Summary
Camundongos transgênicos têm sido extremamente úteis em atribuir função fisiológica para genes. Como a pesquisa, tal em geral, e estudos funcionais da via aérea, em particular, têm sofrido uma mudança notável na direção modelos murinos. Aqui nós fornecemos os protocolos para
Abstract
Transgênicos e camundongos têm sido ferramentas poderosas para a investigação da fisiologia e fisiopatologia das vias aéreas 1,2. Em tensometry in vitro de preparações isoladas traqueal provou ser um teste útil do músculo liso das vias aéreas (ASM) resposta contrátil em camundongos geneticamente modificados. Estes em preparações in vitro da traquéia são relativamente simples, dar uma resposta robusta e manter ambas as terminações nervosas colinérgicas funcionais e respostas musculares, mesmo após longas incubações.
Tensometry traqueal também fornece um ensaio funcional para estudar uma variedade de vias de sinalização de segundo mensageiro que afectam a contração do músculo liso. Contração na traquéia é mediado principalmente pela parassimpático, nervos colinérgicos que liberam acetilcolina em ASM (Figura 1). Os principais receptores de acetilcolina ASM são M2 e M3 muscarínicos que são G i / o e receptores acoplados Gq, respectivamente
Apresentamos aqui protocolos para o isolamento de murinos anéis traqueais e as medições in vitro da sua saída contráctil. Incluem-se as descrições da configuração do equipamento, traquéia isolamento anel e medições contráteis. Exemplos são apresentados para evocar contracções indirectamente, utilizando estimulação de potássio elevado de nervos e directamente por despolarização de músculo ASM para activar e dependente da voltagem influxo de cálcio (1. Alta K +, Figura 1). Além disso, os métodos são apresentados para estímulos de nervos sozinho usando estimulação do campo eléctrico (2. EFS, Figura 1), ou para a estimulação directa de músculo ASM usando neurotransmissor exógeno aplicado ao banho (3. Exógeno ACH, Figura 1). Este flexibility e facilidade de preparação processa o modelo de anel isolado da traqueia de um ensaio robusto e funcional para um número de cascata de sinalização envolvidas na contracção do músculo liso das vias aéreas.
Protocol
1. Equipamento
Os principais componentes de um dispositivo de medição de contracção são mostrados esquematicamente na Figura 2A).
- Um banho de tecido. O banho de tecido mantém uma solução oxigenada fisiológico à temperatura quente. Para anéis ratinhos traqueia, usamos um banho de tecidos 10 ml que contém uma camisa de água para fazer circular uma solução de aquecimento, uma entrada de frita de vidro ao oxigénio bolha (95% / 5% de O 2 / CO 2 mistura) e de entrada e de escape para alterar soluções. Uma solução PSS reservatório é armazenada com borbulhamento constante de 95% / 5% de O 2 / CO 2 mistura em um banho de 37 ° C água (não mostrado). Para trocas de solução, a solução de PSS é bombeado do reservatório para a entrada de banho de tecido (porta inferior) a cerca de 100 ml por minuto para permitir a troca solução relativamente rápido. A solução é tomada através de uma porta transbordamento (porta superior) que permite que a volume constante (~ 10 ml) no tecido morcegoh durante a solução de câmbio. Usamos um circulador de aquecimento Haake para bombear a água quente através da camisa banho de tecido (para manter a 37 ° C). Banhos de tecido pode ser obtido a partir de um certo número de fornecedores e vêm em uma variedade de tamanhos e estilos para se adequar às necessidades experimentais do investigador.
- Um transdutor de força. Para medir a tensão isométrica, o tubo de traqueia é enfiada sobre L-extremidades em forma de duas hastes de aço inoxidável (Figura 2A). Deve ser tomado cuidado para usar um tipo de aço inoxidável que é compatível com o material biológico. A haste de topo é ligado através de um grampo a um transdutor de força isométrica. A haste inferior mantém a traqueia, numa posição fixa, e é montado sobre um micrómetro para o ajuste de tensão passiva e / ou o comprimento do músculo. Contracção da traqueia cria tensão sobre o transdutor de força, que é convertido para um sinal de tensão no pré-amplificador. A haste inferior pode também ser configurado para incluir duas placas de platina rectangulares (4 mm de intervalo) t chapéu flanco da traquéia (Figura 2B). As placas de platina são ligados a um estimulador Grass S88 que permite que a entrega de um campo eléctrico através da traqueia. Fios abertos e de solda são revestidos com Sylgard (Sylgard elastómero de silicone 184, Dow Corning Corp, Midland, MI), para evitar a lixiviação de metais na solução do banho.
- A / D de software de computador conversor, e de aquisição. Sinais dos amplificadores são registados numa MacLab 8 Um sistema de / D. Esta é uma versão mais antiga do atual hardware ADInstrument Powerlab. Nós usamos o gráfico de programa (ADInstruments) que permite gravação contínua de tensão durante todo o experimento. Geração de tensão do músculo traquéia é bastante lento e, portanto, achamos que a aquisição de 100 pontos por segundo é suficiente. A medição da tensão é calibrado usando pesos conhecidos (até 5 gramas), antes de cada experiência. Sistemas similares estão disponíveis a partir de outros fornecedores (por exemplo, Biopac, GW Instruments).
- Antes de isolamento tecido do transdutor de força é calibrado com pesos conhecidos, eo banho de tecido é preenchido com PSS normal (ver Tabela I). A entrada de ar é ajustada para se obter um fluxo de luz de O 2 / CO 2.
- Traquéias de dois meses ou camundongos mais velhos são ótimas. Animais jovens podem ser usados, mas traqueias obtidos a partir destes exigem uma maior capacidade para montar sobre os fios transdutor de força devido ao seu tamanho pequeno. Antes de dissecção, os ratos estão profundamente sedado com isoflurano. O nível apropriado de sedação é alcançado quando um toe pitada com fórceps não é capaz de eliciar uma resposta. Os ratos são imediatamente sacrificados por deslocamento cervical Uma nota importante:. Temos observado que Avertin (tribromoetanol), um sedativo usado em camundongos, tem fortes efeitos relaxantes sobre o músculo liso das vias aéreas e, portanto, não deve ser usado para estudos de contração de traquéia.
- A pele (e peles com pêlo) é removido do tórax de garganta. Ribs são cortadas a partir da base do esterno, lateralmente (em ambos os lados) para o topo do coração. O esterno e costelas são, então, puxado para a frente para a garganta para revelar o coração / pulmões, timo, traquéia (ventral) e esôfago (em anexo - e dorsal a traquéia).
- A traqueia é excisado cortando abaixo da bifurcação brônquica e acima da faringe. A traqueia é colocado em um gelada oxigenado solução PSS (95/5) (composição dada na Tabela I).
- A traquéia é dissecado limpo dos tecidos circundantes. Durante a limpeza, a traquéia pode ser realizada na faringe ou abaixo da bifurcação. No entanto, o cuidado deve ser tomado para não se aplicam diretamente a pinça para a traquéia em si. Tesoura fina pode ser utilizado para cortar os tecidos circundantes, mas o corte deve ser feita sempre paralela à traqueia para evitar danos. Esta parte do processo é facilitado se a preparação da traqueia é fixado abaixo da bifurcação e acima da faringe num prato de Sylgard revestido (Sylgard 184 SiliconeElastómero, Dow Corning Corp, Midland, MI).
- Após a remoção do tecido circundante, a traqueia é cortado abaixo da faringe e acima da bifurcação brônquica e suavemente montado sobre os fios transdutor de força.
- A traqueia é roscado ao longo de dois dentes em forma de L de metal (figura 2A). Um pino está ligado a um transdutor de força-deslocamento para registo contínuo da tensão isométrica. Outra pino está ligado a um micrómetro. O banho de tecido é então levantada, de modo que a traqueia é imerso em PSS. Montagem da traqueia deve ser feito tão rapidamente quanto possível para minimizar o tempo que traqueia são mantidos fora de PSS. Com a prática, a montagem da traquéia pode ser feito dentro de um minuto, mas nós geralmente evitar vezes mais do que 3 minutos para evitar a perda de viabilidade.
- O micrómetro é ajustado lentamente para se obter uma tensão passiva de ~ 10 mN (~ 1 grama de força). A tensão de repouso óptima foi determinada empiricamente e nós descobrimos que a tensão passiva de ~ 5-10 resultado MN em uma resposta, equivalente à estimulação máxima de potássio de alta. Isto é consistente com um número de outros estudos que utilizam uma tensão passiva nesta gama 16,17,18. Ao longo dos primeiros minutos 5-10, traqueia tensão passiva tende a diminuir ligeiramente (tensão-relaxamento fenómeno) e do micrómetro é usado para ajustar a tensão passiva para ~ 10 mN durante equilíbrio. A traqueia é deixada a equilibrar durante pelo menos 1 hora antes de desafios experimentais.
3. Estimulação de potássio de alta
Equilibração a seguir, a traqueia é desafiada duas vezes com uma solução de alta potássio PSS (67 mM de KCl, Tabela I). A contracção geralmente requer minutos ~ 5-10 para atingir o estado estacionário, altura em que o banho de tecido é enxaguado por várias vezes com PSS normal para relaxar completamente a traqueia. A contracção de potássio é repetido uma segunda vez, e uma terceira vez (se necessário) até que as contracções reprodutíveis são obtidos.
A traqueia é flanqueado por duas placas de platina rectangulares (eléctrodos) que permitem que a estimulação do campo eléctrico (EFS) para a preparação. A resposta contráctil ao EFS é uma função da frequência e tensão. Também é afectada por meio de parâmetros físicos, tais como a área dos eléctrodos ea distância entre eles. As características de potência do estimulador também afetam essas respostas que a voltagens mais elevadas e saídas de corrente do estimulador alcança seu valor máximo. As características de qualquer sistema EFS deve ser determinada através da análise das respostas musculares contráteis em diferentes durações de estímulo, freqüências, tensões e durações de pulso. Para o nosso configuração experimental, descobrimos que os eléctrodos separados por ~ 4 mm, ea amplitude de estimulação de 44 V (0,5 ms pulsos) e 30 Hz são óptimas para atingir reprodutíveis perto-máximas respostas contrácteis.
5. Ev contraçãooked por Estimulação Colinérgica
A capacidade de resposta da traqueia para exogenamente compostos aplicados é avaliada quer por adição de uma única dose da droga de interesse, ou, por adições múltiplas da droga de uma forma de dose cumulativa. Para a traqueia, nosso laboratório utilizado rotineiramente carbacol para activar os receptores colinérgicos, porque, ao contrário da acetilcolina, carbacol não é degradado pela enzima acetilcolinesterase. Uma gama de dose-resposta razoável é de 10 -8 a 10 -5 M carbacol. Montagem do Log [carbacol] curva de resposta-contrátil com uma equação de Hill de tipo permite uma estimativa da EC 50 (semi-máxima concentração eficaz) que é uma medida da sensibilidade da contracção da traqueia para o agonista colinérgico 19. Vale a pena notar que uma determinada dose de carbacol dará uma resposta ligeiramente maior como uma dose única do que como parte de uma curva de dose-resposta cumulativas.
6. Os resultados representativos Um exemplo de uma resposta contráctil de potássio de alta é mostrada na Figura 3A. A contração atinge um máximo em aproximadamente 10 minutos, mas pode mostrar um pequeno declínio em seguida. Durante washout precoce de elevado de potássio, o músculo pode mostrar um aumento transitório na contracção que é devido a uma queda na temperatura conforme o pequeno volume de solução de PSS sem aquecimento nas linhas de solução transientemente perfunde da preparação. Isto pode ser minimizado por ter um volume mínimo morto na tubagem de ligação ao reservatório PSS aquecida e banho de tecido, e também através da troca de solução de forma relativamente rápida (geralmente bombeia-soluções a 100 ml / min). Cada preparação terá algumas diferenças na resposta contráctil devido a diferenças na massa muscular ou danos efectuadas durante a dissecção. Figura 3B mostra duas traqueias de massa muscular diferente desafiados com elevado de potássio e carbacol. Embora as contrações colinérgica-evocados diferentes, oy são semelhantes após normalização para a resposta com uma solução de potássio elevada (Figura 3C).
A Figura 4 mostra um exemplo de uma contracção carbacol (colinérgica) evocado utilizando doses únicas (A) e um aumento cumulativo (B). As soluções de carbacol são adicionados directamente para o banho eo gás borbulhado ajuda na mistura rápida. Vale a pena notar que a adição de uma dose única (isto é, 1 mM, a Figura 4A) tem uma resposta ligeiramente maior do que a concentração equivalente durante uma curva dose-resposta cumulativas (1 uM, a Figura 4B). 4C Figura mostra um gráfico da força de contracção como uma função das concentrações de carbacol utilizando os dados a partir da Figura 4B. Efeitos do carbacol saturar a concentração de 10 M -5. Embora os agonistas colinérgicos inicia contracção por meio de mecanismos de libertação de cálcio, um componente substancial da contração também é mediada pela despolarização eactivação de canais de cálcio dependentes de tensão 20.
