Summary
Transgene Mäuse sind äußerst nützlich bei der Zuschreibung physiologischen Funktion von Genen. Als solcher Forschung im Allgemeinen und funktionelle Untersuchungen der Atemwege, insbesondere, haben eine bemerkenswerte Verschiebung hin zu Mausmodellen unterzogen. Hier bieten wir Protokolle zur
Abstract
Transgene und Knockout-Mäusen wurden leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Physiologie und Pathophysiologie der Atemwege 1,2. In-vitro-tensometry von isolierten trachealen Vorbereitungen hat sich als nützlich Assay von glatten Muskelzellen der Atemwege (ASM) kontraktilen Antwort in gentechnisch veränderten Mäusen zu sein. Diese In-vitro tracheale Vorbereitungen sind relativ einfach, bieten eine robuste Antwort, und bewahren Sie sowohl funktionale cholinerge Nervenenden und Muskeln Antworten, auch nach langen Inkubationen.
Tracheale tensometry sowie als funktionelle Assays, um eine Vielzahl von Second-Messenger-Signalwege, die Kontraktion der glatten Muskulatur betreffen studieren. Kontraktion in der Luftröhre ist in erster Linie durch parasympathische, cholinerge Nerven, dass Acetylcholin freisetzen auf ASM (1) vermittelt. Die wichtigsten ASM Acetylcholin-Rezeptoren sind muskarinischen M2 und M3, G i / o und Gq gekoppelten Rezeptoren, die jeweils sind
Hier stellen wir Protokolle für die Isolierung von murinen Trachealringe und die in vitro-Messung ihrer kontraktilen ausgegeben. Enthalten sind Beschreibungen der Geräte-Konfiguration, Luftröhre Ring Isolation und kontraktilen Messungen. Es werden Beispiele für evozieren Kontraktionen indirekt mit hohem Kalium-Stimulation von Nerven und direkt durch Depolarisation von ASM Muskel zu spannungsabhängigen Calcium-Einstrom aktivieren gegeben (1. Hohe K +, Abbildung 1). Darüber hinaus werden Methoden zur Stimulation von Nerven allein mit elektrischen Feldes Stimulation (2. EFS, Abbildung 1), oder für eine direkte Stimulation der Muskulatur ASM mit exogenen Neurotransmitter, die auf die Badewanne (3. Exogene ACH, Abbildung 1) vorgestellt. Dieses flexibilität und Leichtigkeit der Herstellung macht das isolierte Trachea Ring-Modell eine robuste und funktionelle Assays für eine Vielzahl von Signalwegen in den Atemwegen Kontraktion der glatten Muskulatur beteiligt.
Protocol
1. Ausrüstung
Die Hauptkomponenten einer Kontraktion Messvorrichtung sind schematisch in 2A gezeigt).
- Ein Bad Gewebe. Das Gewebe Bad unterhält ein sauerstoffreiches physiologischen Lösung bei warmen Temperaturen. Bei Mäusen Trachea Ringe, verwenden wir ein 10 ml Gewebe Bad, das einen Wassermantel enthält zum Zirkulieren eines Erwärmung Lösung, eine Glasfritte Einlaß zu sprudeln Sauerstoff (95% / 5% O 2 / CO 2-Gemisch) und Einlass und Auslassöffnungen zum Ändern Lösungen. Ein Reservoir PSS-Lösung mit konstanter Durchblasen von 95% / 5% O 2 / CO 2-Gemisch bei 37 ° C Wasserbad (nicht gezeigt). Gespeicherten Zur Lösung Austausch, wird PSS-Lösung von dem Reservoir zu dem Gewebe Wanneneinlauf (Ausrichtung) bei etwa 100 ml pro Minute gepumpt wird, um relativ schnelle Lösung Austausch zu ermöglichen. Die Lösung-Auslass ist durch einen Überlauf (obere Öffnung), die mit konstantem Volumen (~ 10 ml) ermöglicht im Gewebe Schlägerh während der Lösung Austausch. Wir verwenden eine Haake Umwälzthermostat zu warmes Wasser durch das Gewebe zu pumpen Bad Jacke (bis 37 ° C zu halten). Tissue Bäder können aus einer Reihe von Lieferanten bezogen werden und kommen in einer Vielzahl von Größen und Stile, um die experimentellen Bedürfnisse der Ermittler passen.
- Ein Kraftaufnehmer. Um isometrische Spannung zu messen, wird die Luftröhre Rohr über L-förmigen Enden von zwei Edelstahl-Stangen (Abbildung 2A) eingefädelt. Es sollte darauf geachtet, eine Edelstahl-Typ, die kompatibel mit biologischem Material ist zu verwenden. Die obere Stange wird über einen Clip mit einem isometrischen Kraftaufnehmer verbunden. Die untere Stange hält die Trachea an einer festen Position, und auf einem Mikrometer zur Einstellung der passive Spannung und / oder Muskellänge montiert. Die Kontraktion der Trachea eine Spannung auf den Kraftaufnehmer, was zu einer Spannung an die Vorverstärker umgewandelt wird. Die untere Stange kann auch so konfiguriert, dass zwei rechteckige Platten Platin (4 mm voneinander entfernt) t erweitert werden Hut flankieren die Luftröhre (Abbildung 2B). Die Platin-Platten sind an einem Grass S88 Stimulator, die Abgabe eines elektrischen Feldes über die Trachea ermöglicht verdrahtet. Offene Drähte und löten sind mit Sylgard (Sylgard 184 Silikon-Elastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI) beschichtet, um die Auslaugung von Metallen in der Badlösung zu verhindern.
- A / D-Wandler, Computer und Software zur Erfassung. Signale von den Vorverstärker auf einer MacLab 8 A / D-System aufgezeichnet. Dies ist eine ältere Version der aktuellen ADInstrument Powerlab Hardware. Wir verwenden das Programm Diagramm (ADInstruments), die kontinuierliche Aufzeichnung der Spannung ermöglicht während des gesamten Experiments. Tension Generation der Luftröhre Muskel ist ziemlich langsam, und deshalb finden wir, dass die Akquisition von 100 Punkten pro Sekunde ist ausreichend. Die Spannung Messung wird unter Verwendung bekannter Gewichte (bis zu 5 Gramm) vor jedem Experiment. Ähnliche Systeme sind von anderen Verkäufern (zB Biopac, GW Instruments).
- Vor dem Gewebe isoliert Der Kraftaufnehmer ist mit bekannten Gewichten kalibriert, und das Gewebe Bad ist mit normalen PSS gefüllt (siehe Tabelle I). Der Lufteinlass ist eingestellt, um einen Lichtstrom von O 2 / CO 2 zu erhalten.
- Luftröhre aus 2 Monate oder älter Mäuse sind optimal. Jüngere Tiere können verwendet werden, aber Luftröhren von diesen erhalten mehr Geschick erfordern, um auf den Kraftaufnehmer Drähte wegen ihrer geringen Größe zu montieren. Vor der Präparation werden die Mäuse mit Isofluran tief sediert. Das richtige Maß an Sedierung ist erreicht, wenn eine Zehe-Pinch mit einer Pinzette ist nicht in der Lage, eine Reaktion auszulösen. Mäuse werden sofort durch Genickbruch getötet Ein wichtiger Hinweis:. Wir haben beobachtet, dass Avertin (Tribromethanol), ein Beruhigungsmittel häufig bei Mäusen eingesetzt, starke Beruhigungsmittel Auswirkungen auf die glatte Muskulatur der Atemwege hat und sollte daher nicht für die Luftröhre Kontraktion Studien verwendet werden.
