Summary
炎症性腸疾患の実験モデルは、私たちは病因に関連する複雑な自然免疫と獲得免疫応答を検討することを可能にした。組織学的スコアリング、炎症性サイトカインおよびミエロペルオキシダーゼ活性の定量化を使用して、一つは炎症性腸疾患に見られるこれらの応答を評価するために始めることができます。
Abstract
炎症性腸疾患（IBD）は腸の病態の範囲、潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）であるの最も一般的に網羅しています。 UCとCD、両方が大腸に存在する場合、下痢、直腸出血、腹痛、体重減少を含めることができます同じような症状のプロファイルを生成する。1 IBDの病因は不明であるが、それは両方を含む多因子疾患として記述されています遺伝と環境のコンポーネント2。
IBDのいくつかの機能に似ている結腸炎症の数々と可変の動物モデルがあります。デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）などの大腸炎を誘発する化学物質の特定の濃度のものが必要な行政へのある種の感受性系統、で自発的に生じるものから大腸炎の範囲の動物モデル。腸の炎症の化学物質誘発性モデルは、IBDの最も一般的に使用されると最高に記載のモデルです。投与により飲料水におけるDSSの意気込みは、管理プロトコルに応じて、急性または慢性大腸炎を生じる。時には直腸出血の証拠で、DSS展示体重減少および軟便または下痢の症状を与えられた3匹の動物が。4,5ここで、我々はこれによってメソッドについて説明大腸炎の開発と、その結果炎症反応は、DSSの投与後に特徴づけることができる。これらのメソッドは、炎症の代理マーカーとして使用することができる組織学的ヘマトキシリン/エオシン染色コロンのセクションの解析、炎症性サイトカインの測定、およびミエロペルオキシダーゼの測定（MPO）活性を、6が含まれています
病気の状態で炎症反応の程度は、臨床症状の有無によって、または粘膜組織の組織学の変化によって評価することができる。結腸の組織学的損傷は、陰窩構造、炎症性細胞浸潤、筋肉tの損失を考慮したスコアリングシステムを用いて評価されるhickening、杯細胞の枯渇、およびcrypt膿瘍。定量的に7、インターロイキン（IL）-1β、IL - 6、腫瘍壊死因子（TNF）-αなどの急性炎症性、、と炎症性サイトカインのレベルを用いて決定することができる従来のELISA法。さらに、MPO活性は比色アッセイを用いて測定することができ、炎症の指標として使用さ8。
実験的大腸炎では、疾患の重症度は、多くの場合、MPO活性の増加および炎症性サイトカインの高いレベルと相関している。大腸炎の重症度や炎症関連損傷をヘマトキシリン/エオシン染色結腸組織切片を用いて腸の病理組織学的状態を評価することに加えて、便の硬さと出血を調べることによって評価することができる。結腸組織の断片は、MPO活性とサイトカイン産生を決定するために使用することができます。一緒に、これらの措置は、腸内炎症反応を評価するために使用することができます。実験的大腸炎の動物モデル。
Protocol
1。 DSS誘発性急性大腸炎のマウスモデル
- 所望の最終濃度（1-5％）（wt / vol）の（すなわち、オートクレーブ、500mLの水にDSS粉末25mgを追加し、5％DSSソリューションを作成するには）にオートクレーブ処理した飲料水にデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を追加。ストック溶液は、° Cまでの使用最大1週間までまたは4℃室温に放置することができます。
- バイオセーフティフードでは、50mlのファルコンチューブ（ケージごとに必要なもの）に株式のDSSソリューションを注ぐ。必要なリフィルチューブに原液を保管してください。
- DSS溶液（50mLファルコンチューブ内）で各マウスのケージで飲料水を交換する（持続時間は使用されているDSS療法に依存します。例えば、6〜8週齢の雄性C57BL / 6マウスを使用して、我々が管理する五日の合計5％DSS溶液）。マウスは、他の水源へのアクセスを持つべきではありません。コントロールマウスは、DSSなくオートクレーブ飲料水を与えられている。
- 毎日マウスの重量を測定し、一日あたりの消費DSSの量を記録。各トップDSSのレベルを記録後、50 mLのボトル。これは実験期間を通して、マウスあたりケージあたりの消費DSSのおおよその量を測定することです。我々の研究では、我々は男性のC57BL / 6マウスに5日間、5％DSSソリューションを使用してください。著しい体重減少、変更された便の硬さや糞便、血液の兆候は、この特定のDSSの養生法を使用して3日目には早くも見られている。 DSS投与中に、マウスは動物がでたり、あることを重要な生理学的指標であることが脱水と下痢と体重減少で（5日目に彼らの初期の体重の5-10％程度）の初期重量の20％を超える顕著な体重減少を示すエンドポイントの近くに。動物は、5％のDSSの5日後に通常の水へのアクセス権を与えられた場合、それは7日以内に回復します。全ての実験は、機関の動物倫理委員会によって承認され、承認された動物の利用プロトコル（AUP）に従うものとすべきである。
- 実験、疾患活動性指数（DAI）の期間中スコアは、大腸炎の臨床的進行を評価するために評価することができます。 DAIは、初期重量、便の硬さ、および出血に比べて体重減少の合計点数です。スコアは次のように定義されています：減量：0（無損失）、1（1-5％）、2（5-10％）、3（10-20％）、および4（> 20％）、便の硬さを： 0（正常）、2（軟便）、および4（下痢）、および出血：0（無血）、1（潜血陽性）、2（潜血陽性と視覚的なペレット出血）、および4（総出血、血液の周り肛門）。 DAIは、DSS投与期間中に毎日得点することができます。
- 選択の時点で、重さとマウスを生け贄に捧げる。マウスは、イソフルランまたは機関の動物施設で承認された別の方法での吸入後に頚椎脱臼により安楽死することができます。
2。結腸組織サンプルを収集
- 動物の腹側を露出させ、70％エタノール溶液で腹部領域を濡らす。この時点で、表1を参照してくださいとのメモを作る直腸出血（肛門オリフィスでの血液の存在）または各動物で直腸脱のNYの兆し。
- 腹側正中切開を行うことによって腹部を切開するための標準的な解剖ハサミを使用してください。
- コロンを見つけて、遠位結腸を解放するために、できるだけ大腸マージンの近くにコロンを横に切断する。
- 慎重に、ゆっくりと周囲の腸間膜から切り離し、全体のコロンを引き出します。
- 結腸の近位端を解放するcolonocecalマージンでコロンを横に切断する。糞は、3または5 mLシリンジに接続されている強制経口投与針を使用するか、慎重に曲がったピンセット/鉗子のペアを使用してアウトそれを押し込んで、滅菌PBSで洗浄コロンで除去することができる。全体のコロンを使用して、（3.1節を参照してください）損傷の評価
- 組織学的分析および他のアッセイのための組織のサンプリングは1.0 cmにサンプルが（すなわち、近位、中間、または遠位）からなっている領域を書き留め長い結腸の断片で0.5センチメートルを切断することによって行うことができます。
- 組織サンプル個別に1.5mlのエッペンドルフチューブに入れ、液体窒素中で凍結し、-70℃で使用時まで保存することができるアッセイに使用される℃まで
3。大腸炎の重症度の評価
- 巨視的または疾患重症度のスコアは、以前に発行されたスコアリングシステム（表1）を使用して公平な観察 者が末期評価されている9便の硬さは、ピンセットを使用して、一貫性を決定するために糞を押し下げて、評価することができる。糞便中の血液のスコアを決定するために、糞便の色に注意してください（すなわち黒便対ライトブラウンのスツール）とさらに潜血検査を用いて検証する。スコアリングシステムを使用して、条件のそれぞれのスコアを決定する。それぞれの動物のための最終的な巨視的なスコアは、個々の得点の合計です。
- 大腸炎の重症度の組織学的損傷を評価するために、バッファリングされた10％ホルマリン溶液中での小さなコロンの断片（0.5センチ）、組織のカセットの場所と水没をカット。 5準備μmのパラフィンは、適切な手順を使用して、ヘマトキシリン/ eoxin（H＆E）と断面と汚れのセクションを埋め込み。コロンのフラグメントは、近位、半ばコロン、または大腸の遠位部から取得することができます。
