Opprette Forbigående cellemembranen Porer med en vanlig blekkskriver

Summary

En beskrivelse av metodene som brukes til å konvertere en HP DeskJet 500-skriver til en bioprinter. Skriveren er i stand til å behandle levende celler, som forårsaker forbigående porene i membranen. Disse porene kan utnyttes til å innlemme små molekyler, inkludert fluorescerende G-aktin, inn i trykte cellene.

Abstract

Bioprinting har et bredt spekter av bruksområder og betydning, herunder tissue engineering, direkte celle søknad terapi, og biosensor microfabrication. ^1-10 Nylig har termisk blekkutskrifter også blitt brukt til genet transfeksjon. ^8,9 Den termiske blekkutskrifter prosessen ble vist til midlertidig forstyrre cellemembranene uten å påvirke celleviabilitet. De forbigående porene i membranen kan brukes til å innføre molekyler, som ellers ville være for stort til å passere gjennom membranen, i cellenes cytoplasma. ^8,9,11

Søknaden blir demonstrert her er bruk av termisk blekkskriver for inkorporering av fluorescensmerkede g-aktin monomerer inn i cellene. Fordelen med å bruke termisk blekk-jet utskrift å injisere molekyler i cellene er at teknikken er forholdsvis godartet til cellene. ^{8, 12} celleviabilitet etter utskrift er vist å være lik standard celle PLAterende metoder ^1,8. I tillegg kan blekkutskrifter behandle tusenvis av celler i løpet av minutter, som er mye raskere enn manuell mikroinjeksjon. Porene er laget av utskrift har vist seg å lukke innen ca to timer. Men det er en grense for størrelsen på porene opprettet (~ 10 nm) med denne utskrift teknikk, noe som begrenser teknikk for å injisere celler med små proteiner og / eller partikler. ^8,9,11

En standard HP DeskJet 500-skriveren ble modifisert for å tillate celle utskrift. ^{3, 5, 8} dekselet på skriveren ble fjernet og papirmating mekanismen var forbigått ved hjelp av en mekanisk spak. En scene ble opprettet for å tillate plassering av mikroskop lysbilder og Dekkglass direkte under skrivehodet. Blekkpatroner ble åpnet, blekket ble fjernet og de ble renset før bruk med celler. Trykkeriet mønsteret ble opprettet ved hjelp av standard tegneprogrammer, som deretter kontrollert skriveren via en enkel print kommando. 3T3 fibroEksplosjonene ble dyrket til samløpet, trypsinized, og deretter resuspendert inn fosfatbufret saltløsning med oppløselige fluorescensmerkede g-aktin monomerer. Cellesuspensjonen ble pipetteres blekkpatronen og linjer av cellene ble trykket på glass mikroskop dekke slips. De levende cellene ble fotografert ved hjelp av fluorescens mikroskopi og aktin ble funnet i hele cytoplasma. Inkorporering av fluoriserende aktin i cellen tillater avbildning av kort tid cytoskeletal dynamikk og er nyttig for et bredt spekter av bruksområder. ^13-15

Protocol

1. Konvertering HP DeskJet 500

Det bør bemerkes at denne teknikken skal fungere med mange kommersielt blekkskrivere. Men eldre skrivere tendens til å fungere bedre som de bruker blekkpatroner med større diameter dyser, som ikke tetter så lett. I tillegg eldre skrivere tendens til å bruke mekaniske innmatingsproblemer sensorer som er lettere å omgå. Skrivere med optiske sensorer kan bli lurt, men med en liten stripe av papir helt på kanten av skriveren i hver syklus, men er litt vanskeligere enn det mekaniske systemet til "trikset". De øyeblikket kommersielt tilgjengelige skrivere som fungerer best har lav oppløsning (DPI).

Høyere oppløsning skrivere tendens til å tette lettere. Oppløsningen av HP Deskjet 500 er 300 DPI. Det er mange kommersielt tilgjengelige skrivere (HP Deskjet-serien og andre) som har en oppløsning på 600 DPI. Denne type skriver kan brukes med bare en liten økning i dysetilstopping problemer som kan lindres ved hjelp av grundig rengjøring (§ 3).

