Summary
转基因小鼠已归咎于基因的生理功能极为有用。由于在一般情况下，例如，研究和呼吸道功能的研究，特别是经历了一个对小鼠模型显着的转变。在这里，我们提供的协议
Abstract
转基因和基因剔除小鼠的生理和病理生理学航空公司1,2的调查，已经强大的工具。 在体外离体气管准备tensometry已被证明是有用的气道平滑肌（ASM）的转基因小鼠的收缩反应检测。 在体外气管筹备的这些都是比较简单，提供了强有力的回应，并保留两个功能胆碱能神经末梢和肌肉反应，即使经过长时间的孵化。
气管tensometry还提供了一个功能试验，以研究各种第二信使的影响平滑肌收缩的信号转导通路。在气管的收缩主要是由副交感神经，上的ASM（ 图1），释放乙酰胆碱能神经介导。 ASM乙酰胆碱受体主要是毒蕈M2和M3 G I / O和Gq蛋白偶联受体，分别
在这里，我们提出了隔离小鼠气管环的协议，并在体外测量其收缩输出。包括设备配置的描述，气管环隔离和收缩测量。例子是唤起收缩间接使用高钾刺激神经 和直接由ASM的肌肉去极化，激活电压依赖性钙离子涌入（1。高K +， 图1）。此外，刺激神经 单独使用电场刺激（EFS时， 图1），或直接刺激肌肉的ASM使用外源性神经递质浴（3， 图1。外生的ACH）方法。这FLExibility和便于编制呈现的离体气管环模型参与气道平滑肌收缩的信号级联的一个强大和功能检测。
Protocol
1。设备
收缩测量设备的主要部件示意图如图2A所示）。
- 组织浴。组织沐浴在温暖的温度保持含氧的生理溶液。对小鼠气管环，我们使用循环变暖的解决方案，1熔块玻璃入口泡沫氧（95％/ 5％的O 2 / CO 2的混合物），进口和出口改变端口10毫升组织洗澡，包含了水套解决方案。水库的PSS解决方案存储不断冒泡的95％/ 5％的O 2 / CO 2的混合物在37℃水浴（未显示）。对于解决方案交流，PSS的解决方案是从水库抽水组织浴进口约100毫升每分钟（底部端口），允许较快的解决方案交流。解决方案的插座是通过溢流口（顶部的端口），允许在组织蝙蝠体积不变（〜10毫升）Ĥ在解决方案交流。我们使用了的哈克加热循环泵通过组织浴夹克的温水（保持37℃）。从供应商的数量可以得到组织浴场和各种尺寸和款式，以满足研究者的实验需要。
- 一个力传感器测量等距紧张，气管内管螺纹超过L形两端的两个不锈钢棒（ 图2A）。应小心使用不锈钢的类型是兼容生物材料。顶端杆连接通过等距力传感器剪辑。底部杆保持在一个固定位置的气管，并安装一个被动张力和/或肌肉长度调整微米。气管收缩创建力传感器的张力，这是一个前置放大器转换为电压信号。底部杆也可以被配置包括两个矩形铂板（4 mm处）T帽子侧面的气管（ 图2B）。铂金板被连接到一个基层S88的刺激，使整个气管电场交付。涂开放的电线和焊料，Sylgard（Sylgard 184硅橡胶，道康宁公司，美联，心肌梗死），沐浴液，防止浸金属。
- 上MacLab 8的A / D系统的A / D转换器，计算机和收购的软件，从前置放大器信号记录。这是当前ADInstrument PowerLab系统硬件的旧版本。我们使用的程序图（的ADInstruments），使整个实验过程中张力的连续记录。气管肌肉产生的张力是相当缓慢的，因此，我们发现，每秒100点的收购是足够的。每次实验前用已知重量（5克），张力测量校准。类似的系统是从其他厂商（例如，BIOPAC，毛重仪器）。
- 组织分离之前的力传感器校准与已知的重量，并组织浴充满正常的PSS（见表一）。进气口进行调整，以获得的O 2 / CO 2的光流。