- Die Haut (und Pelz) von Thorax an Hals entfernt. Ribs sind von der Basis des Brustbeins, seitlich (auf beiden Seiten) an die Spitze des Herzens zu schneiden. Das Brustbein und die Rippen sind dann nach vorne auf den Hals, um das Herz / Lunge, Thymus, Luftröhre (ventral) und Speiseröhre (- und dorsal Luftröhre an) zeigen gezogen.
- Die Luftröhre wird durch Schneiden unter dem bronchiale Bifurkation und vor dem Pharynx herausgeschnitten. Die Luftröhre wird in einem eiskalten Sauerstoff (95/5) PSS-Lösung (Zusammensetzung in Tabelle I angegeben) platziert.
- Die Luftröhre wird seziert sauberen des umgebenden Gewebes. Während der Reinigung kann die Luftröhre in den Rachen oder unterhalb der Bifurkation statt. Allerdings sollte mit Vorsicht vorgegangen werden nicht zur direkten Anwendung der Zange an der Luftröhre selbst werden. Einer feinen Schere verwendet werden, um abgeschnitten umgebenden Gewebe werden, aber der Schnitt immer vor parallel zu der Trachea werden, um Schäden zu vermeiden. Dieser Teil des Verfahrens wird erleichtert, wenn die Luftröhre Zubereitung unter der Bifurkation und oberhalb des Pharynx auf eine Sylgard-beschichteten Schale gemerkt (Sylgard 184 SiliconelastomerElastomer-, Dow Corning Corp, Midland, MI).
- Nach dem Entfernen umliegenden Gewebes, wird die Luftröhre unterhalb des Rachens und der Bronchien Bifurkation oben geschnitten und vorsichtig auf den Kraftaufnehmer Drähte montiert.
- Die Trachea wird über zwei L-förmigen Metallstäben (2A) geschraubt. Ein Stift ist mit einem Kraft-Weg-Wandler für die kontinuierliche Aufzeichnung der isometrischen Spannung verbunden. Ein weiterer Stift ist zu einem Mikrometer verbunden. Das Gewebe Bad wird dann angehoben, so dass die Luftröhre in PSS eingetaucht ist. Montage der Luftröhre sollte so schnell wie möglich erfolgen, um die Zeit, die Luftröhre von außen PSS gehalten zu minimieren. Mit etwas Übung können Montage der Luftröhre innerhalb einer Minute durchgeführt werden, aber wir generell mal länger als 3 Minuten, um zu vermeiden Verlust der Lebensfähigkeit zu vermeiden.
- Das Mikrometer eingestellt langsam auf eine passive Spannung von ~ 10 mN (~ 1 g-force) zu erhalten. Die optimale Ruhespannung wurde empirisch bestimmt und wir haben diese passive Spannung von ~ 5 gefunden - 10 mN Ergebnisse in einer äquivalenten, maximale Reaktion auf hohe Kalium-Stimulation. Dies steht im Einklang mit einer Reihe von anderen Studien, die eine passive Spannung in diesem Bereich 16,17,18 nutzen. In den ersten 5-10 Minuten, neigt Trachea passive Spannung leicht zurückgehen (Spannungsrelaxation Phänomen) und das Mikrometer verwendet wird, um die passive Spannung auf ~ 10 mN während der Äquilibrierung einzustellen. Die Luftröhre ist berechtigt, für mindestens 1 Stunde vor der experimentellen Herausforderungen Gleichgewicht zu bringen.
3. Hohe Kalium-Stimulation
Nach der Äquilibrierung wird die Trachea zweimal mit einer hohen Kalium-PSS-Lösung (67 mM KCl, Tabelle I) herausgefordert. Die Kontraktion erfordert im Allgemeinen ~ 5-10 Minuten zu erreichen stationären Zustand, in dem Bad wird das Gewebe mehrfach mit normalen PSS gespült, um vollständig zu entspannen die Luftröhre. Das Kalium Kontraktion ein zweites Mal wiederholt, und ein drittes Mal (falls nötig) bis reproduzierbare Kontraktionen erhalten.