A Figura 5A mostra um exemplo de EFS evocadas contracções. Traquéias são estimuladas com 0,5 milissegundos de duração, de 40 pulsos volts até contrações atingir um platô (ver a1 inserção). Um aumento na freqüência de estimulação provoca um aumento da resposta contrátil (frequência de resposta curva é traçada na Figura 5B). A estimulação do campo eléctrico tem sido demonstrado para evocar contrações predominantemente através da activação dos nervos pré-sinápticos. Isto é evidenciado pelo efeito da toxina botulínica, um bloqueador de libertação de neurotransmissores que bloqueia a maioria das contracções EFS-evocados de traqueia 21. Além disso, tetrodotoxina, um agente que bloqueia canais de Na + também inibe a actividade do nervo e elimina a resposta da traqueia para o EFS.
Figura 1. Diagrama de tAs principais vias de sinalização que em uma preparação de traquéia isolada. É mostrado um terminal axônio colinérgica inervar uma célula muscular lisa traqueal. As principais vias de sinalização são M3 e M2-muscarínico ativação do receptor de acetilcolina (mAChR) que causam a liberação de cálcio através de receptores IP3 (M3) e redução de AMPc (M2). Receptores M2 (e alguma contribuição dos receptores M3) também causar despolarização colinérgico-evocado que activa canais tipo L, dependente da voltagem de cálcio e influxo de cálcio. Comuns agentes contráteis e seus efetores são: 1. de potássio elevado (despolarizar célula muscular lisa e axónio colinérgica), 2. estimulação campo elétrico (EFS, despolariza colinérgica axônio) e 3. aplicação exógena de agentes colinérgicos, tais como acetilcolina ou carbacol (activa os receptores muscarínicos directamente).
Figura 2. Diagrama de equipamento utilizado para medir as contracções traqueais. A. O transdutor de força micrómetros, e banho de tecido são montados sobre o apoio hastes por meio de grampos. O anel traqueal é enfiada sobre as hastes superior e inferior. No diagrama, o banho de tecido é posicionado abaixo da preparação (isto é, durante a montagem da traqueia para o transdutor de força). No decurso dos estudos de contração, o banho de tecido é movido verticalmente para banhar a preparação. B. Para a estimulação do campo eléctrico a haste inferior é modificado para incluir duas placas de platina que são montados lateralmente para o fio de exploração traqueia. As placas de platina são ligados por fios eléctricos a um estimulador.
Figura 3. Exemplos de potássio de alta (67 mM) de resposta contráctil de traqueia. (A) mostra duplicados, respostas reprodutível para elevado de potássio. (B) Exemplos de resposta contráctil ao carbacol de duas traqueias diferentes. (C) As respostas às traqueias em B são semelhantes quando normalizard para a resposta de alta de potássio.
Figura 4. Exemplos de contracções induzidas por carbacol. (A) carbacol contracções induzidas por utilizando doses únicas seguido por lavagem. (B) Exemplo curva de dose-resposta cumulativas para traqueia em A. (C) contracções de pico de B estão representados como uma função da concentração de carbacol.
Figura 5. Exemplos de contracções provocadas pela estimulação do campo eléctrico. (A) estimulação do campo eléctrico da traqueia contracção usando 0,5 ms de pulso, 40 volts, e as frequências de estimulação vários, como indicado. Inset é tempo de expansão da contração em 30 Hz. (B) as contrações de pico de um são plotted como uma função da frequência de estimulação.
PSS normal
| Sal | Conc. (MM) | Quantidade (g / 2 L) |
| NaCl | 119 | 13,91 |
| KCl | 4,7 | 0,7 |
| KH 2 PO 4 | 1,18 | 0,32 |
| MgSO4 x 7H 2 ó | 1,17 | 0,58 |
| De NaHCO3 | 18 | 3,02 |
| EDTA | 0,026 | 0,1 ml de 0,5 M |
| Glicose | 11 | 3,96 |
| Sacarose | 12,5 | 8,56 |
| CaCl 2 | 2 | 400 ml de 10 mM |
Alta K + PSS (NaCl ajustes e KCl)
| Sal | Conc. (MM) | Quantidade (g / 2 L) |
| NaCl | 56,7 | 6,628 |
| KCl | 67 | 9,991 |
Tabela Receita 1 para soluções de PSS. Nota:. Solutions são feitos semanalmente fresco, com qualidade da água ultrapura, e são armazenados em um refrigerador por mais de 5 dias para evitar a contaminação de crescimento.
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Discussion
O protocolo apresentado aqui proporciona uma preparação fisiológica para avaliar a função muscular das vias aéreas. Nós operam geralmente preparações para o banho de órgãos de 3-4 simultaneamente, no entanto, os sistemas de pré-embalados estão disponíveis a partir de um certo número de fornecedores que permitem medições simultâneas de até 8 preparações (ADInstruments, instrumentos de precisão do mundo, e Harvard Apparatus). Foi utilizado um número de transdutores de força e banhos de órgãos de tecidos com resultados equivalentes. No entanto, descobrimos que a estimulação do campo eléctrico fornece alguma variabilidade com base em pequenas diferenças entre eléctrodos de tamanho estimulantes, a distância entre as placas de eléctrodos, ea posição da preparação no interior do campo eléctrico. Assim, um cuidado extra deve ser realizada para fazer eletrodos de campo o mais semelhante possível.
Um dos parâmetros mais importantes nas medições de força isométrica é a questão de normalizar as contracções para compensar as variações de massa muscular, ousaúde do tecido muscular entre diferentes preparações. Em parte, as diferenças podem ser minimizados através da comparação animais da mesma idade e mesmo sexo (ratinhos fêmea tendem a gerar a tensão da traqueia reduzida). Além disso, descobrimos que a normalização de traqueia de peso molhado ou seco falta de precisão suficiente, possivelmente devido ao pequeno tamanho de rato traqueia. Em vez disso, a utilização de múltiplos, elevados de potássio, contracções é muito vantajoso. Alta contrações potássio servir a dois propósitos. A contração de potássio de alta parece "despertar" o músculo traqueal e garante que as contrações são reprodutíveis antes de prosseguir com os desafios experimentais. A contracção de potássio de alta também parece ser um normalização precisas para a massa muscular activa que está presente na preparação. Assim, as medições de tensão experimentais são frequentemente expressos em vigor normalizada para a contracção de potássio elevado. Além disso, a qualidade de uma preparação pode ser avaliada utilizando o contrato de potássio induzida por altaion. Por exemplo, descobrimos que 8 - 10 semanas os ratos machos C57BL/6J velhos têm uma contracção induzida por potássio de alta de 20 ± 3,8 mN (média ± desvio padrão, n = 17). Se um contrato de preparação traquéia bem abaixo dessa faixa (abaixo de 12 mN ou dois desvios-padrão abaixo da média), então ele é geralmente considerado como "danificado" e não utilizados para a experimentação. Alternativamente, a normalização da tensão para a tensão máxima no agonista colinérgico saturando podem ser utilizados. Isto é útil para a observação de alterações na sensibilidade ao agonista, mas pode perder as alterações que afectam a contracção máxima.
Métodos foram apresentados para activar contracção quer utilizando um agonista colinérgico ou com a estimulação eléctrica. Aplicação agonista colinérgico para o banho de tecido directamente activa o músculo liso. Em contraste, com frequência moderada EFS estimulação (até 25 Hz) a maioria da contracção é mediada através da activação do nervo e libertação de neurotransmitter 22. Assim, o pesquisador tem a oportunidade de investigar os agentes que afetam pré-sináptico / contração do nervo-mediada através da estimulação EFS. Finalmente, estudos indicam que os outros tipos de células tais como mastócitos 23, e as células epiteliais 24 também influenciam a contractilidade na preparação traqueia isolada. Assim, a preparação in vitro traqueia rato fornece um ensaio funcional robusta para um número de tipos de células que influenciam das vias aéreas a contractilidade do músculo liso.
Em resumo, o rato in vitro preparação traqueia tem sido particularmente úteis na análise de alterações genéticas que afectam a função das vias aéreas. Alguns exemplos incluem a análise de nocautes de genes de canais iônicos, receptores metabotrópicos 17,20,25,26 27,28,29,30, ea jusante cascata de sinalização 31. Além disso, o rato antigénio desafiados é frequentemente utilizado para os estudos de asma 32 e in vitrotraqueia preparação fornece um ensaio útil para alterações na contractilidade que se segue seguinte desenvolvimento de asma.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação do Centro para a Inovação na Prevenção e Tratamento de doenças respiratórias, NINDS concessão (NS052574), e do Programa de Pesquisa Sandler Asma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analogue-Digital Converter |  ADInstruments |
PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C) |
| Charting Software | ADInstrtuments |
LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
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