני

  1. לדוגמא כהכנה לניתוח MPO.
    1. הסר דגימות -70 ° C ומניחים על קרח. רשום את המשקל של כל דגימה לאחר הסרת כל צואה גלוי או שומן באמצעות המלקחיים פינצטה כפוף / ומקום לתוך צינור Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge 2ml (או כל צינור שניתן להשתמש בהם עם homogenizer). דוגמאות יש לשמור על הקרח בכל עת. חשוב לציין כי שברי המעי הגס דומה אמור לשמש מן לשכפל כל ביולוגיים (סעיפים דיסטלי כלומר רק חלקים או הפרוקסימלי בלבד).
    2. הוסף homogenizer חרוז על צינור כל המדגם.
    3. מוסיפים את הכמות המתאימה של buf HTABfer לפי משקל רקמות. אם משקל רקמת הוא פחות מ 25 מ"ג, מוסיפים את החיץ ביחס של 12.5mg/mL, אם משקל הרקמה נע בין 25-50, מוסיפים ביחס של 25mg/mL. אם משקל הרקמה עולה 50, להוסיף למאגר ביחס של 50mg/mL.
    4. Homogenize עם homogenizer רקמה דקות 4 ב 30 הרץ. חזור אם הרקמה אינו הומוגני לחלוטין.
    5. הסר homogenizer חרוז פתרון צנטריפוגה 6 דקות (13,400 XG, 4 ° C).
    6. איסוף supernatant וזורקים את הכדור שנוצר. Supernatent ניתן לאחסן ב -70 ° C עד השימוש.
  2. לדוגמא כהכנה לניתוח ציטוקינים.
    1. חזור על שלבים 5.1.1. ל 5.1.2.
    2. הוסף 50 μl של קוקטייל מעכבי פרוטאז (PIC) ל 10 מ"ל של חיץ תמוגה מוכן.
    3. הוסף 1 מ"ל של PIC ו חיץ תמוגה פתרון מדגם זה ללא קשר למשקל.
    4. Homogenize במשך 5 דקות ב 30 הרץ. חזור אם הרקמה אינו הומוגני לחלוטין.
    5. הסר homogenizer חרוז צנטריפוגות solutiבמשך 5 דקות ב 3300 x ז
    6. איסוף supernatant וזורקים את הכדור שנוצר. Supernatant ניתן לאחסן ב -70 ° C עד השימוש.

