Summary
Abstract
Живых клеток является важным техника применяется в ряде тканей дрозофилы используются в качестве моделей для исследования темы, такие как оси спецификации, клеточной дифференцировки и органогенеза 1. Правильная подготовка экспериментальных образцов является одним из важнейших, часто пренебрегают, шаг. Целью подготовки является обеспечение физиологическое значение и создание оптимальных условий съемки. Для поддержания жизнеспособности тканей, важно, чтобы избежать обезвоживания, гипоксия, перегревание или средней ухудшения 2.
Камера дрозофилы яйца хорошо организованной системы для изучения вопросов, связанных, но не ограничиваясь, к телу рисунка, мРНК, локализации и организации цитоскелета 3,4. Для ранней и средней стадии яйца камер, монтаж в галоидоуглеводородов масло хорошо для выживания в том, что она позволяет свободной диффузии кислорода, предотвращает обезвоживание и гипоксии, обладает превосходными оптическими свойствами для микроскопии. Imстарение флуоресцентных белков можно за счет внедрения трансгенов в камеру яйцо или физического введения меченой РНК, белков или антител 5-7. Например, добавление MS2 конструкций в геном животных позволяет в режиме реального времени наблюдения мРНК в ооцит 8. Эти конструкции позволяют в естественных условиях маркировки мРНК за счет использования бактериофага MS2 РНК стволовых цикл взаимодействия с его белка оболочки 9.
Здесь мы приводим протокол для извлечения из яичников, а также выделения отдельных овариол и яйца камер из женской дрозофилы. Подробное описание оогенеза Drosophila см. Аллан Спредлинг (1993, перепечатано 2009) 10.
Protocol
1. Дрозофил подготовка приоритетных для вскрытия (по данным Е. Gavis, Принстонский университет)
- Откажитесь от взрослых с редкими посеяны бутылку и передавать бутылку до 25 ° C до вашего эксперимента. Как только новые взрослые начали появляться, ждать два дня.
- Возьмите муху флакон, содержащий примерно 10 мл твердую пищу и добавляют 0,5-0,7 г сухих дрожжей (см. таблицу) на 45 градусов. Не закрывайте всю поверхность лету пищи с дрожжами.
- Добавьте несколько капель воды дрожжи, достаточное для увлажнения (рис. 1А). Поместите флакон на 45 градусов, позволяет примерно на 3 минуты для дрожжей, чтобы впитать воду (рис. 1б).
Примечание: Кроме того, премиксов дрожжи вставить в отдельный контейнер и добавьте пасту во флакон с лопаточкой.
- Обезболить мухи во флаконе путем введения газа CO 2. Когда они перестают двигаться, чаевые бессознательного мухи на CO 2
- Изолировать 10-15 самок и 5 самцов желаемого генотипа при вскрытии объем тонким наконечником кисть (рис. 1D). Мужчины очевидно наличие клещей, темные выступающие структуры, на их задних.
- Добавить выбранные мух дрожжевого флакона (рис. 1Е). Место при 25 ° С в течение 24-60 часов. Инкубировать короткие сроки для увеличения процента молодых до середины стадии яйца камеры и более периодов на конец камеры стадии яйца.
2. Drosophila яичников вскрытия
- Поместите каплю масла на галоидоуглеводородов № 1.5, 22 х 50 мм покровным стеклом (рис. 2A). Установите подготовленную скольжения крышку в сторону, где она не будет находиться в пути.
- Обезболить мух в дрожжевого подлый путем введения газа CO 2 и наконечник на CO 2 площадки.
- Используйте острый тонкий носом щипцы понять отдельные откормленный женщина на переднем живота (не между гобрюшной полости и грудной клетки электронной) (рис. 2В-C).
- Держите женщина с щипцы и посмотреть под микроскопом рассечения, примерно 2-3 см над подготовленным покровным.
- Все еще держа в передних, использование второго набора щипцы для удаления тканей в крайнем заднем женской (рис. 2D). Примечание: Gut ткани, как правило, вытащить с заднего конца. Протрите удалить ткань с щипцами.
- В то время как все еще держит женщина на переднем, используйте щипцы для вытер слегка сжать или массаж живота, работающий от передней к задней. Массаж живота так же, как удаление зубных паст с конца трубки.
- Два крупных непрозрачных структур будет выталкиваться из брюшной полости и палкой на конце щипцы (рис. 2E-F). Эти парные яичники.
- Нажмите на яичниках галоидоуглеводородов нефти на слайде ниже.
- Повторить 1-2 раз рассечение, чтобы дать в общей сложности 4-6 завязей в нефти на покровное (Figurэлектронной 2G).
3. Изоляция овариол
Примечание: каждый яичник содержит около 16 овариол составил от 6 до 10 яйца палат разных этапах расположены, как бусины на нитке 10.
