व्यक्तिगत तैयारी ड्रोसोफिला अंडे मंडलों लाइव इमेजिंग के लिए

Summary

Abstract

लाइव सेल इमेजिंग ड्रोसोफिला मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया लिए अक्ष विनिर्देश, सेल भेदभाव और ¹ organogenesis जैसे विषयों की जांच के ऊतकों की एक संख्या लागू करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है. प्रयोगात्मक नमूने की तैयारी सही एक महत्वपूर्ण है, अक्सर उपेक्षित कदम है. तैयारी का लक्ष्य शारीरिक प्रासंगिकता को सुनिश्चित करने के लिए इष्टतम इमेजिंग की स्थिति की स्थापना की है. ऊतक करने के लिए व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, यह निर्जलीकरण, hypoxia, overheating या मध्यम ² गिरावट से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.

ड्रोसोफिला अंडा कक्ष संबंधित प्रश्नों की जांच, लेकिन शरीर patterning के, mRNA के स्थानीयकरण और cytoskeletal ^3,4 संगठन के लिए सीमित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रणाली है. प्रारंभिक और मध्य मंच अंडा कक्षों के लिए, हेलोकार्बन तेल में बढ़ते अस्तित्व के लिए अच्छा है कि यह ऑक्सीजन की मुफ्त प्रसार की अनुमति देता है, निर्जलीकरण और hypoxia को रोकता है और माइक्रोस्कोपी के लिए शानदार ऑप्टिकल गुण है. Imफ्लोरोसेंट प्रोटीन की उम्र बढ़ने, अंडा कक्ष या लेबल शाही सेना, प्रोटीन या ^5-7 एंटीबॉडी के शारीरिक इंजेक्शन में transgenes की शुरूआत के माध्यम से संभव है. उदाहरण के लिए, पशुओं के जीनोम को MS2 constructs के अलावा ⁸ oocyte में mRNAs का वास्तविक समय अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है. इन constructs MS2 जीवाणुभोजी अपने कोट प्रोटीन के साथ ⁹ शाही सेना स्टेम पाश बातचीत के उपयोग के माध्यम से mRNA की vivo लेबलिंग के लिए अनुमति देते हैं.

यहाँ, हम के रूप में महिला ड्रोसोफिला से व्यक्तिगत ovarioles और अंडे कक्षों अलग रूप में अच्छी तरह से अंडाशय के निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. में ड्रोसोफिला oogenesis देखते एलन सी. (1993, 2009 में reprinted) Spradling ¹⁰ विस्तृत विवरण के लिए.

Protocol

1. ड्रोसोफिला विच्छेदन के लिए पूर्व तैयारी (ई. Gavis, प्रिंसटन विश्वविद्यालय के अनुसार है)

1. कम वरीयता प्राप्त बोतल से वयस्कों को त्यागें और 25 के लिए ° सी में अपने प्रयोग के पहले बोतल हस्तांतरण. एक बार नया वयस्कों के लिए उभरने के लिए शुरू कर दिया है, दो दिन का इंतजार.
2. एक मक्खी लगभग ठोस भोजन की 10ml युक्त शीशी ले लो और एक 45 डिग्री के कोण पर सूखी खमीर के 0.5-0.7 ग्राम (देखें तालिका). खमीर के साथ उड़ भोजन की पूरी सतह को कवर नहीं.
3. खमीर के लिए पानी की कुछ बूँदें जोड़ें, हाइड्रेट (चित्र 1 ए) के लिए पर्याप्त है. 45 डिग्री पर शीशी प्लेस और खमीर के लिए के बारे में 3 मिनट (चित्रा 1 बी) पानी सोख करने के लिए अनुमति देते हैं.

नोट: वैकल्पिक रूप से, premix एक अलग कंटेनर में पेस्ट खमीर और शीशी एक रंग के साथ पेस्ट जोड़ने.

4. शीशी में सीओ ₂ गैस इंजेक्शन लगाने के द्वारा मक्खियों चतनाशून्य करना. जब वे आगे बढ़ बंद करो, सीओ ₂ पर बेहोश मक्खियों टिप
5. एक ठीक इत्तला दे दी पेंट ब्रश (चित्रा 1D) के साथ 10-15 के तहत महिलाओं और एक विदारक गुंजाइश वांछित जीनोटाइप के 5 पुरुषों अलग. पुरुषों claspers की उपस्थिति, उनके पीछे एक अंधेरे फैला हुआ संरचना, स्पष्ट कर रहे हैं.
6. Yeasted शीशी (चित्रा 1E) के लिए चयनित मक्खियों जोड़ें. 25 डिग्री सेल्सियस पर 24-60 घंटे के लिए रखें. युवा के मध्य चरण अंडा कक्षों और अब देर चरण अंडा कक्षों के लिए समय अवधि के लिए बड़ा प्रतिशत के लिए कम समय अवधि के लिए सेते हैं.

2. ड्रोसोफिला अंडाशय विच्छेदन

1. एक 1.5, नहीं, 22 x 50 मिमी कवर पर्ची (2A चित्रा) हेलोकार्बन तेल की एक छोटी सी बूंद जगह है. सेट तैयार कवर की ओर पर्ची जहां रास्ते में नहीं होगा.
2. एक CO ₂ पैड पर सीओ ₂ गैस और टिप इंजेक्शन लगाने के द्वारा yeasted नीच में मक्खियों असंवेदनता उत्पन्न करना.
3. तेज ठीक नाक संदंश का उपयोग समझ एक व्यक्ति मोटा पेट के पूर्वकाल में महिला (वें के बीच नहींई पेट और छाती) (चित्रा 2B - सी).
4. संदंश के साथ महिला को पकड़ो और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत तैयार coverslip ऊपर 2-3 लगभग सेमी देखने.
5. अभी भी पूर्वकाल में पकड़े हुए, संदंश की एक दूसरे सेट का उपयोग करने के लिए महिला की चरम पीछे (चित्र 2 डी) में ऊतक निकालने. नोट: आंत ऊतक पीछे अंत के साथ आमतौर पर बाहर खींच जाएगा. संदंश से हटाया ऊतक साफ कर लें.
6. जबकि अभी भी पूर्वकाल में महिला पकड़े सफाया संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे निचोड़ या पेट की मालिश, पीछे की ओर पूर्वकाल से काम. एक ट्यूब के अंत से टूथपेस्ट को हटाने के रूप में एक ही फैशन में पेट की मालिश.
7. दो बड़े अपारदर्शी संरचनाओं और संदंश (चित्रा 2 ई एफ) के अंत पर पेट छड़ी से धक्का दिया जाएगा. ये बनती अंडाशय हैं.
8. नीचे स्लाइड पर हेलोकार्बन तेल पर अंडाशय टच.
9. विच्छेदन 1-2 बार दोहराएँ 4-6 अंडाशय के को coverslip पर तेल में कुल दे (figurई 2G).

3. अलग ovarioles

नोट: प्रत्येक अंडाशय के बारे में 16 एक ¹⁰ स्ट्रिंग पर मोतियों की तरह की व्यवस्था अलग चरणों के 6 से 10 अंडे कक्षों का बना ovarioles शामिल हैं.

नोट: पहले ovarioles अलग करने के लिए, विदारक खुर्दबीन पर प्रकाश स्रोत को समायोजित इतना है कि रोशनी नमूना के लिए एक उथले कोण पर हमले. यह नमूना के विपरीत देता है और युवा मंच अंडा कक्षों के दृश्य की अनुमति देता है.

1. तेल में, पीछे अंत (पुराने चरणों) पर बंद संदंश (चित्रा 3) के साथ जोड़ने के ऊतक को हटाने के द्वारा दो अंडाशय अलग.
2. ओरिएंट सही करने के लिए छोड़ दिया और सबसे कम उम्र के चरण के लिए सबसे पुराना चरणों के साथ एक व्यक्ति के अंडाशय. अंडाशय में युवा मंच अंडा कक्षों पारदर्शी हैं और अंडाशय के अधिक उठाई अंत के रूप में.
3. प्रमुख हाथ में संदंश की एक जोड़ी के साथ, धीरे वें के अवशेष द्वारा अधिमानतः एक अंडाशय के पीछे समझई संयोजी ऊतक. हालांकि संदंश के साथ जगह में अंडाशय पकड़े, एक विदारक जांच के उपयोग (या टंगस्टन सुई) व्यक्ति ovarioles (चित्रा 3B डी) तंग.

नोट: व्यक्तिगत ovarioles युवा अवस्था (germarium 10 चरण के लिए) के बीच तोड़ बड़े चरणों के रूप में भी पूरा अंडाशय से अलग किया जा करने के लिए बड़े हैं.

नोट: विदारक जांच के साथ एक देर चरण oocyte puncturing तेल में लीक cytoplasm में परिणाम और व्यक्ति ovarioles की निकासी बहुत चुनौतीपूर्ण बना. यदि एक देर मंच oocyte की हवा निकाल दी है, एक ताजा अंडाशय के लिए कदम.

4. एक बार ovariole अंडाशय से मुक्त है, विदारक जांच का उपयोग करने के लिए तेल और प्रयोग के लिए वांछित अभिविन्यास में ड्रॉप पूरबी के केंद्र के लिए खींचें. नोट: तेल में Ovarioles बसने और कांच के लिए पालन करना होगा.
5. इस प्रक्रिया (3.3-3.4) दोहराएँ जब तक वहाँ 15-25 व्यक्ति ovarioles हैं. नोट: यह multip का विच्छेदन की आवश्यकता हो सकती हैले अंडाशय. पूरी प्रक्रिया को कम से कम 15 मिनट लग चाहिए.

नोट: यह सलाह दी जाती है मक्खियों से कम दोनों अंडाशय विदारक प्रयोग के लिए मक्खियों के n संख्या में वृद्धि के बजाय कई मक्खियों से एक अंडाशय प्रत्येक के टुकड़े करना.

नोट: ovariole की रफ हैंडलिंग अस्वस्थ oocytes में परिणाम और प्रयोग में कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

नोट: oocytes प्ररूपी अंडाशय (एफ के लिए चित्रा 7E तुलना) से dissected किया जा रहा है के बाद 40 मिनट तनाव के कारण परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए शुरू हो जाएगा.

6. एक बार ovarioles पर्याप्त अभिविन्यास (3E चित्रा) में हैं, विदारक जांच और बंद संदंश का उपयोग तेल की अतिरिक्त डिम्बग्रंथि ऊतक बाहर चले जाते हैं. इस सामग्री को एक कागज तौलिया पर संदंश से साफ किया जा सकता है.

4. अलग व्यक्तिगत देर चरण अंडा कक्षों (ई. Gavis, प्रिंसटन विश्वविद्यालय के अनुसार है)

1. संदंश की एक जोड़ी के साथ domin मेंचींटी हाथ, एक अलग अंडाशय के पीछे संयोजी ऊतक के अवशेष के द्वारा अधिमानतः, समझ. हालांकि संदंश के साथ जगह में अंडाशय पकड़े, संदंश के पास अंडाशय (4A चित्रा) के पीछे अंत में विदारक जांच शुरू. देर चरण अंडा कक्षों के बीच जांच डालने से किसी भी अंडे कक्षों puncturing से बचें.
2. अंडाशय के माध्यम से यह प्रारंभिक चरण अंडा कक्षों (4B चित्र) पर बाहर निकल जाता है जब तक विदारक सुई खींचो. जब सही ढंग से किया है, जांच संयोजी ऊतक पकड़े जगह में और ovarioles के देर चरण अंडा कक्षों को हटा देगा.
3. दोहराएँ कदम 4.2 जब तक ovarioles coverslip पर बाहर फैले हुए हैं. नोट: जब अंडे कक्षों अब एक दूसरे के शीर्ष पर खड़ी दिखती हैं, तो यह चरण पूरा हो गया है.
4. विदारक जांच का प्रयोग, देर oocytes को अलग करने के लिए आसान इमेजिंग (चित्रा 4C) के लिए अनुमति.

नोट: एक oocyte puncturing जबकि देर से मंच अंडा कक्षों विदारक मैं विदारक के साथ के रूप में निंदा के रूप में नहीं हैछोटे चरणों के लिए ndividual ovarioles.

नोट: चरण 14 अंडे कक्षों के लिए, संदंश का उपयोग करने के लिए अभिविन्यास के लिए पृष्ठीय appendages के समझ.

5. इंजेक्शन तैयारी

नोट: मध्य चरण oocytes के इंजेक्शन के लिए, पूरबी ovarioles लंबरूप कवर पर्ची की लंबी अक्ष.

1. [हमारे मामले में एप्लाइड प्रेसिजन से DeltaVision कोर] इमेजिंग खुर्दबीन पर बारी और उचित इमेजिंग सेटिंग्स (चित्रा 5A बी) लोड.
2. इंजेक्शन उपकरण (चित्रा 5C) ​​पर बारी.
3. लोड हो रहा है टिप (चित्रा 5D - ई) के साथ इंजेक्शन सुई लोड. इंजेक्शन समाधान उच्च गति से जा संक्षिप्त Centrifuged जमा है कि इंजेक्शन सुई ब्लॉक हो सकता है से बचना चाहिए.
4. लोड इंजेक्शन सुई सुई लगानेवाला के लिए देते हैं. ध्यान रखना सुई (चित्र 5F) को तोड़ने से बचने के लिए.
5. के unclogging सुइयों के साथ सहायता करने के लिए, एक कट या टूटी हुई coverslip से गिलास 2x10 मिमी की एक छोटा सा टुकड़ा जगहटी तेल ovarioles युक्त ड्रॉप के एक तरफ. सुनिश्चित करें कि इस गिलास टुकड़ा तेल में कवर किया जाता है. यह गिलास सुई टिप राम के खिलाफ तोड़ने या unclogging सुई के लिए की सेवा करेंगे.

6. फ्लोरोसेंट शाही सेना का इंजेक्शन

इससे पहले कि आप शुरू: इंजेक्शन उपकरण और सूक्ष्म जोड़तोड़ ऐसी है कि इंजेक्शन सुई देखने के क्षेत्र के केंद्र पर तैनात है नियंत्रण सेट करें.

1. माउंट नमूना खुर्दबीन मंच पर इंजेक्शन.
2. 20x उद्देश्य का चयन करें. अधिक या कम बढ़ाई उद्देश्यों को भी इस्तेमाल किया जा सकता है.

नोट: बिंदु पर जाकर क्षमता के साथ एक स्वचालित मंच का उपयोग यदि यह उचित है कि शुरुआत से पहले इंजेक्शन के लिए 8-9 oocytes सभी चरण के निशान. यह आसान पर जाकर और चयनित oocytes के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है.

3. कम इंजेक्शन सुई जब तक यह तेल छू. केंद्र उद्देश्य लेंस पर सुई टिप.
4. मोड़कमरे में रोशनी से दूर है और माइक्रोस्कोप के लिए प्रकाश उज्ज्वल मैदान पर बारी. चिह्नित अंक सूची पर पहला बिंदु का चयन करें (oocyte) के. हालांकि oculars के माध्यम से देख, oocyte (6A चित्रा) पर ध्यान केंद्रित.
5. सुई मैन्युअल रूप से कम जब तक यह oocyte और दिखाई oocyte के लिए अगले के रूप में ध्यान की एक ही विमान में है.
6. जोड़तोड़ नियंत्रण का प्रयोग, इंजेक्शन सुई के बिंदु को स्थानांतरित जब तक यह के oocyte अंदर है. एक तेजी से आंदोलन छुरा अक्सर एक धीमी गति से अग्रिम की तुलना में अधिक सफल है. एक बार अंदर, एक छोटी मात्रा सुई से बेदखल और नेत्रहीन प्रभाव का आकलन, दोहराना के रूप में आवश्यक है. यदि इंजेक्शन सफल है, oocyte अंदर cytoplasm, विस्थापित किया जाएगा यदि यह स्पष्ट नहीं है, दोहराने. यह प्रतिदीप्ति में छवि के लिए निर्धारित अगर सामग्री अंतःक्षिप्त किया गया है करने के लिए आवश्यक नहीं है. इंजेक्शन के बाद, सुई oocyte (चित्र 6B जी) के अंदर से हटा दें.
7. तरल पदार्थ की सटीक राशि इंजेक्शन quantitate मुश्किल है. इंजेक्शन की मात्रा, adju में वृद्धिदबाव या इंजेक्शन नाड़ी के समय सेंट, सुई टिप को तोड़ने के लिए खोलने थोड़ा बढ़ या दोहराया इंजेक्शन दालों का उपयोग करें.

नोट: पूरे इंजेक्शन प्रक्रिया कम से कम 10 सेकंड ले जब ठीक से मार डाला जाना चाहिए. व्यापक छुरा या सुई oocyte के लिए अंदर के साथ सुस्त अंडा कक्ष को गंभीर क्षति में परिणाम होगा.

8. अगले चिह्नित oocyte का चयन करने से पहले, तेल में इंजेक्शन की सुई पर्याप्त उच्च इतना के रूप में यात्रा के रास्ते में नहीं अन्य oocytes संपर्क करने के लिए बढ़ा.
9. नई oocyte, 6.6 कदम दोहराएँ. पर ले जाने के इस तरह से जब तक सभी आवश्यक oocytes इंजेक्ट कर रहे हैं.

नोट: यदि एक गलती जबकि इंजेक्शन किया जाता है, अगले चिह्नित oocyte करने के लिए कदम. क्षतिग्रस्त oocytes पर समय बर्बाद मत करो.

नोट: सुई एक इंजेक्शन सत्र के दौरान भरा हो सकता है. इस मामले में, coverslip पर तेल में कांच का टूटा टुकड़ा करने के लिए आसन्न सुई चाल. बुद्धिगिलास और एक ही फोकल हवाई जहाज़ में सुई घंटे, धीरे से गिलास (चित्रा 6) में सुई राम. टेस्ट कि सुई इंजेक्शन बटन धक्का और देख अगर कोई भी तरल पदार्थ सुई की नोक रास्ते को unclogged है.

10. जब सब oocytes इंजेक्शन किया गया है, मैन्युअल रूप से सुई को स्थानांतरित और माइक्रोस्कोप के लिए किरण पथ के पूरबी बाहर तेल के बाहर. लगता है कि यह एक सुरक्षित ओरिएंटेशन में है, नेत्र क्षति से बचने के.

नोट: यदि समय की एक विस्तारित अवधि अंडे कक्ष अलगाव और oocyte इंजेक्शन के बीच में बीत गया है, oocytes मुश्किल हो इंजेक्षन और प्ररूपी परिवर्तन तनाव के साथ जुड़े प्रदर्शन करेंगे. इसी तरह के मुद्दों के oocyte या अधिक संस्करणों के इंजेक्शन (आंकड़े 6I तुलना, जम्मू, कश्मीर) के किसी न किसी से निपटने के साथ उत्पन्न कर सकते हैं.

7. इमेजिंग प्रयोगात्मक डिजाइन लाइव

1. सूची से पहले इंजेक्शन oocyte का चयन करें. परीक्षण है कि इमेजिंग प्रतिदीप्ति में एक फ्रेम (एक इंजेक्शन के के oocyte अंदर था6G चित्र में).
2. उत्तेजना तरंगदैर्ध्य, उत्सर्जन पथ, उत्तेजना समय, Z-ढेर और संग्रह के बीच समय: प्रयोगात्मक मापदंडों कॉन्फ़िगर. नोट: इस पर अधिक जानकारी के लिए, Parton के आर, एट अल. ² (2010).
3. डेटा सेट को इकट्ठा करो.

8. प्रतिनिधि परिणाम

एलेक्सा 546 GRK शाही सेना संश्लेषित इन विट्रो :: Me31B में GFP अंडा कक्ष (चित्रा 7A) में इंजेक्ट किया. शाही सेना को oocyte की पृष्ठीय पूर्वकाल के लिए localizes और नाभिक के चारों ओर एक टोपी (चित्रा 7B) रूपों. शाही सेना स्थानीयकरण का अधिक उदाहरण के लिए MacDougall एन, एट अल देखें. (2003) ^11.

मध्य और देर चरण के oocytes व्यक्त फ्लोरोसेंट लेबल (ताउ GFP, 7C चित्रा) प्रोटीन या शाही सेना टैगिंग सिस्टम (GRK * mCherry, चित्रा 7D) इंजेक्शन के बिना imaged किया जा सकता है.

आकृति 1.

चित्रा 2.

चित्रा 3.

चित्रा 4.

चित्रा 5.

6 चित्रा.

7 चित्रा.

Discussion

लाइव सेल इमेजिंग वास्तविक समय में सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक शक्तिशाली परख है. सरल उज्ज्वल क्षेत्र अवलोकन के अलावा, लेबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन और ब्याज की RNAs के अलावा कई सफलताओं के लिए नेतृत्व किया है. यहाँ हम इमेजिंग व्यक्ति रहने वाले oocytes कि आनुवंशिक और जैव रासायनिक assays के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है के लिए एक प्रोटोकॉल रेखांकित किया है.

इस प्रोटोकॉल में, हम भी समझा कैसे प्रयोगात्मक इंजेक्शन द्वारा रहने वाले oocytes में हेरफेर. इंजेक्षन सामग्री के लिए परख फ्लोरोसेंट लेबल शाही सेना संश्लेषित प्रत्यक्ष शाही सेना (गेंद और डेविस, अप्रकाशित) स्थानीयकरण और एंटीबॉडी कि ⁶ प्रोटीन के समारोह को बाधित करने के लिए एक माध्यमिक संरचना की क्षमता इन विट्रो सहित कई संभावनाएं हैं. भविष्य के काम की संभावना अन्य लेबलिंग घटकों और रहने वाले oocytes आणविक तंत्र का परीक्षण किया जा करने के लिए सक्षम करने के लिए सेलुलर तंत्र की शुरूआत देखेंगे.

टी "> और ऊतक की व्यवहार्यता और स्वास्थ्य के संरक्षण आवश्यक है जब जीवित कोशिकाओं के साथ काम कर रहा है. इस प्रोटोकॉल में, हम बाहर कदम है कि अंडा कक्ष के तनाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की एक संख्या बिंदु उदाहरण के लिए तेल इमेजिंग के लिए बेहतर होने के बावजूद, तेल में विस्तारित संस्कृति अंडा कक्ष पर तनाव का नेतृत्व यह आसानी से परमाणु आकारिकी और स्थिति, oocyte झिल्ली है कि विकृत छाला और तनाव के तहत (Figure7F चित्रा 7E (निर्बल) की तुलना परीक्षण करके किया जा सकता है उज्ज्वल क्षेत्र जोखिम के तहत निगरानी कर सकते हैं. ( ) पर बल दिया) स्टेज 9 अंडा कक्षों के शाही सेना स्थानीयकरण और कई घंटे से अधिक सीमा सेल ¹² प्रवास दिखाने हालांकि, एक मंच के 7/8 अंडे कक्ष हेलो कार्बन तेल में बीमार प्रभाव से हटा दिया जा रहा है अंडाशय के लगभग 40 मिनट के बाद प्रदर्शन शुरू हो जाएगा. महिला. स्वर्गीय चरण अंडा कक्षों, 14 से 11 मंच, सामान्य रूप से या इन ¹³ चरणों में कूप कोशिकाओं से अंडे का खोल के स्राव के कारण तेल जलीय मीडिया में विकसित कर सकते हैं यह रेपो किया गया है.में rted कि इंसुलिन के जलीय कीट मध्यम अलावा 6 से ¹⁴ घंटे और germaria 14 ¹⁵ घंटे के लिए चरण 9 oocytes बनाए रखने कर सकते हैं. सभी मामलों में, अंडा कक्ष की आक्रामक चालों से परहेज किया जाना चाहिए क्योंकि यह oocytes जोर दिया है और इसकी व्यवहार्यता को कम कर देता है. इमेजिंग अंडा कक्षों कम और देखभाल लेने के इलाज के प्रत्येक धीरे इष्टतम व्यवहार्यता सुनिश्चित करने का सबसे अच्छा तरीका है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0)	Any Supplier		A good quality brush is important
Halocarbon Products Corporation, Series 95	Halocarbon Products Corp.		European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil.
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T
Dumont No.5 - Dumostar	Fine Science Tools	11253-20	"Biologie" tip is also good but more fragile
Dissecting probe	Fine Science Tools	10140-01
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ61
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)	European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads
KimCare	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Microscope- DeltaVision	Applied Precision	DC-CORE
Micromanipulator	Burleigh	Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300	http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo)
Injection apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1	Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips
Injection needle	Eppendorf	930000043	Different tips are better for different applications
Loading tips 20μl	Eppendorf	5242956.003
Dry active yeast	Fleischman’s	#2192