- H＆E染色した結腸組織のセクションは、以下の対策のために以前に発行されたシステムを用いて盲検観察者によって採点されます：（ - 全体の陰窩、3の損失を伴う重度の陰窩の歪み正常、0）、炎症性細胞浸潤の程度（正常、0 cryptのアーキテクチャ - 高密度、炎症性浸潤3）、筋肉の肥厚（陰窩の基底には粘膜筋板、0に座る - 著しい筋肉の肥厚の存在、3）、杯細胞の枯渇（欠席、0 - 現在、1）と陰窩膿瘍（欠席、0 - 現在、1）7組織学的損傷のスコアは、個々の得点の合計です。それは人間のUCとは異なり、陰窩膿瘍は、このモデルの特徴ではないとめったに見られないことに留意すべきである。微視的な潰瘍もまれです。複数のコロンセクションがあった場合汚された、同様のセクション間の組織学的スコアは、各エリアの最終スコアを（遠位結腸の組織学的スコアに対する近位結腸で、すなわち組織学的スコア）を決定するために使用されるべきである。
4。アッセイ用試薬のストック溶液を準備する
- （KH 2 PO 4、1Lの一塩基性リン酸カリウム6.8gの溶液にB液（K 2 HPO 4、のdH 2 Oの1 Lの二塩基リン酸カリウムの8.7 g）を追加することにより、リン酸カリウム緩衝液50mMの溶液を調製します）のdH 2 O中の6.0のpHが達成されるまで。残りのソリューションは、将来の使用時まで冷蔵庫（2-8℃）で保存することができます。
- リン酸カリウム緩衝液（50mM、pHは= 6.0）1L中に5gのHTABを追加することにより、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（HTAB）バッファを準備します。 2〜8℃で溶解し、保存するためにゆっくりと熱° C使用時まで。必要なときは、再溶解するために加熱する。
- によるタンパク質解析のための組織のホモジナイズのために溶解バッファーを準備します。1Mトリス - 塩酸（pH = 8.0）、5M塩化ナトリウムの6 mLの滅菌蒸留水のトリトンX - 100から182 mLを2 mLの10 mLを加える。トリトンX - 100は、室温で非常に粘性であり、従って、穏やかに、使用前に温める必要があります。準備溶解バッファーは使用まで-20℃で保存することができます。
5。アッセイ用サンプルの準備
- MPO分析用サンプルの準備。
- -70からサンプルを削除して氷上で° Cと場所。 2mLのエッペンドルフセイフ - ロックマイクロ遠心チューブ（またはホモジナイザーで使用できる任意のチューブ）に曲がってforcep /ピンセットと場所を使用して、任意の目に見える糞便や脂肪を除去した後、各サンプルの重量を記録します。サンプルは常に氷上で保存する。その同様のコロンの断片がそれぞれ生物学的複製（すなわち遠位セクションのみまたは近位のセクションのみ）から使用する必要がある注意することが重要です。
- 各サンプルチューブにホモジナイザービーズを追加。
- HTAB bufの適切な量を追加します。組織重量に応じてFER。組織の重量が25未満ミリグラムの場合、12.5mg/mLの割合でバッファを追加し、組織重量は25から50の間であれば、25mg/mLの割合で加える。組織重量が50より大きい場合は、50mg/mLの割合でバッファを追加します。
- 30Hzで4分のための組織ホモジナイザーでホモジナイズする。組織が完全に均質化されていない場合は繰り返します。
- ホモジナイザー、ビーズと6分（13400 × gで、4℃）のための遠心液を除去。
- 上清を収集し、得られたペレットを捨てます。上清を-70℃で使用時まで保存することができます。
- サイトカインの解析のためのサンプル調製。
- ステップ5.1.1を繰り返します。 5.1.2へ。
- 準備の溶解緩衝液10mLにプロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）の50μlを追加。
- PICと体重の関係なく、各サンプルの溶解緩衝液1 mLを追加します。
- 30Hzで5分間ホモジナイズする。組織が完全に均質化されていない場合は繰り返します。
- ホモジナイザー、ビーズや遠心solutiを削除します。3300 x gで5分間で
- 上清を収集し、得られたペレットを捨てます。上清を-70℃で使用時まで保存することができます。
6。炎症マーカーの定量化
- MPO活性の測定
- o -ジアニシジン二塩酸塩、のdH 2 O 90mLの、およびリン酸カリウム緩衝液10mlの16.7 mgを組み合わせることにより、o -ジアニシジン二塩酸塩（o -ジアニシジン）溶液を調製します。このソリューションは、すべてのアッセイのために新鮮な準備する必要があります。
- 96ウェルプレートに三連の組織ホモジネート（セクション5.1で調製したもの）7μLを加える。
- o -ジアニシジンの混合物に希釈したH 2 O 2（30％のdH 2 O 96μLで希釈したH 2 O 2の4μL）50μLを加える。
- 各ウェルにH 2 O 2を含むo -ジアニシジン混合物200μLを追加するには、マルチチャンネルのピペットを使用してください。
- spectrophoを使用して450nmの吸光度を測定tometer。 30秒間隔で3測定値を取る。
- MPO活性を計算する。 MPO活性は、MPOの一単位を室温で毎分、H 2 O 2の1μmolのを分解するために必要な量として定義されているMPO / mg組織の単位（U）で測定されます。 MPOの1単位（U）= 1、H 2 O 2分割のマイクロモルとそのH 2 O 2の1μmolのは1.13 × 10 -2 nm /分の吸光度変化を与えることを考慮すると、各サンプル中のMPOの単位が決定されます。吸光度の変化として[ΔA（T 2 - T 1）] /Δmin×（1.13 × 10 -2）。バッファーの比率：組織mg当たりの単位を取得するには、組織を使用してください。例えば、組織場合：50 mg / mLのバッファーの比率が使用された、ホモジネートの7μLで、組織の0.35ミリグラムがあります。したがって、mgの組織当たりの単位を取得するには、0.35でMPOの単位を分ける。吸光度の値を使用してサンプルの計算は（NM）（サンプルは三重に追加されていることが前提です）以下に含まれています：
| サンプル | 時間0秒 | 時間30秒 | 時間60秒 | ||||||
| A | 1 | 2 | 3 | 1' | 2' | 3' | 1" | 2 '' | 3" |
| 0.048 | 0.048 | 0.051 | 0.061 | 0.061 | 0.065 | 0.074 | 0.073 | 0.078 | |
- 平均時の0秒=（0.048 + 0.048 + 0.051）/ 3 = 0.049 nmの
- 平均時間30秒で= 0.0623 nmの
- 時間で平均60秒= 0.075 nmの
- 0〜30秒/ mg組織（50 mgの/組織の溶解を仮定して：バッファの比）に吸光度（ΔA）に変更= [（0.0623〜0.049）/（1.13 × 10 -2）] / 0.35 = 3.363
- 吸収の変化30〜60秒/ mgの組織= 3.211からインピーダンス（ΔA）
- * MPO活性（U / mg組織）=ΔAの平均値（0〜30）とΔA（30-60）= 3.287
- ELISAによる炎症性サイトカインの定量化
- サイトカイン（IL -1β、IL - 6およびTNF -α）濃度は、市販の酵素免疫測定法（ELISA）キット（R＆DシステムズQuantikineマウス）を用いて決定されます。
- 各ELISAの吸光度値は、各サンプルにそれぞれのBradfordタンパク質アッセイを使用して正規化され、タンパク質のpg / mgの単位で表現されます。
7。代表的な結果
適切なDSSのレジメンの投与はマウスの急性大腸炎を誘発する。 DSS治療の期間中、DAIは疾患の臨床的進行を評価し、評価するために使用することができます。 DSSで処理した動物は、彼らの初期の重みに比べて有意な体重減少、軟便と糞が表示されます出血（ 図1）。コロンの犠牲と調べると、大腸炎の重症度は、肉眼的に大腸の長さの短縮、大腸出血、糞便出血、便の硬さを緩め、そして水で処理した対照と比較して直腸出血の兆候が唯一の（ 図2および表に基づいて採点される1）。 H＆Eで染色した結腸組織試料の断面は、水処理コントロールに対するDSS処理コロン（ 図3）のための高い組織学的スコアを持つことになります。さらにDSS処置マウスにおける炎症の程度を特徴づけるために、MPO活性は、均質化結腸組織のサンプルから評価することができます。 DSS処理コロンは、コントロール（ 図4）に比べて高いMPO活性を持つことになります。さらに、これは炎症性サイトカイン（IL -1β、IL - 6、TNF -α）レベルの上昇（図5）に関連付けられています。
図1。雄、C57BL / 6マウスを5日間飲料水の5％DSSを与えられた。 DAIのスコアは、各動物について毎日評価され、（± SEM、n = 4のマウス/群を意味する）、各グループごとに一日あたり平均した。
図2。C57BL / 6マウスを5日間飲料水の5％DSSを与えられた。対照マウスは、DSSなしで水を受け取った。巨視的な損傷のスコア/疾患の重症度スコアは、盲目的に5日後のDSS誘発性大腸炎で評価した。 DSSを投与したマウスから単離されたコロンは、より高い巨視的な損傷のスコアを（直腸出血、直腸脱、下痢、大腸出血）より、疾患の重症度を（± SEM、n = 4のマウス/群の平均）を示す必要があります。
図3。C57BL / 6マウスは大腸炎を誘発するために、飲料水の5％DSSソリューションを与えられた。対照マウス DSSなしで水を受け取った。 （A）組織学的スコアは、盲目的に5日後のDSSの管理で収集されたH＆E染色した結腸組織切片を用いてスコア化した。 （B）DSS処理したサンプルは、（C）コントロール（± SEM、n = 4のマウス/群を意味する）に比べてより多くの組織学的損傷を（より多くの細胞浸潤、より多くの杯細胞の枯渇、大きな歪み/陰窩構造への損傷）を示す。の（B）及び（C）、アスタリスク（*）杯細胞の枯渇と陰窩構造の歪みの面積を示し、番号記号（＃）細胞浸潤を示す。
図4はすべてのマウスは、DSSと結腸組織サンプルの5日目投与後に屠殺は、MPO活性を評価するために集められた。 DSS誘発性大腸炎の重症度は、対照と比較して、MPO活性の高いレベル（± SEM、n = 4のマウス/群を意味する）に関連付けられています。
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図5。高いMPOレベル、DSS誘発性大腸炎の重症度に加えても、そのようなIL -1β、IL - 6、TNF -αなどのプロ炎症性サイトカインの増加レベル（± SEM、n = 4のマウスを意味するに関連付けられています/群）。
| スコア | 直腸出血 | 直腸脱 | スツールの一貫性 | 血 |
| 0 | なし | なし | 通常 | 通常 |
| 1 | レッド | 脱出の兆し | ソフト | レッド |
| 2 | 暗い赤 | 明確な脱出 | 非常にソフト | 暗い赤 |
| 3 | 総出血 | 大規模な逸脱 | 下痢 | 黒 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Biotek EL808 Absorbance plate reader | BioTek | EL808 | |
| Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) | MP Biomedicals | 160110 | |
| Gen5 (software) | BioTek | Version 1.10.8 | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) | Sigma-Aldrich | H5882-100G | |
| Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water | Sigma-Aldrich | 216763 | Store at 2-8°C |
| Microtest plate 96-well flat bottom | Sarstedt Ltd | 82.1581 | For single use only |
| o-Dianisidine | Sigma-Aldrich | D-3252 | Light sensitive. Store at 2-8°C |
| Potassium phosphate, dibasic | Caledon | 6620-1 | |
| Potassium phosphate, monobasic | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at -20°C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II | Qiagen | 69997 |
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Tags
医学、問題60、炎症、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、急性結腸損傷、顆粒球、コロン、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）、好中球 View Video
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