Summary
Eine Beschreibung der Methoden benutzt, um einen HP DeskJet 500 Drucker in einen bioprinter konvertieren. Der Drucker verarbeiten kann lebende Zellen, die transiente Poren in der Membran bewirkt. Diese Poren können verwendet werden, um kleine Moleküle, einschließlich fluoreszierender G-Actin, in die gedruckte Zellen einzubauen.
Abstract
Bioprinting verfügt über eine breite Palette von Anwendungen und die Bedeutung, einschließlich Tissue Engineering, direkte Zell-Therapien Anwendung, und Biosensor-Mikrofabrikation. 10.1 Vor kurzem hat Thermo-Inkjet-Druck auch für die Gen-Transfektion verwendet worden. 8,9 Der Thermo-Inkjet-Druckverfahren wurde gezeigt, zeitweilig den Zellmembranen ohne Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Die transiente Poren in der Membran verwendet werden, um Moleküle, die ansonsten zu groß, um durch die Membran hindurchgehen, würde in das Cytoplasma der Zelle. 8,9,11 einzuführen
Die Anwendung, die hier gezeigt ist die Verwendung von thermischen Tintenstrahldruck für den Einbau von fluoreszenzmarkierten Aktinmonomere in Zellen. Der Vorteil der Verwendung thermischen Tintenstrahldruck, um Moleküle in Zellen zu injizieren ist, dass die Technik relativ gutartigen für Zellen ist. 8, 12 Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Drucken wurde gezeigt, dass ähnlich wie Standard-Zelle PLAting-Methoden 1,8. Darüber hinaus können Tintenstrahldrucksystem Tausende von Zellen in Minuten verarbeiten, der viel schneller, als wenn die Mikroinjektion. Die Poren, die durch Druck erstellt wurde gezeigt, dass innerhalb von zwei Stunden zu schließen. Es gibt jedoch eine Grenze für die Größe der Poren erzeugt (~ 10 nm) mit dieser Drucktechnik, die die Technik begrenzt, um die Injektion von Zellen mit kleiner Proteine und / oder Partikel. 8,9,11
Ein Standard-Drucker HP DeskJet 500 wurde modifiziert, um für die Zell-Druck zu ermöglichen. 3, 5, 8 Die Abdeckung des Druckers wurde entfernt und der Papiereinzug war umgangen werden mit Hilfe eines mechanischen Hebels. Eine Bühne wurde geschaffen, um für die Platzierung von Objektträgern und Deckgläsern direkt unter dem Druckkopf zu ermöglichen. Tintenpatronen geöffnet wurden, wurde die Tinte entfernt und sie wurden vor ihrer Verwendung mit Zellen gereinigt. Die Druckmuster wurde erstellt unter Verwendung von Standard-Software Zeichnung, die dann kontrolliert den Drucker über einen einfachen Befehl print. 3T3-FibroBlasten wurden bis zur Konfluenz gezüchtet, mit Trypsin behandelt, und dann in Phosphat-gepufferter mit löslichen fluoreszenzmarkierten Aktinmonomere Kochsalzlösung. Die Zellsuspension wurde in die Tintenpatrone pipettiert und Zeilen-Zellen wurden auf Glas-Deckgläschen gedruckt. Die Live-Zellen wurden aufgenommen mit Fluoreszenzmikroskopie und Aktin wurde während der gesamten Zytoplasma gefunden. Der Einbau von fluoreszierenden Aktin in die Zelle ermöglicht zum Abbilden der Kurzzeit-Zytoskeletts und wurde für eine breite Palette von Anwendungen nützlich. 13-15
Protocol
1. Die Umwandlung des HP DeskJet 500
Es sei darauf hingewiesen, dass diese Technik sollte mit vielen kommerziell Tintenstrahldrucker arbeiten. Allerdings neigen ältere Drucker besser zu funktionieren, wie sie Tintenpatronen mit größerem Durchmesser Düsen, die nicht verstopfen nicht so leicht zu benutzen. Darüber hinaus neigen ältere Drucker mechanische Papierzuführung Sensoren, die leichter zu umgehen können verwendet werden. Drucker mit optischen Sensoren kann ausgetrickst werden, aber mit einem kleinen Streifen Papier auf dem äußersten Rand des Druckers bei jedem Zyklus, ist aber ein bisschen schwieriger als das mechanische System zu "Trick". Die derzeit im Handel erhältlichen Drucker, die die beste Arbeit haben niedrige Auflösung (DPI).