1. Fjern den øverste plastkasse på skriveren ved å låse opp flere plastklemmer fra bunnen bunnen av skriveren og sakte løfte toppen av.
2. Skru knapp / skjerm lys panel fra toppen av skriveren, slik at den koblet til skriverens hovedkort.
3. Rengjør innsiden av skriveren, spesielt de områdene hvor blekkpatronen hviler og hvor utskriften oppstår.
4. Finn kablene som forsyner innmatingsproblemer mekanismene og koble dem fra hovedkortet.
   1. I HP DeskJet 500, er disse funnet like nedenfor papirskuffen mot venstre foran.
5. Finn papir deteksjon mekanisme. Bypass mekanismen ved påsetting en streng eller wire loop å tjene som en manuell håndtak.
   1. I HP DeskJet 500, er papiret deteksjon mekanismen en grå plast spak funnet over og bak utskrift / papirmating mekanisme.
6. Lag en scene foran papirinnmatingsområdet mekanismen (hvor papiret skulle mates fra og deponeres) for å bringe de ønskede utskrift lysbilder til et nivå like under kassetten skrivehodet.
   1. For våre eksperimenter, ble skum Shipping holder i 15 ml sentrifugerør brukes med flere objektglass tapede på plass i utskriften regionen for å bringe det endelige nivået på lysbildene til ønsket høyde.
7. For å opprettholde aseptisk teknikk, kan skriveren plasseres inne i et standard biologiske skap eller bord laminær hette.
8. Det er viktig å merke seg at endring av en kommersielt tilgjengelig blekkskriveren vil vanligvis annullere skriverprodusenten garanti.

2. Konvertering Stock HP blekkpatroner (HP 26 svart blekkpatron)

1. Ta patronen ut av emballasjen, forlater beskyttelsesteipen dekker skriveren kontakter og skrivehode for tiden.
2. Stabilisere kroppenav kassetten (sort del) enten med en klemme eller skrustikke (bare godt å ta tak i kassetten for hånd vanligvis fungerte også), forlater den grønne øverst klar av noen hindring.
3. Bruk tang eller en skiftenøkkel, ta tak i grønne toppen av kassetten og vri frem og tilbake flere ganger før det bryter fri.
   1. Dette bør ikke ta mye makt, men toppen er ikke lenger nødvendig, så det er greit hvis det bryter når du fjerner den.
4. Ved hjelp av skrutrekkere, lirke av klar plast stykke nå utsatt.
   1. Igjen, dette bør ikke ta mye makt, men det vil ikke være nødvendig, så det er greit hvis det bryter under fjerning.
5. Tøm ut alt fra reservoaret.
6. Fjern plasten beskyttelsesteipen dekker skriveren kontaktene og skrivehode.
7. Skyll magasinene med vann.
   1. Bruk en pipette eller sprøyte å presse vann gjennom kanalene.
   2. Vann vil sannsynligvis lekke fra skrivehodet underdenne prosessen, dette er akseptabelt, og ikke forårsaker noen skade funksjonaliteten av kassetten.
8. Når vannet renner klart, la kassetten for å tørke.

3. Rengjøring Blekkpatron

1. For å opprettholde et rent utskrift miljø, bør blekkpatronen rengjøres før og etter bruk.
   1. Dette hjelper også med å unngå krystallisering av salter og annet biologisk materiale i kassetten som kan forårsake blokkeringer.
2. Fullt senk kassetten i et begerglass full av de-ionisert vann, og sonicate i 15 minutter før og etter utskrift.
3. Etter sonikator, ta kassetten fra vannet, og rist ut overflødig vann.
4. Spray 70% etanol inn i kassetten for å skape et mer aseptisk miljø.
   1. Sørg for at etanol har tørket før du legger den bioink utskriftsløsning.

4. Making cellesuspensjon - "Bioblekk "

1. Kultur celler til den er klar til passasje.
   1. For 3T3 fibroblaster: Seed celler på T-75 flasker ved ca 1.3x10 ⁴ celler / cm ² i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) med 10% fostermedisin Bovine Serum (FBS). Kultur celler for to dager i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO _2.
2. Gjør fluorescerende g-aktin stamløsning på konsentrasjon 50 mg / ml i fosfatbuffer Solution (PBS).
3. Passage celler.
   1. For 3T3 fibroblaster: Ta ut mediet fra flaska og skyll to ganger med PBS. Dekk celler med 5 ml 0,25% Trypsin + EDTA og inkuber i 5 minutter.
   2. Tilsett 5 ml av frisk medium og pipetter cellesuspensjonen til en 15 ml konisk sentrifugerør og sentrifuger ved 1000 rpm i 5 min. Aspirer brukt medium.
4. Resuspender cellene i PBS med fluorescerende g-aktin stamoppløsning å skape bioink.
   1. Bioink bør ha en endelig konsentrasjon på G-aktin på 10 mikrogram / ml og en celle concentration av 1x10 ⁵ celle / ml. Denne konsentrasjonen har blitt optimalisert for å begrense mengden av celler per dråpe og tilstopping av skriveren hodet. ⁸
   2. Merk at 250 mL av bioink skriver tre forsider slips med mønster vist i figur 2.

5. Bioprinting

1. Slå på og la skriveren varmes opp.
2. Plasser ønsket utskrift overflate (her bruker vi 22 mm x 22 mm Dekkglass) på midten av scenen utarbeidet i trinn 1.6.
3. Lag en utskrift mønster fil.
   1. Åpne Microsoft Word (eller en annen tegning programvare), og tegne ønsket mønster.
   2. Plukk en ønsket utskrift mønster for celle utskrift i forhåndslagde filen.
4. Legg forberedt patron med ønsket cellesuspensjon.
   1. Pipetter suspensjon inn i de små sirkulære godt på bunnen av kassetten kupé. Bruk ca 100-120 mL av løsning. Den trykte dråpestørrelsen er rundt 130picoliters ^8.
5. Skriv ut filen med HP Deskjet 500-skriver.
   1. For best resultat, skrive ut mindre mønstre flere ganger (5), ved å endre mengden av eksemplarer ønsket i tekstbehandlingsprogram.
6. Skriveren vil varmes opp igjen, så kassett vil flytte til "klar stilling".
7. Når kassetten flytter inn i klar stilling (litt til venstre for blekk drypp godt under og blir der), trekk opp på papiret fôret mekanismen wire, og utskrift skal starte.
   1. For flere kopier av utskrift, vil papirmating mekanismen må bli løslatt etter hver syklus eller siden skrives ut. Kassetten vil da gå tilbake til "klar" posisjon, og papirmating mekanismen ledning bør heves igjen.
8. Skriveren skriver ut på dekkglass plassert på midten av utskrift scenen i trinn 5.2 (se figur 2).

6. Representative resultater </ P>

De representative resultatene av hele konverteringen av en standard, off-the-sokkel HP Deskjet 500, vil standard HP 26 serien kassetter opprette en skriver med mulighet for utskrift celle løsninger for mange typer analyser som nevnt før. Den ferdige skriveren etter konvertering er vist i figur 3, med en utskrift scene å plassere mikroskop dekkglass på. Skriveren kan være nyttig i analysen på mange felt, inkludert men ikke begrenset til: encellete mekanikk, tissue engineering, genet transfeksjon, biosensor micropatterning, og direkte cellen terapi ^{1-10, 16-22.}

I dette eksemplet ble en HP Deskjet 500-skriver og HP 26 serien blekkpatroner modifisert for bioprinting. Ved hjelp av denne installeringen av skriveren med en bioink bestående av en fibroblast cellesuspensjon i en g-actin monomer løsning, ble cellene trykket på glass mikroskop Dekkglass. Figur 1 illustrerer representative res ults av trykte fibroblast celler, som viser inkorporert fluorescerende aktin monomerer. Resultatene ble oppnådd i et kontrollert aseptisk miljø der cellene ble trykt inn tilpassbare mønstre.

Mønsteret som brukes i dette eksemplet ble opprettet i Microsoft Word (figur 2). Dette mønsteret skapte en sammenhengende linje av utskriftsløsningen over mesteparten av objektglass. Figur 4 viser rett linje der bioink og celler er gjensidig deponert. Det bør bemerkes at umiddelbart etter utskrift, er det en økning på bakgrunnsfluorescens fordi bioink løsning, der cellene er suspendert, inneholder gratis overskytende fluoriserende aktin monomerer. Dette bakgrunnsfluorescens avtar betydelig etter tilsetning av vekstmedier på cellene (Figur 1), som vasker overflødig monomer fra underlaget.

ad/3681/3681fig1.jpg "/>
Figur 1. Representative bilder av 3T3 fibroblaster 3 timer etter utskrift ved hjelp av modifisert blekkskriver. Interiøret i cellene viser innlemmet fluorescently taggede aktin monomerer. Skala søylene representerer 50 mikrometer.

Figur 2. Design brukte til å skrive bioink.

Figur 3. Skriver etter konvertering med Styrofoam scenen. Den oransje ledningen i midten forbigår papirinnmatingsområdet spaken sensor.

Figur 4. Representant bilde av 3T3 fibroblaster trykt i et lokalisert utskrift sone. Mikroskopi bilde tatt 5 minutter etter utskrift på 20x forstørrelse.

/ Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/>
Figur 5. Fluorescence bilde (40x forstørrelse) tatt 3 timer etter utskrift som viser en fibroblast med internaliserte fluorescerende aktin monomerer. Scale linjen representerer 50 mikrometer.

Figur 6. Fluoriserende mikroskopi (20x forstørrelse) av en celle tatt 15 minutter etter utskrift. Bildet viser både g-aktin (grønn) og kjernen (blå). Fra venstre til høyre: g-aktin med Alexa Fluor 488, kjerne med DAPI, og et overlegg av begge.

Figur 7. Fluoriserende mikroskopi viser to fibroblaster i en linje mønster 3 timer etter utskrift. Bildet til venstre viser fluorescensmerkede aktin monomerer inni cellene. Bildet til høyre er en overlapping av fluoriserende kanalen med bakgrunnsbildet for å vise at selv omdet kan være noe rusk på lysbildet (nederst til venstre hjørne), betyr det ikke fluoresce. Skala søylene representerer 50 mikrometer hvis størrelsen ikke indisert lengst til høyre er en kontrollgruppe av ikke-trykte celler inkubert i 3 timer med fluorescently kodede monomere. Denne kontrollen er å vise at monomerer ikke kunne trenge gjennom cellemembranen uten membran permeabilization av celle utskrift.

Discussion

Prosessen for å konvertere en standard blekkskriver bordskriver for bioprinting er ikke spesielt vanskelig. Det mest utfordrende trinnet er å avgjøre hvordan å omgå papirmatingen mekanismen, som er avhengig av merke og modell av skriveren som brukes. Men dette er relativt enkelt når papirinnmatingsområdet sensoren er mekanisk som beskrevet her. For modeller med optiske fôr sensorer, kan andre teknikker må være ansatt for å lure skriveren til å tro det er å bruke papir, for eksempel kan man kjøre et lite stykke papir gjennom skriveren mens det skrives på objektglass. Omgåelsen papirinnmatingsområdet mekanismen er sannsynligvis den vanskeligste trinnet i å anvende disse prosedyrene til forskjellige skrivermodeller.

Når du bygger en scene for å holde Dekkglass for utskrift, er det viktig å sikre riktig justering og høyde. Scenen skal tillate for dekkglass å bli plassert i midten av utskrift området. I tillegg bør det pless dekkglass på en tilstrekkelig høyde for å tillate klarering for blekkpatronen til å passere over lysbilde uten å forstyrre den. Den nøyaktige høyden på scenen vil avhenge av skrivermodell.

For å sikre at trykte cellene ikke får vasket bort, ble lysbildene plassert i en kuvøse umiddelbart etter utskrift i ca 30 minutter for å tillate celle vedlegg før ytterligere celle vekstmedier ble lagt til. Fordi cellene ble trykket i en løsning som inkluderer store mengder PBS cellene ikke tørker ut og holdt seg levedyktig. Celler ble fotografert med fluorescens mikroskopi for å visualisere fordelingen av de kodede g-aktin monomerer inne i cellen (figur 1, 5-7). Når du skriver med 3T3 fibroblaster, viser figur 5 et representativt resultat, med aktin forårsaker mye av cellen for å fluoresce, men utstillingsvindu linjer med økt lysstyrke. Inkorporering av fluorescently merket g-aktin i cytoskjelettet ernyttig for studiet av cytoskeletal dynamikk og cellulære mekanikere. ^12-15 En begrensning av denne teknikken er at det er kun aktuelt for molekyler og proteiner som har diameter mindre enn ca 10 nm.

For å sikre at cellene ble faktisk blir behandlet av den konverterte skriveren, ble DAPI (1:5000 i PBS) tilsettes bioink i stedet for halvparten av volumet av ren PBS. Den fluoriserende flekken DAPI bindes til aminosyren rike deler av DNA som ligger i kjernen. Derfor DAPI er en nyttig flekk i fluorescently avbildning kjerner av de trykte cellene. Figur 6 viser et representativt bilde av en celle som viser både Alexa Fluor 488 (aktin) og DAPI (nucleus) fluorescens med en overlay bilde av begge. Figur 7 illustrerer også hvordan cellene vil fluoresce gang har g-aktin monomerer blitt innarbeidet mens ikke-biologisk materiale som har blitt satt inn på prøven ikke vil fluoresce grunn av absence av g-aktin monomerer.

Et viktig hensyn for bioprinting er de vandige media blir brukt for bioink. Det ble funnet at bruk av standard celle vekstmedier med serum gitt inkonsistente resultater. Dette er mest sannsynlig på grunn av tilstopping av print-head dyser ved serumproteiner. Bruken av PBS økt konsistens av trykte mønstre og antall celler avsatt. En ulempe med å bruke PBS er at cellene ikke skal bli stående i suspensjon i lengre perioder av gangen. Imidlertid var fibroblaster i disse eksemplene kunne tolerere de bioink forholdene for minst en time med ingen endring i celle levedyktighet. Dette er konsistent med flere tidligere funn, som rapporterer at celler skrives ut via termiske inkjet mekanismer har vist seg å ha høye levedyktighet priser. ^2-8

Denne modifiserte skriveroppsettet kan brukes til andre formål enn celle utskrift. ^16-22 Matrix proteiner, slik som kollagen eller fibronectin, kan lett skrives på underlag med denne teknikken, som kan være nyttig for celle mønster. For eksempel, kollagen type trykte jeg inn linje mønstre vil resultere i justerte kollagen underlag som kan brukes for in vitro cellekultur-studier. ^17. I tillegg til matrix proteiner, andre molekyler, inkludert vekstfaktorer, kan pålitelig lokalisert på underlag for cellestudier og potensielle terapeutiske bruksområder ^18.

En viktig begrensning av designet er beskrevet i punktene ovenfor, er at denne skriveren ikke er i stand til å skrive i mer enn én dimensjon. Dette begrenser potensialet for bruk i mønstrede applikasjoner som stillaset utskrift. For å tillate 3D-utskrift, trenger et spesialisert scene som skal brukes. Scenen må ha inkrementell høydejusteringer for lag-by-lag deponering av bioink.

Bioprinting har vist lovende som en effektiv og kostnadseffektiv metode for tissue engineering, Genet transfeksjon, micropatterning og microarray fabrikasjon ^{1-12, 16-22} De fremtidige anvendelser av denne typen enhet er mange, inkludert:. Etablering av kontrollerte og mønstrede cellulære microenvironments, innlemmelse av makromolekyler i cellen cytoplasma, og deponering av celler på stillasene og strukturer som ikke forekommer naturlig eller effektivt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HP DeskJet 500	Hewlett-Packard	C2106A	Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader.
HP 26 Black Ink Cartridge	Hewlett-Packard	51626A
Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg	Invitrogen	A12373
Phosphate Buffered Saline (PBS)	MP Biomedicals	ICN1860454
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH3002201
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F4135
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Used at 0.5% in cell culture media
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Used at 0.5% in cell culture media
Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco	VLF 797	Optional housing for keeping printer aseptic