Примечание: До выделения овариол, настроить источник света в анатомический театр микроскоп, чтобы освещение поражает под небольшим углом к образцу. Это дает отличие от образцов и позволяет визуализировать молодой камеры стадии яйца.
- В масле, отделить два яичника, удалив соединительной ткани на заднем конце (старые ступени) с закрытыми щипцами (рис. 3А).
- Восток отдельных яичников с самого старого этапа к левому и молодым этапе с правой стороны. Молодые стадии яйца камеры в яичниках являются прозрачными и образуют более заостренный конец яичника.
- С парой щипцов в доминирующую руку, нежно схватить задние из яичников, предпочтительно остатками йэлектронной соединительной ткани. Удерживая яичник в месте с пинцетом, использование датчика вскрытия (или вольфрамовой иглы), чтобы дразнить индивидуальные овариол (рис. 3В-D).
Примечание: Индивидуальные овариол будет разрыв между молодыми этапов (гермария поставить 10), старший этапы слишком велики, чтобы быть отделены от полного яичника.
Примечание: прокалывание конце яйцеклетки сцене с рассечение датчик приведет в цитоплазму просачивается в масло и сделать извлечение отдельных овариол очень сложным. Если поздно ооцитов стадии проколот, выйдите на свежий яичника.
- После яйцевая трубка свободна от яичников, использовать датчик вскрытия, чтобы перетащить его в центр капли масла и ориентировать в нужном ориентации для эксперимента. Примечание: овариол на нефть будет располагаться и присоединиться к стеклу.
- Повторите этот процесс (3,3-3,4), пока есть 15-25 человек овариол. Примечание: Это может потребовать вскрытия multipле яичников. Весь процесс должен занимать не более 15 минут.
Примечание: Желательно, чтобы вскрыть один яичник каждый из нескольких мух вместо рассечения обоих яичников с меньшим количеством мух увеличить число п мух для эксперимента.
Примечание: Неосторожное обращение с яйцевая трубка приведет к нездоровой ооцитов и может привести к артефактам в эксперименте.
Примечание: ооцитов начнет показывать фенотипические изменения, связанные подчеркнуть 40 минут после того, как расчлененный из яичника (ср. рис 7E до F).
- После овариол в адекватной ориентации (рис. 3Е), используйте датчик вскрытия и закрытые щипцы для перемещения избыточной ткани яичника из нефти. Этот материал может быть стерт с щипцами на бумажное полотенце.
4. Изоляция отдельных поздней стадии яйца камеры (по данным Е. Gavis, Принстонский университет)
- С парой щипцов в ДоминМуравей рукой возьмитесь за заднюю изолированного яичников, предпочтительно остатки соединительной ткани. Удерживая яичник в месте с щипцами, ввести зонд вскрытии в заднем конце яичника у щипцов (рис. 4а). Избегайте любого прокола камеры яйцо, вставив зонд с конца камеры стадии яйца.
- Вытащите иглу через рассечение яичника, пока не выходит на ранней стадии яйца камеры (рис. 4В). Если все сделано правильно, зонд будет удалить соединительной ткани проведения овариол и поздней стадии яйца камеры на месте.
- Повторите шаг 4,2 до овариол распространяются на покровное. Примечание: Когда яйцо камеры больше не друг на друге, этот шаг является полным.
- Используя датчик вскрытия, отделить конце ооцитов для легкого томография (рис. 4С).
Примечание: прокалывание яйцеклетки при вскрытии конце камеры стадии яйца не так, как и осуждать рассечения яndividual овариол для младших стадий.
Примечание: этап 14 камер яйцо, используйте щипцы понять спинных придатков для ориентации.
5. Инъекции препарата
Примечание: Для введения в середине ооцитов этапе ориентировать овариол перпендикулярно длинной оси покровным стеклом.
- Включите микроскоп изображений [в нашем случае DeltaVision Основные из прикладной Precision] и загрузить соответствующие настройки изображения (рис. 5A-B).
- Включите аппарат инъекции (рис. 5С).
- Загрузите инъекционной иглой с загрузкой наконечник (рис. 5D-E). Решения для инъекций следует кратко центрифугировали на высокой скорости, чтобы избежать отложений, которые могут блокировать иглу.
- Прикрепите загруженных иглой в инжектор. Будьте осторожны, чтобы избежать нарушения иглы (рис. 5F).
- Чтобы помочь прочистить иглы, положите небольшой кусочек стекла 2x10 мм от среза или сломанные покровноет с одной стороны нефть падение содержащие овариол. Убедитесь, что этот фрагмент стекла покрыты маслом. Такое стекло будет служить на таран иглы против за нарушение или прочистить иглой.
6. Введение флуоресцентных РНК
Прежде чем вы начнете: Настройка аппарата впрыска и микро-манипулятор управления, что инъекции игла находится в центре поля зрения.
- Установите образец, который будет введен на предметный столик микроскопа.
- Выберите 20x цели. Высокие или более низкие цели увеличение также может быть использован.
Примечание: При использовании автоматизированной этапе с точки посещения возможности желательно, чтобы отметить все стадии 8-9 ооцитов для инъекций перед началом. Это позволяет легко посетить и введение выбранной ооцитов.
- Опустите иглу до соприкосновения с маслом. Центр иглы над объективом.
- Очередьот свет в комнате и включите яркий свет поля для микроскопа. Выберите первую точку (яйцеклетки) на маркированного списка точек. Глядя через окуляры, сосредоточиться на ооцитов (рис. 6А).
- Опустите иглу вручную, пока он находится в той же плоскости фокуса, как яйцеклетки и видимые рядом с яйцеклетки.
- С помощью манипулятора контроля, перемещение точки введения иглы, пока он находится внутри яйцеклетки. Быстро колющие движения зачастую более успешны, чем медленно заранее. Оказавшись внутри, извлечения небольшого объема с иглы и визуально оценить эффект, повторять по мере необходимости. Если инъекция прошла успешно, в цитоплазме яйцеклетки будут смещены, если это не очевидно, повторить. Это не обязательно, чтобы изображение флуоресценции для определения того, материал был введен. После инъекции, удалите иглу внутри яйцеклетки (рис. 6В-G).
- Точное количество жидкости вводят трудно количественно. Чтобы увеличить объем вводят, adjuго давления или времени импульса инжекции, разбить кончик иглы увеличить открытии немного или использовать повторно импульсов впрыска.
Примечание: весь процесс инъекции должно занять меньше чем за 10 секунд при выполнении должным образом. Обширные колоть или затяжных с иглой внутрь яйцеклетки может привести к серьезному повреждению яйцевой камеры.
- Перед выбором следующего заметного яйцеклетки, поднять иглу достаточно высоким в масле так, чтобы не связываться с другими ооцитов в туристическом пути.
- На новой яйцеклетки, повторите шаг 6.6. Продолжайте таким образом, пока все необходимые ооцитов вводили.
Примечание: Если допущена ошибка при введении, переходим к следующему отмечены яйцеклетки. Не тратьте время на поврежденных яйцеклеток.
Примечание: игла может засориться во время инъекции сессии. В этом случае перемещение иглы рядом с разбитым стеклом на нефть на покровное. Остроумиеч стекла и иглы в той же фокальной плоскости, мягко таранить иглу в стекле (рис. 6H). Проверьте, что игла Прочистка нажатием кнопки инъекции и, видя, если любая жидкость выходит из кончика иглы.
- Когда все яйцеклетки были введены вручную перемещать иглу, из нефти и ориентировать его на пути луча для микроскопа. Убедитесь, что она находится в безопасном ориентацию, чтобы избежать повреждения глаз.
Примечание: Если длительное время, прошедшее между яйцом сурдокамере и яйцеклетки инъекции ооцитов будет трудно внедрить и проявлять фенотипические изменения, связанные со стрессом. Аналогичные проблемы могут возникнуть при грубом обращении яйцеклетки или инжекции избыточных объемов (ср. рис 6I, J, K).
7. Жить изображений опытно-конструкторских
- Выберите первый вводят яйцеклетки из списка. Испытание, что инъекция была в яйцеклетку с помощью методов визуализации одного кадра в флуоресценции (с рис 6G).
- Настройка параметров эксперимента, в том числе: длина волны возбуждения, выброс пути, времени возбуждения, Z-стек и время между коллекциями. Примечание: Для получения дополнительной информации об этом см. Партон Р., и др.. (2010) 2.
- Соберите набор данных.
8. Представитель Результаты
В пробирке синтезировали Alexa-546 ГРК РНК вводили в Me31B :: GFP яйцевой камеры (рис. 7а). РНК локализуется в передней спинной ооцита и образует крышку вокруг ядра (рис. 7Б). Дополнительные примеры локализации РНК увидеть MacDougall Н. и соавт. (2003) 11.
Средние и поздние стадии ооциты выражения помечены флуоресцентным белком (GFP-Тау, рис. 7) или РНК пометки системы (ГРК * mCherry, Рис 7D) могут быть отображены без инъекций.
Рисунок 1.
Рисунок 2.
Рисунок 3.
Рисунок 4.
Рисунок 5.
Рисунок 6.
Рисунок 7.
Discussion
Живых клеток представляет собой мощный анализ для изучения клеточных процессов в реальном времени. В дополнение к простому яркие наблюдения поля, кроме флуоресцентных меток с белками и РНК интереса привело к много открытий. Здесь мы наметили протокол для работы с изображениями отдельных яйцеклеток жизни, который может быть использован в сочетании с генетическими и биохимическими методами.
В этом протоколе, мы объясним, как экспериментально манипулировать жизни ооцитов в виде инъекций. Есть много возможностей для материала для введения, в том числе в пробирке синтезировали люминесцентные меченой РНК для анализа возможности вторичной структуры прямого локализации РНК (мяч и Дэвис, не опубликовано) и антитела, которые подавляют функцию белков 6. Будущая работа, скорее всего, см. введение других компонентов, маркировки и клеточные механизмы для живых яйцеклеток позволит молекулярные механизмы должны быть протестированы.
т "> Сохранение жизнеспособности и здоровья тканей необходимо при работе с живыми клетками. В этом протоколе мы отмечаем ряд шагов, которые могут привести к стрессу из яйцевой камеры. Например, несмотря на нефти является превосходной для работы с изображениями, расширенные культуры в нефти может привести к стрессу на яйцо камеру. Это можно легко контролировать при ярком воздействия поля изучения морфологии ядра и положение, что мембраны ооцитов будет искажать и пузырь в условиях стресса (ср. рис 7E (безударный), чтобы Figure7F ( подчеркнул,)). Этап 9 камер яйцо показать РНК локализации и границ миграции клеток 12 в течение нескольких часов. Тем не менее, этап 7/8 яйца камера начнет проявлять негативных последствий на нефть углерода гало примерно через 40 минут яичник был удален из женщины. Поздняя стадия яйца камеры, этап 11 до 14, может нормально развиваться в нефть или водной среде из-за выделения яичной скорлупы из фолликула клетки на этих этапах 13. Это было репоrted, что добавление инсулина для водной среды насекомое может поддерживать этап 9 ооцитов до 6 часов 14 germaria до 14 часов 15. Во всех случаях агрессивного маневрирования яйцевой камеры следует избегать, так как она подчеркивает ооцитов и снижает ее жизнеспособность. Изображения меньше яйцо камер и забота относиться друг мягко является лучшим способом для обеспечения оптимальной устойчивости.Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Wellcome Trust старший стипендий исследований И. Дэвис.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning. | |||
| Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0) | Any Supplier | A good quality brush is important | |
| Halocarbon Products Corporation, Series 95 | Halocarbon Products Corp. | European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil. |
|
| Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
| Dumont No.5 - Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | "Biologie" tip is also good but more fragile |
| Dissecting probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| CO2 pad |  Genesee Scientific |
59-114 (789060 Dutscher) | European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads |
| KimCare | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
| Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
| Micromanipulator | Burleigh | Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
| Injection apparatus | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
| Injection needle | Eppendorf | 930000043 | Different tips are better for different applications |
| Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
References
- Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).
- Parton, R. M., Valles, A. -M., Dobbie, I. D., Davis, I. Pushing the Limits of Live Cell Imaging in Drosophila. Live Cell Imaging: A Laboratory. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 387-418 (2010).
- Johnston, D. Moving messages: the intracellular localization of mRNAs. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (5), 363-375 (2005).
- Jansen, R. mRNA Localization: Message on the Move. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 247-256 (2001).
- Van De Bor, V., Hartswood, E., Jones, C., Finnegan, D., Davis, I. gurken and the I factor retrotransposon RNAs share common localization signals and machinery. Dev. Cell. 9 (1), 51-62 (2005).
- Delanoue, R., Herpers, B., Soetaert, J., Davis, I., Rabouille, C. Drosophila Squid/hnRNP helps Dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies. Dev. Cell. 13 (4), 523-538 (2007).
- Jaramillo, A. M., Weil, T. T., Goodhouse, J., Gavis, E. R., Schupbach, T. The dynamics of fluorescently labeled endogenous gurken mRNA in Drosophila. J. Cell. Sci. 121 (Pt. 6), 887-894 (2008).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous mRNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr. Biol. 13, 1159-1168 (2003).
- Bertrand, E. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol. Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).
- MacDougall, N., Clark, A., MacDougall, E., Davis, I. Drosophila gurken (TGFalpha) mRNA localizes as particles that move within the oocyte in two dynein-dependent steps. Dev. Cell. 4 (3), 307-319 (2003).
- Tekotte, H., Tollervey, D., Davis, I. Imaging the migrating border cell cluster in living Drosophila egg chambers. Dev. Dyn. 236 (10), 2818-2824 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R., Davis, I., Gavis, E. R. Changes in bicoid mRNA anchoring highlight conserved mechanisms during the oocyte-to-embryo transition. Curr. Biol. 18, 1055-1061 (2008).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