6. כימות של סמנים דלקתיים

  1. פעילות MPO assay
    1. הכן O-dianisidine (O-dianisidine) על ידי שילוב הפתרון dihydrochloride 16.7 מ"ג dihydrochloride O-dianisidine, 90 מ"ל של DH 2 O, ו - 10 מ"ל של חיץ פוספט אשלגן. פתרון זה אמור להיות מוכן טרי כל assay.
    2. הוסף 7 μL של homogenate רקמות (מוכן בסעיף 5.1) בשלושה עותקים לתוך צלחת 96-היטב.
    3. הוסף 50 μL של בדילול H 2 O 2 (4 μL של 30% H 2 O 2 מדולל μL 96 של DH 2 O) לתערובת O-dianisidine.
    4. השתמש פיפטה רב ערוצי להוסיף 200 μL של תערובת O-dianisidine המכיל H 2 O 2 לכל הבארות.
    5. מדד ספיגת ב 450 ננומטר באמצעות spectrophotometer. קחו שלוש קריאות ב 30 מרווחי השני.
    6. חישוב פעילות MPO. פעילות MPO נמדדת ביחידות (U) של רקמת MPO / מ"ג, כאשר יחידה אחת של MPO מוגדר הסכום הדרוש כדי לבזות 1 μmoL של H 2 O 2 לדקה בטמפרטורת החדר. בהתחשב בכך יחידה אחת (U) של MPO = 1 μmoL הפיצול H 2 O 2 ו 1 כי μmoL של H 2 O 2 נותן שינוי של ספיגת 1.13 x 10 ננומטר -2 / דקה, יחידות של MPO במדגם כל נקבעת כמו שינוי ספיגת [ΔA (t 2-t 1)] / Δmin x (1.13 x 10 -2). כדי לקבל יחידות מ"ג של רקמה, השתמש רקמות: יחס חיץ. לדוגמה, אם רקמה: יחס חיץ של 50 מ"ג / מ"ל ​​היה בשימוש, בתוך 7 μL של homogenate, יש 0.35 מ"ג של רקמת גוף. לכן, כדי לקבל יחידות רקמות מ"ג, לחלק את יחידות של MPO ידי 0.35. חישוב מדגם באמצעות ספיגת ערכים (ננומטר) נכלל למטה (בהנחה מדגם נוספה בשלושה עותקים):
מדגם זמן 0 שניות זמן 30 שניות זמן 60 שניות
1 2 3 1 " 2 " 3 " 1 " 2'' 3 "
0.048 0.048 0.051 0.061 0.061 0.065 0.074 0.073 0.078
  1. ממוצע זמן 0 שניות = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 ננומטר
  2. ממוצע זמן 30 שניות = 0.0623 ננומטר
  3. ממוצע זמן 60 שניות = 0.075 nm
  4. שינוי ספיגת (ΔA) בין 0 ל רקמת שניות / 30 מ"ג (בהנחה 50 מ"ג / מ"ל של רקמה: יחס החיץ) = [(0.0623-0.049) / (1,13 x 10 -2)] / 0.35 = 3.363
  5. שינוי לספוגאהה (ΔA) 30-60 שניות / מ"ג רקמה = 3.211
  6. * MPO פעילות (U / מ"ג רקמה) = ממוצע של ΔA (00-30) ו ΔA (30-60) = 3.287
  1. כימות הפרו ציטוקינים דלקתיים על ידי ELISA
    1. (IL-1β, IL-6 ו - TNF-α) רמות ציטוקין נקבעים באמצעות זמינים מסחרית enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ערכה (Quantikine Murine; מו"פ Systems).
    2. ספיגת ערכים מכל ELISA הוא מנורמל באמצעות assay חלבון ברדפורד בהתאמה לדגום כל מבוטא ביחידות של pg / מ"ג חלבון.

7. נציג תוצאות

מינהל משטר DSS המתאים יניעו קוליטיס חריפה בעכברים. במהלך תקופת הטיפול DSS, דאי יכול לשמש כדי להעריך ולהעריך את התקדמות קלינית של המחלה. בעלי חיים שטופלו DSS יציג ירידה משמעותית במשקל לעומת משקולות הראשונית שלהם, יציאות רכות ו צואהדימום (איור 1). עם הקרבה בדיקה של המעי הגס, חומרת קוליטיס הוא הבקיע macroscopically מבוסס על קיצור אורך המעי הגס, דימום במעי, דימום בצואה, התרופפות של עקביות שרפרף, סימנים של דימום רקטלי בהשוואה לקבוצת הביקורת שטופלו רק מים (איור 2 & טבלה 1). חתכים של דגימות רקמה הגס מוכתם H & E יהיו ציונים גבוהים יותר עבור היסטולוגית DSS שטופלו נקודתיים נגד מים שטופלו שולטת (איור 3). כדי להמשיך לאפיין את מידת הדלקת DSS שטופלו עכברים, פעילות MPO ניתן להעריך הומוגני דגימות רקמה מן המעי הגס. DSS שטופלו נקודתיים תהיה פעילות MPO גבוה בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4). בנוסף, זה קשור עם רמות גבוהות של ציטוקינים דלקתיים הפרו (IL-1β, IL-6, TNF-α) (איור 5).

באיור 1.
באיור 1. זכר, עכברים C57BL / 6 ניתנו DSS 5% לשתות מים במשך 5 ימים. עשרות דאי הוערכו יומי לכל חיה והיו בממוצע ליום עבור כל קבוצה (ממוצע ± SEM, n = 4 עכברים / קבוצה).