- 从2个月或年纪较大的老鼠的气管是最优的。可用于年轻的动物，但是从这些获得的气管，需要更多的技能，由于其体积小，安装力传感器导线。解剖前，小鼠深感异氟醚镇静。适当的镇静水平达到时，用钳子捏脚趾是无法引起反应。立即处死小鼠颈椎脱位的一个重要说明：我们已经看到，Avertin（Tribromoethanol），小鼠常用的一种镇静，具有强大的气道平滑肌的松弛作用，因此不应使用气管收缩研究。
- 从胸部到喉咙的皮肤和毛皮被删除。 ŕIBS是削减从胸骨的基础上，横向（双方）的心脏上方。胸骨和肋骨，然后向前拉的喉咙，揭示了心脏/肺，胸腺，气管和食管（腹）（附 - 背到气管）。
- 由切割低于支气管分叉以上咽，气管切除。气管被放入冰冷的含氧（95/5）PSS的解决方案（表一中给出的组成）。
- 气管周围组织解剖干净。在清理过程中，气管，可在咽部或低于分叉举行。然而，应谨慎采取不直接适用于气管本身的镊子。罚款剪刀可用于切断周围组织，但始终平行于气管切，以避免损坏。促进这个过程的一部分，如果气管准备下面的分岔和咽部以上固定到Sylgard涂层菜（Sylgard 184硅胶弹性体，道康宁公司，美联，心肌梗死）。
- 消除周围组织后，气管被切断以下咽和支气管分叉以上，并轻轻地装上力传感器导线。
- 气管螺纹超过两个L形金属插脚（ 图2A）。一个插脚连接到一个等距紧张的连续记录的力 - 位移传感器。另一个插脚连接到一微米。然后抬起，使气管沉浸在PSS组织浴。气管的安装应尽快完成，以尽量减少时间，气管外的PSS举行。与实践，气管安装，可以在一分钟之内完成，但我们一般避免时间超过3分钟，以避免损失的可行性。
- 慢慢调整到微米〜10分钟（约1克力）获得的被动张力。确定最佳的休息紧张经验，我们发现，被动张力 - 1〜50 MN结果，在同等的，最大的高钾刺激的反应。这是利用16,17,18在此范围内的被动张力的其他研究一致。在5-10分钟，气管被动紧张倾向于有所下降（应力松弛的现象）和千分尺是用来调整在平衡〜10分钟的被动张力。气管被允许平衡实验的挑战前至少1小时。
3。含钾高的刺激
下面的平衡，气管被两次挑战与高钾PSS解决方案（67毫米氯化钾，表一）。收缩一般〜需要5-10分钟，以达到稳定状态的时间，组织浴是正常的PSS冲洗时间，完全放松气管。钾收缩重复第二次，第三次，直到重复性收缩（如有必要）获得。
气管两侧由两个矩形铂板（电极），使电场刺激（EFS）的准备。 EFS的收缩反应的频率和电压的功能。它也受到物理参数，如电极的面积和它们之间的距离。刺激的功率特性也影响等，在更高的电压和电流输出的刺激可以达到其最大的反应。任何EFS系统的特点，应确定通过检查肌肉收缩反应，在不同的刺激持续时间，频率，电压和脉冲持续时间。对于我们的实验装置，我们已经发现，分开〜4毫米的电极，刺激五（0.5毫秒脉冲）44和30 Hz振幅最优实现重复性附近最大收缩反应。
5。收缩EV由胆碱能刺激oked
此外，由一个单一剂量药物的兴趣或外加的化合物气管的反应进行评估，由多种药物的累积剂量的时尚增加。对于气管，我们实验室经常使用卡巴激活乙酰胆碱受体的卡巴，因为不同的乙酰胆碱，乙酰胆碱酯酶不降解。一个合理的剂量响应范围是从10-8到10-5中号卡巴。 [卡巴]收缩与山型方程的响应曲线拟合的日志允许欧共体50（半最大有效浓度）这是一个衡量气管收缩的敏感性胆碱能激动剂19的估计。值得注意的是，定剂量的卡巴将略大于作为一个单一的剂量累积剂量反应曲线的一部分的反应。
6。代表结果 如图3A所示的收缩反应含钾高的一个例子。收缩达到最大，约10分钟内，但以后可能会出现小幅下降。在早期高钾冲刷，肌肉可能会出现短暂的增加，是由于在温度下降，体积小，加热的PSS解决方案解决方案中的线路瞬时perfuses准备在收缩。这可以通过连接油管加热PSS水库和组织浴中有一个最低的死体积最小，也相对快速交换解决方案（一般在100毫升/分钟泵解决方案）。每个准备将收缩反应有一些差异，由于肌肉质量或剥离过程中所造成的危害后果的差异。 图3B显示了两个不同的肌肉质量高的钾和卡巴的挑战气管。虽然胆碱诱发的收缩不同，y是正常化后，以高钾溶液的反应（ 图3C）类似。
图4显示了一个1卡巴（胆碱）使用单剂量（A）和累积增加（二）诱发收缩的例子。卡巴的解决方案是直接添加到洗澡和冒泡的气体有助于在快速搅拌。这是值得注意此外，单剂量（即1微米， 图4A），比在累积剂量反应曲线（1μM， 图4B）当量浓度稍大的响应。 图4C显示了收缩力的阴谋作为卡巴浓度使用数据从图4B功能。卡巴的影响在10 10-5 M浓度饱和。虽然胆碱能激动剂启动通过钙释放机制的收缩，收缩的主要组成部分，也是介导的去极化和激活电压依赖性钙通道20。
图5A显示EFS的诱发宫缩的一个例子。气管受到刺激，使用时间0.5毫秒，40伏脉冲收缩，直到达到高原（见插图A1）。在刺激频率的增加，导致增加的收缩反应（频率响应曲线绘制图5B）。已被证明电场刺激唤起主要通过激活突触前神经收缩。肉毒毒素的作用，阻断神经递质的释放，阻止大多数的EFS诱发的收缩气管21证明了这一点。此外，河豚毒素，阻止Na +通道，也能抑制神经活动和消除气管回应的EFS代理。
T图图1。他的主要信号通路在离体气管准备。胆碱能支配气管平滑肌细胞的轴突终端显示。主要的信号转导通路是货币供应M3和M2-毒蕈乙酰胆碱受体激活（mAchR的）导致的IP3受体（M3）和cAMP的减少量（M2）钙释放。 M2受体（和一些M3受体的贡献）也引起胆碱诱发的去极化，激活L-型电压依赖性钙通道和钙离子内流。共同收缩剂和其效应是：1。高钾（平滑肌细胞和胆碱能神经轴突的去极化），2。电场刺激（EFS，胆碱能神经轴突的去极化）和3。外源性应用程序（如乙酰胆碱或卡巴胆碱剂直接激活毒蕈碱受体）。
用来测量气管收缩的设备示意图如图2。。力传感器，千分尺和组织浴室安装支持通过螺丝钳棒。气管环螺纹在顶部和底部的棒。在图中，组织浴定位下面的准备（即到力传感器安装在气管）。在收缩的研究，组织浴垂直移动洗澡的准备。 B.对于电场刺激的底部杆进行了修改，包括两个铂金板气管控股线横向安装。铂金板是由电线连接到一个刺激。
图3。含钾高的例子（67毫米）气管收缩反应。 （A）显示，含钾高的重复性重复反应。 （二）两种不同的气管收缩反应卡巴的例子。 （三）在B的气管反应是类似的，当正常化d到高的钾反应。
图4。卡巴引起的收缩的例子。 （一）使用单一剂量的卡巴胆碱诱导的收缩后冲洗。 （二）例气管（三）在A从B的峰值收缩的累积剂量反应曲线绘制作为卡巴浓度的功能。
图5。由电场刺激诱 发的收缩的例子。 （一）使用40伏，0.5毫秒脉冲，以及各种刺激频率的气管收缩电场刺激表示。插图是时间膨胀收缩在30赫兹。 （二）从A山顶收缩是plotte的作为刺激频率的函数D。
正常的PSS
| 盐 | 浓。（MM） | 量（克/ 2升） |
| 氯化钠 | 119 | 13.91 |
| 氯化钾 | 4.7 | 0.7 |
| KH 2 PO 4 | 1.18 | 0.32 |
| 硫酸镁4 x 7H 2 | 1.17 | 0.58 |
| 碳酸氢钠 | 18 | 3.02 |
| EDTA的 | 0.026 | 0.5米0.1毫升 |
| 葡萄糖 | 11 | 3.96 |
| 蔗糖 | 12.5 | 8.56 |
| 氯化钙 | 2 | 400毫升10毫米 |
高K + PSS的（NACl和氯化钾调整）
| 盐 | 浓。 （MM） | 量（克/ 2升） |
| 氯化钠 | 56.7 | 6.628 |
| 氯化钾 | 67 | 9.991 |
表1配方的PSS解决方案注 ：解每周新鲜，用超纯水水质，并储存在冰箱不超过5天，以避免污染增长。
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Discussion
这里介绍的协议提供了生理的准备，评估气道肌肉功能。我们一般同时操作3-4器官浴准备，但是，打包的系统，可以从供应商，允许同时测量高达8制剂（ADInstruments，世界精密仪器，和哈佛仪器）。我们利用力传感器的数量和组织器官浴相同的结果。然而，我们发现，电场刺激提供一些基于刺激电极大小，电极板之间的距离，和编制内电场的位置之间的细微差别的变异。因此，格外小心，应采取使尽可能相似领域的电极。
等距测力中最关键的参数之一是正常化收缩肌肉质量的变化，以弥补问题，或不同剂型之间的肌肉组织的健康。部分差异可以最小化，通过比较相似的年龄和性别相同（雌性小鼠往往会产生减少气管张力）动物。此外，我们还发现，正常化气管湿或干重，缺乏足够的精度，可能是由于小规模的小鼠气管。相反，使用多个，高钾，收缩是相当有利的。含钾高的收缩，一举两得。含钾高的收缩，出现“唤醒”气管肌肉，并确保收缩与实验的挑战出发前重现。含钾高的收缩也似乎是一个积极肌肉质量，是目前在编制准确正常化。因此，实验的张力测量归高钾收缩力往往表现为。此外，该制剂的质量可以使用高钾引起的合同评估离子。例如，我们发现，8 - 10周龄C57BL/6J雄性小鼠有很高的钾诱导收缩20±3.8分钟（平均值±标准差，N = 17）。如果气管准备合同远低于此范围内（低于12分钟或两个低于标准差的意思），那么它通常被视为“损坏”和实验利用。另外，在饱和胆碱能激动剂的最大张力的张力正常化也可使用。这是观察激动剂的敏感性变化非常有用，但可能会错过的变化，影响最大的收缩。
方法提出了使用电刺激胆碱能激动剂或激活收缩。胆碱能激动剂应用到组织浴直接激活平滑肌。相反，在温和的EFS刺激频率（高达25赫兹）的收缩多数是介导通过神经激活和释放的neurotransmitter 22。因此，研究者有机会探讨影响突触前/使用EFS的刺激神经介导的收缩剂。最后，研究表明，其他类型的细胞，如肥大细胞23，上皮细胞24，也影响收缩在离体气管准备。因此， 在体外小鼠气管准备提供了一些影响气道平滑肌收缩的细胞类型，强大的功能检测。
总之， 在体外气管准备的鼠标一直是特别有用，在分析影响气道功能的遗传变异。一些例子包括离子通道17,20,25,26，代谢受体27,28,29,30基因敲除分析，和下游的信号转导通路31。此外，抗原挑战鼠标经常被用于哮喘研究32和在体外准备气管收缩的变化，随之而来的哮喘以下发展提供了有益的试验。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是从创新和治疗气道疾病，NINDS的补助金（NS052574），防治中心和哮喘研究桑德勒计划拨款资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analogue-Digital Converter |  ADInstruments |
PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C) |
| Charting Software | ADInstrtuments |
LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
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