Die Luftröhre wird von zwei rechteckigen Platin Platten (Elektroden), die elektrische Feld-Stimulation (EFS) ermöglicht die Herstellung flankiert. Die kontraktile Antwort auf EFS ist eine Funktion der Frequenz und Spannung. Es wird auch durch physikalische Parameter, wie die Fläche der Elektroden und der Abstand zwischen ihnen betroffen sind. Die Leistungscharakteristik des Stimulators auch Auswirkungen auf Antworten, so dass bei höheren Spannungen und Stromausgänge der Stimulator kann ihr Maximum erreicht. Die Eigenschaften eines EFS-System sollte durch die Untersuchung der Muskel kontraktile Antworten bei unterschiedlichen Laufzeiten Reiz, Frequenzen, Spannungen und Pulsdauern bestimmt werden. Für unseren experimentellen Aufbau haben wir gefunden, dass sich die Elektroden von ~ 4 mm abgetrennt und Stimulationsamplitude von 44 V (0,5 ms Impulse) und 30 Hz optimal reproduzierbare annähernd maximalen kontraktilen Antworten zu erreichen.
5. Die Kontraktion Evoked durch cholinerge Stimulation
Das Ansprechverhalten der Trachea auf exogen aufgebrachten Verbindungen erfolgt entweder durch Zugabe einer Einzeldosis des Arzneimittels von Interesse bewertet oder durch mehrfache Zugaben des Arzneimittels in einer kumulativen Dosis Mode. Für die Luftröhre, unserem Labor routinemäßig Carbachol verwendet werden, um cholinerge Rezeptoren aktivieren, denn anders als Acetylcholin, Carbachol ist nicht abgebaut durch Acetylcholinesterase. Eine vernünftige Dosis-Wirkungs-Bereich reicht von 10 -8 bis 10 -5 M Carbachol. Montage des Log [Carbachol]-kontraktilen Antwort-Kurve mit einer Hill-Typ-Gleichung erlaubt eine Abschätzung der EC 50 (halbmaximale effektive Konzentration), die ein Maß für die Empfindlichkeit des trachealen Kontraktion der cholinerge Agonist 19 ist. Es ist bemerkenswert, dass eine bestimmte Dosis von Carbachol wird eine etwas stärkere Reaktion als eine einzelne Dosis als im Rahmen einer kumulativen Dosis-Wirkungs-Kurve geben.
6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine Kontraktionsreaktion zu hohen Kalium in 3A gezeigt. Die Kontraktion erreicht ein Maximum innerhalb von ca. 10 Minuten, kann aber einen kleinen Rückgang danach zeigen. Während der frühen Auswaschung der hohe Kalium, kann der Muskel zeigen ein vorübergehender Anstieg der Kontraktion, die durch eine Absenkung der Temperatur als die kleinen Volumen von unbeheizten PSS-Lösung in den Zeilen-Lösung perfundiert vorübergehend die Vorbereitung ist. Dies kann durch eine minimale Totvolumen in der Röhre, die das erwärmte PSS Reservoir und Gewebebad minimiert werden, und auch durch Austausch Lösung relativ schnell (in der Regel pumpen wir Lösungen bei 100 ml / min). Jedes Präparat wird einige Unterschiede in der kontraktile Reaktion auf Unterschiede in der Muskelmasse oder der Beschädigung während der Präparation entstanden sind. 3B zeigt zwei Luftröhren von verschiedenen Muskelmasse mit hohen Kalium-und Carbachol in Frage gestellt. Obwohl die cholinerge evozierten Kontraktionen unterscheiden, diey sind ähnlich wie nach der Normalisierung der Reaktion mit hohem Kalium-Lösung (3C).
4 zeigt ein Beispiel eines Carbachol (cholinergen) hervorgerufene Kontraktion mit Einzeldosen (A) und eine kumulative Erhöhung (B). Die Lösungen werden direkt Carbachol dem Bad zugegeben und die Blasen Gas hilft bei der ein rasches Mischen. Es ist erwähnenswert, dass die Zugabe einer Einzeldosis (dh 1 uM, 4A) hat einen etwas größeren Reaktion als die entsprechende Konzentration während einer kumulativen Dosis-Wirkungs-Kurve (1 uM, 4B). 4C zeigt ein Diagramm der Kontraktionskraft in Abhängigkeit von Carbachol-Konzentrationen unter Verwendung von Daten aus 4B. Auswirkungen von Carbachol bei 10 -5 M Konzentration zu sättigen. Obwohl cholinergen Agonisten initiiert Kontraktion durch Calcium-Freisetzung Mechanismen, ist ein wesentlicher Bestandteil der Kontraktion auch durch Depolarisation vermittelt undAktivierung der spannungsabhängige Calciumkanäle Kanäle 20.
5A zeigt ein Beispiel für die EFS-evozierten Kontraktionen. Luftröhren stimuliert werden unter Verwendung von 0,5 Millisekunde Dauer, 40-Volt-Impulse bis Kontraktionen ein Plateau (siehe Kasten A1) zu erreichen. Eine Erhöhung der Stimulationsfrequenz bewirkt eine erhöhte kontraktile Reaktion (Frequenz-Antwort-Kurve ist in Abbildung 5B dargestellt). Elektrofeldstimulation wurde gezeigt, dass Kontraktionen überwiegend durch Aktivierung hervorzurufen präsynaptischen Nerven. Dies wird durch die Wirkung von Botulinumtoxin, einem Blocker der Freisetzung von Neurotransmittern, die die Mehrheit der EFS-evozierten Kontraktionen der Luftröhre blockiert 21 belegt. Darüber hinaus Tetrodotoxin, ein Mittel, das Blöcke Na +-Kanäle hemmt auch Nervenaktivität und beseitigt die Reaktion der Luftröhre zu EFS.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der ter den wichtigsten Signalwegen in einer isolierten Luftröhre Vorbereitung. Dargestellt ist ein cholinerger Axonendigung innervieren eines trachealen glatte Muskelzelle ist. Die wichtige Signalwege sind M3 und M2-Muscarin-Acetylcholin-Rezeptor-Aktivierung (mAChR), die Calcium-Freisetzung durch IP3-Rezeptoren (M3) und die Reduktion des cAMP (M2) zu bewirken. M2-Rezeptoren (und einige Beiträge von M3-Rezeptoren) auch dazu führen, cholinerge evozierten Depolarisation, die L-Typ spannungsabhängigen Calcium-Kanäle und Calcium-Einstrom aktiviert. Gemeinsame kontraktilen Agenten und ihre Effektoren sind 1. hohe Kalium (depolarisieren glatter Muskelzellen und cholinerge Axone), 2. elektrisches Feld Stimulation (EFS, depolarisiert cholinerge Axone) und 3. exogene Anwendung von Anticholinergika wie Acetylcholin oder Carbachol (aktiviert muskarinischen Rezeptoren direkt).
Abbildung 2. Schematische Darstellung der verwendeten Geräte zu messen tracheale Kontraktionen. A. Der Kraftaufnehmer, Mikro-und Gewebe-Bad auf Stützstangen über Schraubklemmen befestigt. Die Trachealring über den oberen und unteren Stangen geschraubt. In dem Diagramm wird das Gewebe Bad unter Herstellung positioniert ist (dh bei der Montage der Trachea auf den Kraftaufnehmer). Während der Kontraktion Studien, wird das Gewebe Bad vertikal, um die Herstellung zu baden bewegt. B. Für Elektrofeldstimulation die untere Stange ist modifiziert, um zwei Platinplatten, die seitlich in die Luftröhre Haltedraht angebracht sind. Die Platin-Platten sind durch elektrische Drähte mit einem Stimulator verbunden sind.
Abbildung 3. Beispiele für hohe Kalium (67 mM) kontraktile Reaktion der Luftröhre. (A) zeigt doppelte, reproduzierbare Reaktionen auf eine hohe Kalium. (B) Beispiele für kontraktile Reaktion auf Carbachol von zwei verschiedenen Luftröhre. (C) Antworten auf die Luftröhre in B sind ähnlich, wenn normalisierend des hohen Kalium-Reaktion.
Abbildung 4. Beispiele für Carbachol-induzierte Kontraktionen. (A) Carbachol-induzierte Kontraktionen mit Einzeldosen gefolgt von Auswaschung. (B) Beispiel kumulative Dosis-Wirkungs-Kurve für Trachea in A. (C) Peak Kontraktionen von B als eine Funktion der Carbachol-Konzentration aufgetragen.
Abbildung 5. Beispiele von Kontraktionen durch elektrische Feld Stimulation hervorgerufen. (A) Elektrisches Feld Stimulation der Luftröhre Kontraktion mit 0,5 ms Puls, 40 Volt, und verschiedene Frequenzen Stimulation, wie angegeben. Inset ist zeitexpandierten Kontraktion bei 30 Hz. (B) Peak Kontraktionen von A sind plotted als eine Funktion der Stimulationsfrequenz.
Normale PSS
| Salz | Conc. (MM) | Menge (g / 2 L) |
| NaCl | 119 | 13,91 |
| KCl | 4,7 | 0,7 |
| KH 2 PO 4 | 1,18 | 0,32 |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 1,17 | 0,58 |
| NaHCO 3 | 18 | 3,02 |
| EDTA | 0,026 | 0,1 ml 0,5 M |
| Glucose | 11 | 3,96 |
| Saccharose | 12,5 | 8,56 |
| CaCl 2 | 2 | 400 ml 10 mM |
Hohe K + PSS (NaCl KCl und Anpassungen)
| Salz | Conc. (MM) | Menge (g / 2 L) |
| NaCl | 56,7 | 6,628 |
| KCl | 67 | 9,991 |
. Tabelle 1 Rezept für PSS-Lösungen. Hinweis: Die Lösungen werden wöchentlich frisch hergestellt, mit Reinstwasser Qualität Wasser, und werden im Kühlschrank nicht länger als 5 Tage, um Vermeidung einer Kontamination des Wachstums gespeichert.
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Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine physiologische Vorbereitung der Atemwege Muskelfunktion zu beurteilen. Wir arbeiten in der Regel 3-4 Organbad Präparate gleichzeitig aber sind vorgefertigte Systeme aus einer Reihe von Anbietern, die simultane Messung von bis zu 8 Zubereitungen (ADInstruments, World Precision Instruments, und Harvard Apparatus) erlauben verfügbar. Wir haben eine Reihe von Kraftaufnehmern und Gewebe Organbäder mit gleichwertigen Ergebnissen genutzt. Allerdings finden wir, dass elektrische Feld Stimulation gewisse Variabilität auf leichte Unterschiede zwischen stimulierenden Elektroden, Abstand zwischen den Elektrodenplatten, und die Position der Zubereitung im elektrischen Feld zur Verfügung stellt. Daher sollte besonders vorsichtig durchgeführt, um Feldelektroden so ähnlich wie möglich zu machen.
Einer der wichtigsten Parameter in isometrischer Kraftmessungen ist die Frage der Normalisierung Kontraktionen, um Variationen in der Muskelmasse zu kompensieren, oderGesundheit von Muskelgewebe zwischen den verschiedenen Präparaten. Zum Teil lassen sich Unterschiede durch den Vergleich Tiere gleichen Alters und gleichen Geschlechts (weibliche Mäuse tendenziell reduzierten Luftröhre Spannung erzeugen) minimiert werden. Ferner haben wir festgestellt, dass eine Normalisierung der Trachea nass oder trocken Gew. ausreichender Genauigkeit, möglicherweise aufgrund der geringen Größe der Bronchokonstriktion fehlt. Vielmehr ist die Verwendung von mehreren hohen Kalium, Kontraktionen sehr vorteilhaft. Hohe Kalium Kontraktionen dienen zwei Zwecken. Der hohe Kalium-Kontraktion scheint "erwachen" die trachealen Muskeln und sorgt dafür, dass Kontraktionen reproduzierbar, bevor Sie mit experimentellen Herausforderungen sind. Der hohe Kalium-Kontraktion scheint auch eine genaue Normalisierung für die aktive Muskelmasse, die in der Vorbereitung ist. So werden experimentelle Spannung Messungen häufig als Kraft normiert auf hohem Kalium-Kontraktion ausgedrückt. Darüber hinaus kann die Qualität einer Zubereitung unter Verwendung des hohen Kalium-induzierte Auftrags werdenIonen. Zum Beispiel finden wir, dass 8 bis 10 Wochen alte männliche Mäuse C57BL/6J einen hohen Kalium-induzierten Kontraktion von 20 ± 3,8 mN (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 17) haben. Wenn einer Luftröhre Vorbereitung Verträge weit unter diesem Bereich (unter 12 mN oder zwei Standardabweichungen unter meine), dann wird es allgemein als "beschädigt" und nicht für Experimente genutzt angesehen. Alternativ kann Normalisierung der Spannung auf das maximale Spannung in sättigenden cholinerge Agonist verwendet werden. Dies ist nützlich zur Beobachtung von Veränderungen in der Empfindlichkeit gegenüber Agonisten, sondern kann Änderungen, die Wirkung der maximalen Kontraktion verpassen.
Es wurden Methoden vorgestellt, um die Kontraktion zu aktivieren entweder mit Hilfe eines cholinergen Agonisten oder mit elektrischer Stimulation. Cholinerger Agonist Anwendung auf das Gewebe Bad aktiviert direkt die glatte Muskulatur. Im Gegensatz dazu mit mäßiger EFS Stimulationsfrequenz (bis zu 25 Hz) die Mehrheit der Kontraktion wird durch Nerven-Aktivierung und Freisetzung von neurotransmi vermittelttter 22. Damit der Prüfer hat die Möglichkeit, Agenten, die präsynaptischen / Nerv-vermittelte Kontraktion mit EFS Stimulation beeinflussen zu untersuchen. Schließlich weisen Studien darauf hin, dass andere Zelltypen, wie Mastzellen 23 und 24 auch Epithelzellen zu beeinflussen Kontraktilität des isolierten Trachea Herstellung. Somit stellt die In-vitro-Bronchokonstriktion Herstellung eines robusten funktionellen Assay für eine Reihe von Zelltypen, die glatten Muskeln der Atemwege Kontraktilität zu beeinflussen.
Zusammenfassend hat sich die Maus in vitro Luftröhre Vorbereitung war besonders nützlich bei der Analyse der genetischen Veränderungen, die Lungenfunktion beeinträchtigen. Einige Beispiele sind die Analyse von Gen-Knockouts von Ionenkanälen 17,20,25,26, 27,28,29,30 metabotropen Rezeptoren und nachgeschalteten Signalkaskaden 31. Darüber hinaus kann das Antigen in Frage gestellt Maus wird häufig zur Behandlung von Asthma Studien 32 und die in vitroLuftröhre Vorbereitung bietet einen nützlichen Test für Veränderungen in der Kontraktilität, die folgende Entwicklung von Asthma erfolgt.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Zentrum für Innovation in der Prävention und Behandlung von Atemwegserkrankungen, NINDS Grant (NS052574), und von der Sandler-Programm für Asthma-Forschung finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analogue-Digital Converter |  ADInstruments |
PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C) |
| Charting Software | ADInstrtuments |
LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
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