Höhere Auflösung Drucker tendenziell leichter verstopfen. Die Auflösung des HP Deskjet 500 von 300 dpi. Es gibt viele im Handel erhältlichen Drucker (HP Deskjet Serie und andere), die eine Auflösung von 600 DPI haben. Diese Art von Drucker kann mit nur einem geringen Anstieg der Düse verwendet werdenFragen, die Verstopfung lindern mit sorgfältiger Reinigung werden (Abschnitt 3) können.
- Entfernen Sie die obere Plastikgehäuse des Druckers durch das Entriegeln mehrerer Kunststoff-Clips von der unteren Boden des Druckers und langsam Heben Sie die Spitze.
- Abschrauben Taste / Anzeige Leuchtplatte von der Oberseite des Druckers, so dass es an den Drucker der Hauptplatine verbunden.
- Reinigen Sie das Innere des Druckers, vor allem die Bereiche, in denen die Tintenpatrone ruht und wo Druck auftritt.
- Suchen Sie die Kabel Stromversorgung der Papiertransportmechanismen und ziehen Sie sie aus dem Motherboard.
- In der HP DeskJet 500, werden diese direkt unter der Papierkassette auf die linke Seite der Vorderseite.
- Suchen Sie Papier Erkennungsmechanismus. Umgehen Sie den Mechanismus, durch Anbringen einer Schnur oder Drahtschlinge als Handzuggriff dienen.
- In der HP DeskJet 500 ist das Papier Mechanismus zur Erkennung einer grauen Kunststoff-Hebel oberhalb und hinter dem Druck / Papier Zuführmechanismus gefunden.
- Erstellen Sie eine Bühne vor den Papiereinzug (wo das Papier aus würde gefüttert werden und abgelagert), um die gewünschten Druck-Folien auf ein Niveau knapp unterhalb der Patronen-Druckkopf bringen.
- Für unsere Experimente wurde der Schaum Versandkosten Halter für 15 ml Zentrifugenröhrchen mit mehreren Objektträger in in dem Druckbereich mit Klebeband an die letzte Stufe der Folien auf die gewünschte Höhe zu bringen verwendet.
- Um aseptische Technik zu halten, kann der Drucker in einem Standard-biohazard Schrank oder auf dem Tisch Sterilbank platziert werden.
- Es ist wichtig zu beachten, dass die Modifizierung eines handelsüblichen Tintenstrahl-Drucker wird in der Regel Schäden sind von der Herstellergarantie.
2. Konvertieren Stock HP Tintenpatronen (Schwarz HP 26 Tintenpatronen)
- Nehmen Sie die Patrone aus der Verpackung, so dass die schützende Schutzstreifen von den Kontakten und Drucker Druckkopf für den Augenblick.
- Stabilisieren den Körperder Kartusche (schwarz Portion) entweder mit einer Klammer oder Schraubstock (einfach fest Greifen Sie die Patrone mit der Hand gearbeitet als auch in der Regel), so dass die grüne Spitze frei von jedem Hindernis.
- Mit einer Zange oder einem verstellbaren Schraubenschlüssel, fassen Sie die grüne Oberseite der Patrone und drehen hin und her, einige Male, bis er bricht frei.
- Dies sollte nicht viel Kraft, aber die Spitze wird nicht mehr benötigt, so ist es okay, wenn es beim Entfernen sie bricht.
- Mit Schraubendreher, abhebeln durchsichtigen Kunststoff Stück jetzt ausgesetzt.
- Auch dies dürfte sich nicht viel Kraft, aber es wird nicht nötig sein, so ist es okay, wenn es während der Entfernung bricht.
- Restlicher aus dem Reservoir.
- Entfernen Sie die Kunststoff-Schutz-Schutzstreifen von den Drucker-Kontakte und Druckkopf.
- Gründlich spülen die Reservoirs mit Wasser.
- Verwenden Sie eine Pipette oder Spritze, um Wasser durch die Kanäle schieben.
- Wasser wird wahrscheinlich aus dem Druckkopf lecken währendDieses Verfahren, das akzeptabel ist, und nicht nachteilig auf die Funktionalität der Patrone.
- Bei klarem Wasser läuft, lassen Sie die Patrone, um zu trocknen.
3. Reinigung Tintenpatrone
- Um eine saubere Druckumgebung zu halten, ist die Tintenpatrone vor und nach Gebrauch gereinigt werden.
- Dies hilft auch mit der Vermeidung Kristallisation von Salzen und anderen biologischen Materials in der Kartusche, die Verstopfungen führen kann.
- Voll tauchen die Patrone in ein Becherglas voll von de-ionisiertem Wasser, und beschallen für 15 Minuten vor und nach dem Druck.
- Nach der Beschallung, entfernen Sie die Patrone aus dem Wasser, und schütteln Sie überschüssiges Wasser ab.
- Spray 70% Ethanol in die Patrone, um eine keimfreie Umgebung zu schaffen.
- Sicherstellen, dass das Ethanol wurde vor Aufnahme des bioink Drucklösung getrocknet.
4. Machen Zellsuspension - "BioTinte "
- Kultur-Zellen erst unmittelbar vor der Passage.
- Für 3T3-Fibroblasten: Samen Zellen auf T-75-Kolben bei etwa 1.3x10 4 Zellen / cm 2 in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Kultur Zellen für zwei Tage in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Machen fluoreszierenden G-Aktin-Stammlösung mit einer Konzentration 50 ug / ml in Phosphatpuffer (PBS).
- Passage-Zellen.
- Für 3T3 Fibroblasten: Entfernen Sie das Medium aus Kolben und zweimal mit PBS spülen. Decken-Zellen mit 5 ml 0,25% Trypsin + EDTA und Inkubation für 5 Minuten.
- 5 ml frisches Medium pipettieren und die Zellsuspension in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 1000 rpm für 5 min. Saugen Sie verbrauchte Medium.
- Die Zellen in PBS mit fluoreszierenden G-Actin-Stammlösung zu bioink erstellen.
- Bioink sollte eine Endkonzentration von G-Aktin von 10 pg / ml und einer Zelle concentration von 1x10 5 Zellen / ml. Diese Konzentration wurde optimiert, um Anzahl von Zellen pro Tropfen und Verstopfen des Druckkopfes zu begrenzen. 8
- Beachten Sie, dass 250 ul bioink drei Deckgläser mit dem Muster in Abbildung 2 dargestellt druckt.
5. Bioprinting
- Power on und damit der Drucker sich aufzuwärmen.
- Die gewünschte Druckoberfläche (hier verwenden wir 22 mm x 22 mm-Deckgläschen) auf der Mitte der Bühne im Schritt 1.6 hergestellt.
- Erstellen Sie ein Druckmuster-Datei.
- Öffnen Sie Microsoft Word (oder ein anderes Zeichen-Programm), und ziehen Sie das gewünschte Muster.
- Wählen Sie einen gewünschten Druckmuster für die Zell-Druck in der vorgefertigten Datei.
- Legen Sie das vorbereitete Kartusche mit gewünschten Zellsuspension.
- Pipette Suspension in die kleine kreisförmige auch an der Unterseite der Kartuschenkammer. Verwenden Sie etwa 100-120 ul Lösung. Die gedruckte Tropfengröße ist etwa 130Picoliter. 8
- Drucken Sie die Datei mit dem HP Deskjet 500 Drucker.
- Für beste Ergebnisse ausdrucken kleinere Muster mehrfach (5), durch Änderung der Anzahl von Kopien im Textverarbeitungsprogramm gewünscht.
- Drucker wird wieder aufwärmen, dann Kartusche wird auf die "ready position" zu bewegen.
- Als Patrone in die Ausgangsposition (leicht nach links von der Tinte tropft deutlich unter und bleibt dort) bewegt, ziehen Sie den Papiereinzug Draht und Drucken beginnen sollte.
- Für mehrere Kopien des Druckens wird die Papiervorschubmechanismusabschnitt müssen nach jedem Zyklus oder gedruckt erscheinen. Die Kassette wird dann an den "ready"-Position zurück, und der Papiereinzug Draht sollte wieder angehoben werden.
- Der Drucker wird auf das Deckglas auf die Mitte der Druckphase in Schritt 5.2 gesetzt (siehe Abbildung 2) zu drucken.
6. Repräsentative Ergebnisse </ P>
Die repräsentativen Ergebnisse der gesamten Umwandlungsprozess von einem Standard, off-the-shelf HP Deskjet 500, werden Standard-Patronen HP 26 Serie einen Drucker mit der Möglichkeit des Druckens Zelle Lösungen für viele Arten der Analyse, wie oben angegeben. Die fertige Drucker nach der Umwandlung wird in 3 gezeigt, mit einem Druck bis das Mikroskop Deckglas auf platzieren. Der Drucker kann in der Analyse nützlich in vielen Bereichen, einschließlich aber nicht beschränkt auf: einzelne Zelle Mechanik, Tissue Engineering, Gentransfektion, Biosensor Mikrostrukturierung und direkte Zelltherapien 1-10, 16-22.
In diesem Beispiel wurden ein HP Deskjet 500 Drucker und HP 26 Serie Tintenpatronen für Bioprinting geändert. Mit Hilfe dieser Einrichtung des Druckers mit einem bioink bestehend aus einem Fibroblasten-Zell-Suspension in einem G-Aktin Monomer-Lösung wurden die Zellen auf Glas-Mikroskop-Deckgläsern gedruckt. Abbildung 1 zeigt repräsentative res ultate von gedruckten Fibroblasten-Zellen, die eingearbeitet fluoreszierende Aktin Monomere zeigen. Die Ergebnisse wurden in einer kontrollierten aseptischen Umgebung, in der die Zellen in gestaltbare Mustern bedruckt wurden erhalten.
Das Muster in diesem Beispiel verwendet wurde in Microsoft Word (2) erstellt. Dieses Muster erzeugt eine durchgehende Linie von der Druck-Lösung über die Mehrheit der Objektträger. Abbildung 4 zeigt die gerade Linie, in der die Zellen gegenseitig bioink und abgelagert werden. Es sei darauf hingewiesen, dass unmittelbar nach dem Drucken, gibt es eine Zunahme der Hintergrund-Fluoreszenz, da die bioink Lösung, in der die Zellen suspendiert sind, enthält freie überschüssigen fluoreszierenden Actinmonomeren werden. Diese Hintergrundfluoreszenz signifikant abnimmt nach der Zugabe von Wachstumsmedium auf die Zellen (Abbildung 1), die überschüssige Monomer wäscht aus dem Substrat.
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Abbildung 1. Repräsentative Bilder 3T3 Fibroblasten 3 Stunden nach dem Druck mit dem modifizierten Tintenstrahldrucker. Das Innere der Zellen zeigen eingearbeitet fluoreszierend markierten Aktin-Monomeren. Maßstabsbalken repräsentieren 50 um.
Abbildung 2. Verwendet werden, um bioink Printdesign.
Abbildung 3. Drucker nach der Konvertierung mit Styrofoam Bühne. Das orange Kabel in der Mitte umgeht den Papiervorschub Hebel-Sensor.
4. Repräsentatives Bild-3T3-Fibroblasten in einem lokalisierten Druckzone gedruckt. Mikroskopie aufgenommene Bild 5 Minuten nach dem Druck bei 20-facher Vergrößerung.
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Abbildung 5. Fluoreszenzbild (40fache Vergrößerung) 3 Stunden nach dem Druck, die einen Fibroblasten mit verinnerlichten fluoreszierende Actinmonomeren genommen. Maßstabsbalken repräsentiert 50 um.
6. Fluoreszenzmikroskopie (20-facher Vergrößerung) einer Zelle 15 Minuten nach dem Druck gemacht. Das Bild zeigt sowohl g-Aktin (grün) und den Kern (blau). Von links nach rechts: G-Aktin mit Alexa Fluor 488, Kern mit DAPI, und einem Overlay aus beidem.
7. Fluoreszenzmikroskopie zeigt zwei Fibroblasten in einem Linienmuster 3 Stunden nach dem Drucken. Bild links zeigt fluoreszenzmarkierten Actinmonomeren innerhalb der Zellen. Bild rechts ist eine Überlagerung der Fluoreszenz-Kanal mit dem Hintergrundbild zu zeigen, dass obwohles können einige Rückstände auf der Folie (unten links) sein, ist das nicht fluoresziert. Maßstabsbalken repräsentieren 50 um, wenn Größe nicht angegeben Ganz rechts ist eine Kontrollgruppe von nicht bedruckten Zellen für 3 Stunden mit fluoreszierend markierten Monomeren inkubiert. Diese Kontrolle soll zeigen, dass Monomere konnte nicht die Zellmembran zu durchdringen, ohne Membranpermeabilisierung Zelle durch Druck.
Discussion
Der Prozess um einen handelsüblichen Tintenstrahl-Desktop-Drucker für Bioprinting konvertieren ist nicht besonders schwierig. Die größte Herausforderung Schritt ist die Bestimmung, wie man den Papiereinzug, die abhängig von der Marke und Modell des Druckers verwendet wird, ist zu umgehen. Dies ist jedoch relativ einfach, wenn die Papierzuführung Sensor mechanische wie hier beschrieben. Bei Modellen mit optischen Sensoren Feeds können auch andere Techniken müssen eingesetzt werden, um den Drucker zu denken, es wird die Verwendung von Papier Trick sein, zum Beispiel, kann man ein kleines Stück Papier durch den Drucker laufen, während es auf dem Objektträger druckt. Umgehen der Papiereinzug ist wahrscheinlich der schwierigste Schritt bei der Anwendung dieser Verfahren auf verschiedene Druckermodelle zu sein.
Wenn er eine Bühne, um die Deckgläser zum Drucken zu halten, ist es wichtig, die richtige Ausrichtung und Höhe festzulegen. Die Phase sollte das Deckglas in der Mitte des Druckbereichs gebracht werden können. Darüber hinaus sollte es plACE das Deckglas in ausreichender Höhe, damit Freiraum für die Druckpatrone zu übergehen die Folie ohne Unterbrechung es. Die genaue Höhe der Bühne wird vom Druckermodell ab.
Um sicherzustellen, dass Zellen nicht gedruckten weggewaschen zu werden, wurden die Objektträger in einem Inkubator sofort nach dem Druck für etwa 30 Minuten, um die Zellanheftung zu ermöglichen, bevor zusätzliche Wachstumsmedium zugegeben angeordnet. Da die Zellen wurden in einer Lösung, die große Mengen PBS werden die Zellen nicht austrocknen und lebensfähig geblieben sind gedruckt. Die Zellen wurden unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um die Verteilung der markierten Aktinmonomere innerhalb der Zelle (Fig. 1, 5-7) zu visualisieren. Beim Drucken mit 3T3-Fibroblasten, zeigt 5 ein repräsentatives Ergebnis, wobei die Aktin was viel der Zelle zu fluoreszieren, aber präsentiert Linien erhöhter Helligkeit. Der Einbau von fluoreszenzmarkierten G-Aktin in das Zytoskelett istnützlich für das Studium der Zytoskelett-Dynamik und zelluläre Mechanik. 12-15 Ein Problem bei dieser Vorgehensweise ist, dass es nur für Moleküle und Proteine, die einen Durchmesser kleiner als etwa 10 nm ist.
Um sicherzustellen, dass die Zellen tatsächlich wurden durch die umgewandelte Drucker verarbeitet wurde DAPI (1:5000 in PBS) an die bioink anstelle von Hälfte des Volumens an reinem PBS gegeben. Die Fluoreszenzfarbstoff DAPI bindet an Amino Säure-reichen Abschnitten der DNA im Kern lokalisiert. Deshalb DAPI ist ein nützliches Fleck in fluoreszierend bildgebenden Kerne der gedruckten Zellen. Abbildung 6 zeigt ein repräsentatives Bild einer Zelle angezeigt werden sowohl Alexa Fluor 488 (Aktin) und DAPI (Nukleus) mit einem Fluoreszenz-Overlay-Bild von beiden. Abbildung 7 zeigt auch, wie die Zellen werden einmal fluoreszieren die Aktinmonomere aufgenommen wurden, während nicht-biologische Material, das in der Probe abgeschieden wurde nicht aufgrund der Fluoreszenz absence von G-Aktin-Monomeren.
Eine wichtige Überlegung für Bioprinting ist das wässerige Medium wird für die bioink verwendet. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von Standard-Zellwachstum Medien mit Serum ergaben widersprüchliche Ergebnisse. Dies ist höchstwahrscheinlich aufgrund einer Verstopfung der Düsen-Druckkopf durch Serumproteine. Die Verwendung von PBS erhöht die Konsistenz der gedruckten Muster, und die Anzahl der Zellen abgeschieden. Ein Nachteil bei der Benutzung PBS ist, dass Zellen nicht in die Suspension für längere Zeit bleiben. Jedoch waren Fibroblasten in diesen Beispielen können die bioink Bedingungen für mindestens eine Stunde ohne Änderung der Lebensfähigkeit der Zellen zu tolerieren. Dies steht im Einklang mit mehreren vorherigen Befunden, wonach Zellen über Thermo-Inkjet-Mechanismen gedruckt wurde gezeigt, dass hohe Überlebensraten haben berichten. 8.2
Dieser modifizierte Drucker-Setup kann für andere Anwendungen als Zell-Druck verwendet werden. 16-22 Matrixproteine, wie Kollagen oder fibronectin, kann problemlos auf Substraten mit dieser Technik, die nützlich sein können für Zell-Musters gedruckt werden. Zum Beispiel, Kollagen Typ I in Linienmuster wird in Kollagen ausgerichtet Substrate, die für In-vitro-Untersuchungen an Zellkulturen. 17 verwendet werden Zusätzlich zu Matrixproteine, anderen Molekülen, einschließlich Wachstumsfaktoren führen kann gedruckt werden, können zuverlässig auf Substrate werden für die Zell-Studien lokalisiert und Potenzial für therapeutische Anwendungen. 18
Eine wesentliche Einschränkung des Designs in den oben beschriebenen Schritte ist, dass der Drucker nicht drucken kann in mehr als einer Dimension. Dies begrenzt das Potential für die Verwendung in Anwendungen wie strukturiert Gerüst Druck. Um 3D-Druck zu ermöglichen, muss eine spezielle Stufe verwendet werden. Die Bühne muss inkrementelle Höhenverstellungen für Schicht-für-Schicht-Abscheidung von bioink haben.
Bioprinting hat Versprechen als effizientes und kostengünstiges Verfahren für das Tissue Engineering gezeigt, Gentransfektion, Mikrostrukturierung und Microarray-Fertigung 1-12, 16-22 Die zukünftige Anwendungen dieser Art von Gerät es zahlreiche, unter anderem:. Schaffung gesteuert und strukturiert zelluläre Mikroumgebung, die Aufnahme von Makromolekülen in Zytoplasma, und die Ablagerung von Zellen auf Gerüsten und Strukturen, die natürlicherweise nicht vorkommen oder effizient.
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Thomas Boland für die Idee, die HP DeskJet-Drucker für die Zell-Druck bestätigen. Finanzierung für dieses Projekt von NSF RII-EPS-0903795 und NIH-K25 HL0922280.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
| HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
| Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3002201 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |
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