באיור 2.
2. איור עכברים C57BL / 6 ניתנו DSS 5% מי שתייה במשך 5 ימים. עכברים שקיבלו מים ללא בקרה DSS. מאקרוסקופיים ציון / מחלה נזק עשרות חומרת נבדקו באופן עיוור על 5 קוליטיס יום DSS-Induced הודעה. נקודתיים מבודד עכברים שקיבלו DSS יש ציונים גבוהים יותר נזק מקרוסקופית (דימום רקטלי, צניחה של פי הטבעת, שלשול, דימום במעי הגס) המעיד על חומרת המחלה גדול יותר (ממוצע ± SEM, n = 4 עכברים / קבוצה).

איור 3
באיור 3. עכברים C57BL / 6 קיבלו פתרון DSS 5% במי שתייה בכדי לגרום קוליטיס. בקרת עכברים קיבלו מים ללא DSS. (א) עשרות היסטולוגית דורגו בצורה עיוורת באמצעות H & E קטעי רקמה צבעונית הגס שנאספו על הממשל 5 שלאחר DSS יום. (ב) DSS שטופלו דגימות להראות נזק היסטולוגית יותר (חדירת הסלולר יותר, תא דלדול הגביע, עיוות גדול / נזק הקריפטה ארכיטקטורה) לעומת (C) שולט (ממוצע ± SEM, n = 4 עכברים / קבוצה). ב (ב) ו - (ג), כוכבית (*) מציין שטח של דלדול הגביע התא עיוות של האדריכלות הקריפטה, סימן מספר (#) מצביע על חדירת הסלולר.

איור 4.
איור 4. כל העכברים הוקרבו על הממשל 5 שלאחר יום DSS דגימות רקמות המעי הגס נאספו כדי להעריך את הפעילות MPO. חומרת DSS המושרה קוליטיס קשורה לרמות גבוהות יותר של פעילות MPO בהשוואה לקבוצת הביקורת (ממוצע ± SEM, n = 4 עכברים / קבוצה).

_upload/3678/3678fig5.jpg "/>
איור 5. בנוסף MPO רמות גבוהות יותר, חומרת קוליטיס DSS-Induced קשורה גם רמה מוגברת של דלקת הפרו ציטוקינים כגון IL-1β, IL-6, TNF-α (ממוצע ± SEM, n = 4 עכברים / קבוצה).

טבלה 1. מאקרוסקופיים חומרה ציון / מחלות

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DSS קוליטיס הוא מודל המושרה כימי הנמצא בשימוש נרחב של דלקת מעיים. במודל זה, עכברים מקבלים מי שתייה בתוספת DSS, אשר נחשב רעיל בתאי אפיתל במעי ולשבש את תקינות המכשול הרירית. 10 מינהל DSS גורם דלקת חריפה כי מאופיין שרפרף רופף, דימום בצואה, וגם עם חדירת גרנולוציטים. 10 במהלך DSS הממשל, קוליטיס מזוהה בדרך כלל עם ירידה משמעותית במשקל וכן נוכחות של דם בצואה, אשר ניתן להעריך על ידי בדיקת דם סמוי בצואה. 5.10,11 לאחר איסוף דגימות רקמות המעי הגס, חומרת קוליטיס יכול להיות מאופיין בדיקה מקרוסקופית של המעי הגס, ניתוח היסטולוגית של H & E מוכתם הגס חתכים באמצעות מערכות מניה הוקמה בעבר. 9

כאשר בעקבות פרוטוקול זה, חשוב לציין כי חומרת קוליטיס המושרה על ידיDSS הוא זנים זן ספציפי. 12 בנוסף, ההבדלים מיקרופלורת המעי בין מתקני בעלי חיים שונים, חדרי דיור עשויה לשנות את התוצאה של הממשל DSS. 13,14 לכן, מחקרים ראשוניים באמצעות DSS ייתכן שתידרש כדי לייעל את המינון ומשך DSS הטיפול. אי לייעל משתנים אלה עלולים לגרום לשכיחות גבוהה של מוות או קוליטיס לא מעט. אופטימיזציה פעם, מודל זה יכול לשמש כמודל לשחזור מאוד של קוליטיס עם שיעור נמוך של תמותה. בנוסף, חשוב להשתמש DSS המשקל המולקולרי המצוין (ראו טבלה של ריאגנטים). צורות אחרות של מגיב מלח DSS לא יכול לייצר או קוליטיס עשוי להוביל שכיחות גבוהה של מוות.

אינדוקציה של קוליטיס באמצעות תוצאות מודל נזק מאקרוסקופיים היסטולוגית חמור, אשר מזוהה עם פעילות MPO גדל כמו גם רמות גבוהות יותר של ייצור ציטוקינים דלקתיים הפרו. Agranulocytes, כגון לימפוציטיםמונוציטים ד, הם מקורות חשובים של תומכי ציטוקינים דלקתיים, ואילו MPO הוא אנזים בתוך גרנולוציטים כגון נויטרופילים (וכן מונוציטים ומקרופגים במידה פחותה). פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי למדוד את פעילות MPO בדגימות רקמה הגס שטופלו dinitrobenzene חומצה sulfonic (DNBS) -. קוליטיס המושרה 15 DNBS-Induced קוליטיס הוא מאופיין היטב T-cell דלקת transmural בתיווך של המעי הגס, כי הוא מנוהל על ידי החדרה intrarectal החומר DNBS באתנול. 16 אתנול משמש כדי לשבור את מחסום הרירית, המאפשר DNBS כדי haptenize חלבונים עצמיים או החיידקים גירוי תגובה חיסונית מארח את hapten-שונה עצמית אנטיגנים. 16 אחד היתרונות של המודל הזה על פני המודל DSS-Induced הוא כי הסוכן לעורר ידוע. המנגנון שבאמצעותו DSS יוזם קוליטיס, לעומת זאת, עדיין לא נקבע. באופן מעניין, מחקרים הראו כי DSS הממשל גורמת coliTIS ב הרוצח הטבעי התא לקוי, ו-T-ו-B-cell עכברים לקוי, מה שמראה כי תאים אלה (הקשורות למערכת החיסון אדפטיבית) לא יכול להיות קריטי אינדוקציה של קוליטיס ולכן, מודל זה עשוי להיות מתאים ללימוד תפקידה של מערכת החיסון המולדת בדור של קוליטיס. 4,17

בשביל למדוד את המדויקת ביותר של פעילות MPO, מצאנו כי ללא תלות במודל קוליטיס משמש, רמות MPO צריך להיקבע בתוך בשבוע הראשון של אוסף רקמות כפעילות MPO נוטה ירידה לאורך זמן. פעילות MPO יכול לשמש כסמן פונדקאית של דלקת. אולם, כימות של ציטוקינים רקמות הבקיע היסטולוגית הם חלק בלתי נפרד כדי להקל על הערכה מלאה של התגובה הדלקתית במהלך קוליטיס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי הקנדי הלאומי לבריאות מחקר (CIHR) ועל ידי קרוהן ו קוליטיס קרן של קנדה (CCFC).

Materials

ציון דימום רקטלי צניחה רקטלי הצואה עקביות דם
0 אף אחד אף אחד נורמלי נורמלי
1 אדום סימנים של צניחה רך אדום
2 אדום כהה נקה צניחה רך מאוד כהה אדום
3 גרוס דימום רב צניחה שלשול שחור
Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) Eppendorf 0030 120.094
Biotek EL808 Absorbance plate reader BioTek EL808
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) MP Biomedicals 160110
Gen5 (software) BioTek Version 1.10.8
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water Sigma-Aldrich 216763 Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom Sarstedt Ltd 82.1581 For single use only
o-Dianisidine Sigma-Aldrich D-3252 Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic Caledon 6620-1
Potassium phosphate, monobasic EMD Millipore PX1565-1
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Store at -20°C
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II Qiagen 69997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sands, B. E. From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation. Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).
  2. Danese, S., Fiocchi, C. Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases. World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).
  3. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
  4. Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).
  5. Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency. Digestion. 62, 240-248 (2000).
  6. Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).
  7. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).
  8. Smith, J. W., Castro, G. A. Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation. Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).
  9. Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model. Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).
  10. Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).
  11. Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).
  12. Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).
  13. Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).
  14. Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice. Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).
  15. Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis. Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).
  16. Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance. J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).
  17. Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).
חקירת דלקת מעיים במודל DSS-Induced של IBD
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).More

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter