En beskrivelse av metodene som brukes til å konvertere en HP DeskJet 500-skriver til en bioprinter. Skriveren er i stand til å behandle levende celler, som forårsaker forbigående porene i membranen. Disse porene kan utnyttes til å innlemme små molekyler, inkludert fluorescerende G-aktin, inn i trykte cellene.
Bioprinting har et bredt spekter av bruksområder og betydning, herunder tissue engineering, direkte celle søknad terapi, og biosensor microfabrication. 1-10 Nylig har termisk blekkutskrifter også blitt brukt til genet transfeksjon. 8,9 Den termiske blekkutskrifter prosessen ble vist til midlertidig forstyrre cellemembranene uten å påvirke celleviabilitet. De forbigående porene i membranen kan brukes til å innføre molekyler, som ellers ville være for stort til å passere gjennom membranen, i cellenes cytoplasma. 8,9,11
Søknaden blir demonstrert her er bruk av termisk blekkskriver for inkorporering av fluorescensmerkede g-aktin monomerer inn i cellene. Fordelen med å bruke termisk blekk-jet utskrift å injisere molekyler i cellene er at teknikken er forholdsvis godartet til cellene. 8, 12 celleviabilitet etter utskrift er vist å være lik standard celle PLAterende metoder 1,8. I tillegg kan blekkutskrifter behandle tusenvis av celler i løpet av minutter, som er mye raskere enn manuell mikroinjeksjon. Porene er laget av utskrift har vist seg å lukke innen ca to timer. Men det er en grense for størrelsen på porene opprettet (~ 10 nm) med denne utskrift teknikk, noe som begrenser teknikk for å injisere celler med små proteiner og / eller partikler. 8,9,11
En standard HP DeskJet 500-skriveren ble modifisert for å tillate celle utskrift. 3, 5, 8 dekselet på skriveren ble fjernet og papirmating mekanismen var forbigått ved hjelp av en mekanisk spak. En scene ble opprettet for å tillate plassering av mikroskop lysbilder og Dekkglass direkte under skrivehodet. Blekkpatroner ble åpnet, blekket ble fjernet og de ble renset før bruk med celler. Trykkeriet mønsteret ble opprettet ved hjelp av standard tegneprogrammer, som deretter kontrollert skriveren via en enkel print kommando. 3T3 fibroEksplosjonene ble dyrket til samløpet, trypsinized, og deretter resuspendert inn fosfatbufret saltløsning med oppløselige fluorescensmerkede g-aktin monomerer. Cellesuspensjonen ble pipetteres blekkpatronen og linjer av cellene ble trykket på glass mikroskop dekke slips. De levende cellene ble fotografert ved hjelp av fluorescens mikroskopi og aktin ble funnet i hele cytoplasma. Inkorporering av fluoriserende aktin i cellen tillater avbildning av kort tid cytoskeletal dynamikk og er nyttig for et bredt spekter av bruksområder. 13-15
Prosessen for å konvertere en standard blekkskriver bordskriver for bioprinting er ikke spesielt vanskelig. Det mest utfordrende trinnet er å avgjøre hvordan å omgå papirmatingen mekanismen, som er avhengig av merke og modell av skriveren som brukes. Men dette er relativt enkelt når papirinnmatingsområdet sensoren er mekanisk som beskrevet her. For modeller med optiske fôr sensorer, kan andre teknikker må være ansatt for å lure skriveren til å tro det er å bruke papir, for eksempel kan man kjøre et lite stykke papir gjennom skriveren mens det skrives på objektglass. Omgåelsen papirinnmatingsområdet mekanismen er sannsynligvis den vanskeligste trinnet i å anvende disse prosedyrene til forskjellige skrivermodeller.
Når du bygger en scene for å holde Dekkglass for utskrift, er det viktig å sikre riktig justering og høyde. Scenen skal tillate for dekkglass å bli plassert i midten av utskrift området. I tillegg bør det pless dekkglass på en tilstrekkelig høyde for å tillate klarering for blekkpatronen til å passere over lysbilde uten å forstyrre den. Den nøyaktige høyden på scenen vil avhenge av skrivermodell.
For å sikre at trykte cellene ikke får vasket bort, ble lysbildene plassert i en kuvøse umiddelbart etter utskrift i ca 30 minutter for å tillate celle vedlegg før ytterligere celle vekstmedier ble lagt til. Fordi cellene ble trykket i en løsning som inkluderer store mengder PBS cellene ikke tørker ut og holdt seg levedyktig. Celler ble fotografert med fluorescens mikroskopi for å visualisere fordelingen av de kodede g-aktin monomerer inne i cellen (figur 1, 5-7). Når du skriver med 3T3 fibroblaster, viser figur 5 et representativt resultat, med aktin forårsaker mye av cellen for å fluoresce, men utstillingsvindu linjer med økt lysstyrke. Inkorporering av fluorescently merket g-aktin i cytoskjelettet ernyttig for studiet av cytoskeletal dynamikk og cellulære mekanikere. 12-15 En begrensning av denne teknikken er at det er kun aktuelt for molekyler og proteiner som har diameter mindre enn ca 10 nm.
For å sikre at cellene ble faktisk blir behandlet av den konverterte skriveren, ble DAPI (1:5000 i PBS) tilsettes bioink i stedet for halvparten av volumet av ren PBS. Den fluoriserende flekken DAPI bindes til aminosyren rike deler av DNA som ligger i kjernen. Derfor DAPI er en nyttig flekk i fluorescently avbildning kjerner av de trykte cellene. Figur 6 viser et representativt bilde av en celle som viser både Alexa Fluor 488 (aktin) og DAPI (nucleus) fluorescens med en overlay bilde av begge. Figur 7 illustrerer også hvordan cellene vil fluoresce gang har g-aktin monomerer blitt innarbeidet mens ikke-biologisk materiale som har blitt satt inn på prøven ikke vil fluoresce grunn av absence av g-aktin monomerer.
Et viktig hensyn for bioprinting er de vandige media blir brukt for bioink. Det ble funnet at bruk av standard celle vekstmedier med serum gitt inkonsistente resultater. Dette er mest sannsynlig på grunn av tilstopping av print-head dyser ved serumproteiner. Bruken av PBS økt konsistens av trykte mønstre og antall celler avsatt. En ulempe med å bruke PBS er at cellene ikke skal bli stående i suspensjon i lengre perioder av gangen. Imidlertid var fibroblaster i disse eksemplene kunne tolerere de bioink forholdene for minst en time med ingen endring i celle levedyktighet. Dette er konsistent med flere tidligere funn, som rapporterer at celler skrives ut via termiske inkjet mekanismer har vist seg å ha høye levedyktighet priser. 2-8
Denne modifiserte skriveroppsettet kan brukes til andre formål enn celle utskrift. 16-22 Matrix proteiner, slik som kollagen eller fibronectin, kan lett skrives på underlag med denne teknikken, som kan være nyttig for celle mønster. For eksempel, kollagen type trykte jeg inn linje mønstre vil resultere i justerte kollagen underlag som kan brukes for in vitro cellekultur-studier. 17. I tillegg til matrix proteiner, andre molekyler, inkludert vekstfaktorer, kan pålitelig lokalisert på underlag for cellestudier og potensielle terapeutiske bruksområder 18.
En viktig begrensning av designet er beskrevet i punktene ovenfor, er at denne skriveren ikke er i stand til å skrive i mer enn én dimensjon. Dette begrenser potensialet for bruk i mønstrede applikasjoner som stillaset utskrift. For å tillate 3D-utskrift, trenger et spesialisert scene som skal brukes. Scenen må ha inkrementell høydejusteringer for lag-by-lag deponering av bioink.
Bioprinting har vist lovende som en effektiv og kostnadseffektiv metode for tissue engineering, Genet transfeksjon, micropatterning og microarray fabrikasjon 1-12, 16-22 De fremtidige anvendelser av denne typen enhet er mange, inkludert:. Etablering av kontrollerte og mønstrede cellulære microenvironments, innlemmelse av makromolekyler i cellen cytoplasma, og deponering av celler på stillasene og strukturer som ikke forekommer naturlig eller effektivt.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke dr. Thomas Boland for ideen om å bruke HP DeskJet-skrivere for celle utskrift. Midlene til dette prosjektet fra NSF RII-EPS 0903795 og NIH K25 HL0922280.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3002201 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |