Forbereder Individuell Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Summary

Det

Abstract

Live-cell imaging er en viktig teknikk som brukes på en rekke Drosophila vev som brukes som modeller for å undersøke temaer som aksen spesifikasjon, celledifferensiering og organogenesen ^en. Riktig forberedelse av de eksperimentelle prøvene er en viktig, ofte neglisjert, step. Målet med forberedelse er å sikre fysiologiske relevans og å etablere optimale imaging forhold. For å opprettholde vev levedyktighet, er det avgjørende å unngå dehydrering, hypoksi, overoppheting eller medium forringelse ^to.

Den Drosophila egg kammeret er et godt etablert system for å undersøke spørsmål knyttet, men ikke begrenset til kropp mønster, mRNA lokalisering og cytoskeletal organisasjon ^3,4. For tidlig-og midt-trinns egg kamre, montering i halocarbon olje er bra for overlevelse i at det tillater fri spredning av oksygen, forhindrer dehydrering og hypoksi og har ypperlige optiske egenskaper for mikroskopi. Imaldring av fluorescerende proteiner er mulig gjennom innføring av transgener inn i egget kammer eller fysisk injeksjon av merket RNA, proteiner eller antistoffer ^5-7. For eksempel, gjør tillegg av MS2 konstruksjoner til genomet hos dyr sanntid observasjon av mRNA i oocyte ^8. Disse konstruerer tillate for in vivo merking av mRNA gjennom utnyttelse av MS2 bakteriofag RNA stammen sløyfe samspill med pelsen protein ^9.

Her presenterer vi en protokoll for utvinning av eggstokkene, samt isolere individuelle ovarioles og egg kamre fra den kvinnelige Drosophila. For en detaljert beskrivelse av Drosophila oogenesen See Allan C. Spradling (1993, gjengitt 2009) ^10.

Protocol

1. Drosophila forberedelser før for disseksjon (Ifølge E. Gavis, Princeton University)

1. Kast de voksne fra en tynt seedet flaske og overføre flasken til 25 ° C i forkant av eksperimentet. Når nye voksne har begynt å dukke opp, vente to dager.
2. Ta en flue hetteglass som inneholder ca 10ml av fast føde og legge 0,5-0,7 gram tørrgjær (se tabell) på en 45 graders vinkel. Ikke dekker hele overflaten av flua mat med gjær.
3. Tilsett noen dråper vann til gjæren, tilstrekkelig til hydrat (figur 1A). Plasser hetteglasset på 45 grader og la ca 3 minutter for gjær å suge opp vannet (figur 1B).

Merk: Alternativt premiks en gjær lime i en egen beholder og legge av masse på hetteglasset med en slikkepott.

4. Anesthetize fluene i hetteglasset ved å injisere CO ₂ gass. Når de slutter å bevege, tippe de ubevisste fluene på CO ₂
5. Isoler 10-15 kvinner og 5 menn med ønsket genotype under en dissekere omfang med en fin spiss pensel (figur 1D). Hannene er åpenbare ved tilstedeværelse av claspers, en mørk utstående struktur, ved posterior deres.
6. Legg til valgte fluer til yeasted hetteglasset (figur 1E). Plasser ved 25 ° C i 24-60 timer. Inkuber i kortere tidsperioder for en større prosent av unge til midten av scenen egg kamre og lengre tidsperioder for sent stadium egg kamre.

2. Drosophila eggstokk disseksjon

1. Plasser en liten dråpe halocarbon olje på en 1,5 No, 22 x 50 mm dekkglass (Figur 2A). Sett forberedt dekkglass til siden der det ikke vil være i veien.
2. Anesthetize fluene i yeasted vile ved å injisere CO ₂ gass og tips på en CO ₂ pad.
3. Bruk skarpe fine nosed pinsett til å gripe en individuell fet kvinnelig ved fremre av magen (ikke mellom the abdomen og thorax) (figur 2B-C).
4. Hold den kvinnelige med tang og vise under et dissekere mikroskop, 2-3 cm over den klargjorte dekkglass.
5. Fremdeles holder på fremre, bruke et annet sett av tang for å fjerne vev ved ekstreme bakre av de kvinnelige (figur 2D). Merk: Gut vev vil vanligvis trekke ut med den bakre enden. Tørk fjernet vev fra tang.
6. Mens han fortsatt holder den kvinnelige ved fremre, bruke tørket tang til å forsiktig presse eller massere magen, arbeider fra anterior mot bakre. Masser magen på samme måte som å fjerne tannkrem fra slutten av en tube.
7. To store ugjennomsiktige konstruksjoner vil bli skjøvet fra magen og stikke på slutten av tang (Figur 2E-F). Dette er de sammenkoblede eggstokkene.
8. Trykk eggstokkene på halocarbon olje på lysbildet nedenfor.
9. Gjenta disseksjon 1-2 ganger for å gi en totalt 4-6 eggstokkene i oljen på dekkglass (Figure 2G).

3. Isolere ovarioles

Merk: Hver eggstokk inneholder cirka 16 ovarioles består av 6 til 10 egg kamre i ulike stadier arrangert som perler på en snor. ^10.

Merk: Før isolere ovarioles, justere lys kilde på dissekere mikroskop slik at belysningen slår på en grunne vinkel til prøven. Dette gir kontrast til prøven og tillater visualisering av de unge scenen egg kamre.

1. I oljen, skiller de to eggstokkene ved å fjerne koble vev på bakre enden (gamle etapper) med lukkede tang (figur 3A).
2. Orient en individuell eggstokk med de eldste stadiene til venstre og yngste scenen til høyre. De unge scene egg kamrene i eggstokken er transparente og danne mer spisse enden av eggstokken.
3. Med en pinsett i den dominerende hånden, forsiktig tak i bakre av en eggstokk, fortrinnsvis ved restene av the bindevev. Mens du holder eggstokken på plass med tang, bruker du en dissekere sonde (eller tungsten nål) å lokke ut enkelte ovarioles (Figur 3B-D).

Merk: Individuelle ovarioles vil bryte mellom de unge stadier (germarium å iscenesette 10) som de eldre stadiene er for store til å bli atskilt fra hele eggstokken.

Merk: punktering et sent stadium oocyte med dissekere sonden vil resultere i cytoplasma lekker inn i oljen og gjøre uttak av individuelle ovarioles svært utfordrende. Hvis et sent stadium oocyte er punktert, flytte til en frisk eggstokk.

4. Når ovariole er fri for eggstokk, bruke dissekere sonden å dra den til midten av oljen dråpe og orientere i ønsket retning for forsøket. Merk: Ovarioles i olje vil bosette og følge glasset.
5. Gjenta denne prosessen (03.03-03.04) til det er 15-25 individuelle ovarioles. Merk: Dette kan kreve disseksjon av flerfasemodelleringle eggstokkene. Hele prosessen bør ta mindre enn 15 minutter.

Merk: Det anbefales å dissekere en eggstokk hver fra flere fluer i stedet dissekere begge eggstokkene fra færre fluer å øke n antall fluer for forsøket.

Merk: Røff håndtering av ovariole vil resultere i usunne oocytter og kan føre til artefakter i forsøket.

Merk: oocytter vil begynne å vise fenotypiske endringer som følge av stress 40 minutter etter å ha blitt dissekert fra eggstokken (sammenlign figur 7E til F).

6. Når ovarioles er i en tilstrekkelig orientering (Figur 3E), bruker dissekere sonden og lukkede pinsett til å flytte overflødig eggstokkvev ut av oljen. Dette materialet kan tørkes fra tang på et papirhåndkle.

4. Isolere individuelle sent stadium egg kamre (ifølge E. Gavis, Princeton University)

1. Med en pinsett i Dominmaur hånd, ta tak i bakre av en isolert eggstokk, fortrinnsvis ved restene av bindevev. Mens du holder eggstokken på plass med tang, introdusere dissekere sonden inn i bakre enden av eggstokk nær tang (Figur 4A). Unngå punktering eventuelle egg kamre ved å sette inn sonden mellom sent stadium egg kamre.
2. Trekk dissekere nålen gjennom eggstokken til det kommer ut på et tidlig stadium egg kamre (Figur 4B). Når gjort riktig, vil sonden fjerne bindevevet holder ovarioles og sent stadium egg kammer på plass.
3. Gjenta trinn 4,2 inntil ovarioles er spredt ut på dekkglass. Merk: Når egg kamrene er ikke lenger stablet oppå hverandre, er dette trinnet fullført.
4. Bruke dissekere sonden, skille slutten eggceller for å gi enkel bildebehandling (Figur 4C).

Merk: punktering en eggcelle mens dissekere sent stadium egg kamre er ikke så fordømte som med dissekere jegndividual ovarioles for yngre stadier.

Merk: For sceniske 14 egg kamre, bruke tang til å gripe dorsal vedheng til orientering.

5. Injeksjon forberedelse

Merk: For injeksjon av midten scenen oocytter, orientere den ovarioles vinkelrett på lange aksen av dekkglass.

1. Slå på bildebehandling mikroskop [i vårt tilfelle en DeltaVision Core fra Applied Precision] og laste inn de riktige innstillingene imaging (Figur 5A-B).
2. Slå på injeksjon apparatet (figur 5C).
3. Legg injeksjonsnålen med en lasting spissen (Figur 5D-E). Løsninger som skal injiseres bør sentrifugeres kort i høy hastighet for å unngå avleiringer som kan blokkere kanylen.
4. Fest den lastede kanylen til injektoren. Pass på å unngå å bryte nålen (figur 5F).
5. For å hjelpe med unclogging nåler, plasserer en liten glassbit 2x10 mm fra et kutt eller ødelagt dekkglass ent den ene siden av oljen dråpe inneholder ovarioles. Pass på dette glasset fragment er dekket i olje. Dette glasset vil tjene til ram nålespissen mot for å bryte eller unclogging nålen.

6. Injeksjon av fluorescerende RNA

Før du begynner: Sett opp injeksjon apparater og mikro-manipulator kontroller slik at kanylen er plassert over midten av synsfeltet.

1. Monter prøven som skal injiseres på mikroskopet scenen.
2. Velg 20x objektiv. Høyere eller lavere forstørrelse målene kan også brukes.

Merk: Hvis du bruker en automatisert scenen med poeng besøke evnen er det tilrådelig å markere alt på scenen 8-9 egg til injeksjon før du begynner. Dette sørger for enkel besøk og injeksjon av utvalgte oocytter.

3. Senk injeksjonsnålen til den berører olje. Sentrer nålespissen over objektiv.
4. Slåav de lamper og slå på den lyse-feltet lys for mikroskop. Velg det første punktet (eggcelle) på den markerte punkter listen. Mens du ser gjennom okulars, fokusere på oocyte (Figur 6A).
5. Senk nålen manuelt inntil det er på samme planet av fokus som oocyte og synlig ved siden av oocyte.
6. Bruke manipulator kontrollene, flytte punktet av kanylen før den er inne i oocyte. En rask knivstikking bevegelse er ofte mer vellykket enn en langsom forhånd. Inne mate ut en liten volum fra nålen og visuelt vurdere virkningene, gjenta etter behov. Hvis injeksjonen er vellykket, vil cytoplasma inne i oocyte bli fortrengt, dersom dette ikke er tydelig, gjenta. Det er ikke nødvendig å bilde i fluorescens for å fastslå om materialet har blitt injisert. Etter injeksjon, fjernes kanylen fra innsiden av oocyte (Figur 6B-G).
7. Den nøyaktige mengden av væske injisert er vanskelig å quantitate. For å øke injisert volum, adjust trykket eller tidspunktet for injeksjonen puls, bryte nålespissen å øke åpningen litt eller bruke gjentatte injeksjon pulser.

Merk: Hele injeksjon prosessen bør ta mindre enn 10 sekunder når gjennomføres riktig. Omfattende knivstikking eller dvelende med nålen på innsiden for å oocyte vil resultere i alvorlig skade på egg kammeret.

8. Før du velger neste markerte oocyte, heve kanylen høyt nok i oljen slik at det ikke kontakt med andre oocytter i reisebransjen banen.
9. På den nye oocyte, gjenta trinn 6.6. Fortsett på denne måten til alle de nødvendige eggceller blir injisert.

Merk: Hvis en feil blir gjort mens injiserer, gå til neste merket oocyte. Ikke kast bort tiden på skadede oocytter.

Merk: Nålen kan bli tettet i løpet av en injeksjon økt. I dette tilfellet flytte nålen rett ved ødelagt stykke glass i olje på dekkglass. With glasset og nålen på samme fokusplanet, forsiktig ram nålen i glasset (figur 6H). Test at nålen er unclogged ved å skyve injeksjon knappen og se om noe væske ut av nålespissen.

10. Når alle eggceller har blitt injisert, manuelt flytte nålen opp, ut av oljen og innrette den ut av strålen banen for mikroskop. Pass på at det er på en sikker orientering, for å unngå øyeskader.

Merk: Hvis en lengre periode har gått mellom egg kammer isolasjon og oocyte injeksjon, vil ubefruktede egg være vanskelig å injisere og stille fenotypiske endringer knyttet til stress. Lignende problemer kan oppstå med røff håndtering av oocyte eller injeksjon av overskytende volumer (sammenlign Tall 6I, J, K).

7. Live bildebehandling eksperimentell design

1. Velg den første injiseres oocyte fra listen. Test at injeksjonen var inne i oocyte av tenkelig en ramme i fluorescens (ens i figur 6G).
2. Konfigurer eksperimentelle parametre, inkludert: eksitasjon bølgelengde, utslipp sti, eksitasjon tid, Z-stack og tid mellom samlingene. Merk: For mer informasjon om dette, se Parton R., et al. (2010) ^2.
3. Samle datasettet.

8. Representative Resultater

In vitro syntetisert Alexa-546 Grk RNA injiseres i et Me31B :: GFP egg kammer (Figur 7A). RNA lokaliserer til dorsal anterior av oocyte og danner en hette rundt kjernen (figur 7B). For flere eksempler på RNA lokalisering se Macdougall N., et al. (2003) ^11.

Midten og slutten av sceniske oocytter som uttrykker fluorescerende merket protein (Tau-GFP, Figur 7C) eller RNA tagging systemer (Grk * mCherry, figur 7d) kan avbildes uten injeksjon.

Figur 1.

Figur 2.

Figur 3.

Figur 4.

Figur 5.

Figur 6.

Figur 7.

Discussion

Live-celle imaging er en kraftig analysen for å undersøke cellulære prosesser i sanntid. I tillegg til enkle lyse felt observasjon, har tilsetning av fluorescerende etiketter til proteiner og RNA av interesse føre til mange gjennombrudd. Her har vi skissert en protokoll for imaging individuelle levende egg som kan benyttes i kombinasjon med genetiske og biokjemiske analyser.

I denne protokollen, vi også forklare hvordan man eksperimentelt manipulere levende egg ved injeksjon. Det er mange muligheter for materiale til å injisere, herunder in vitro syntetisert fluorescerende merket RNA til analysen muligheten for en sekundær struktur til direkte RNA lokalisering (Ball og Davis, upublisert) og antistoffer som hemmer funksjonen av proteiner ^6. Fremtidig arbeid vil trolig se innledningen av andre merking komponenter og cellulære maskiner til levende egg slik at molekylære mekanismer som skal testes.

t "> Bevare levedyktigheten og helse av vevet er viktig når man arbeider med levende celler. I denne protokollen, peker vi ut en rekke tiltak som kan føre til stress av egg kammeret. For eksempel, til tross for olje være overlegen for bildebehandling, Utvidet kultur i oljen kan føre til stress på egg kammeret. Dette kan enkelt overvåkes under lyse felt eksponering ved å undersøke den kjernefysiske morfologi og posisjon, oocyte membran som vil forvrenge og bleb under stress (sammenlign figur 7E (trykklette) til Figure7F ( stresset)). Stage 9 egg kamre viser RNA lokalisering og grensen celle migrasjon ¹² over flere timer. Men en scene 7/8 egg kammeret vil begynne å vise negative effekter i Halo karbon olje etter ca 40 minutter av eggstokken blir fjernet fra kvinnelige. sent stadium egg kamre, scene 11-14, kan utvikle seg normalt i enten olje eller vandige media på grunn av utskillelse av egg skallet fra follikkelen cellene ved disse stadiene ^13. Det har vært reported at tillegg av insulin til vandig insekt medium kan opprettholde scene 9 egg i inntil 6 timer ¹⁴ og germaria opptil 14 timer ^15. I alle tilfeller bør aggressiv manøvrering av egg kammeret unngås, da det fremhever de eggceller og reduserer dens levedyktighet. Imaging færre egg kamre og ta vare å behandle hver er forsiktig den beste måten å sikre optimal levedyktighet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0)	Any Supplier		A good quality brush is important
Halocarbon Products Corporation, Series 95	Halocarbon Products Corp.		European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil.
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T
Dumont No.5 - Dumostar	Fine Science Tools	11253-20	"Biologie" tip is also good but more fragile
Dissecting probe	Fine Science Tools	10140-01
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ61
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)	European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads
KimCare	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Microscope- DeltaVision	Applied Precision	DC-CORE
Micromanipulator	Burleigh	Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300	http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo)
Injection apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1	Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips
Injection needle	Eppendorf	930000043	Different tips are better for different applications
Loading tips 20μl	Eppendorf	5242956.003
Dry active yeast	Fleischman’s	#2192