Summary
Transgene mus har været yderst nyttig i tilskrive fysiologiske funktion til gener. Som sådan forskning i almindelighed, og funktionelle undersøgelser af luftveje, i særdeleshed har gennemgået en bemærkelsesværdig skift mod murine modeller. Her giver vi protokoller til
Abstract
Transgene og knockout-mus har stærke værktøjer til undersøgelse af fysiologiske og patofysiologien af luftvejene 1,2. In vitro tensometry isolerede luftrøret præparater har vist sig at være et nyttigt assay af luftvejenes glatte muskulatur (ASM) kontraktile respons i genetisk modificerede mus. Disse in vitro-luftrør præparater er relativt simple, giver en robust respons, og bevarer begge funktionelle cholinerge nerver og muskel reaktioner, selv efter lange inkubationer.
Luftrør tensometry tilvejebringer også et funktionelt assay til at studere forskellige second messenger signalveje, der påvirker kontraktion af glat muskulatur. Nedgang i trachea medieres primært af parasympatiske, cholinerge nerver, der frigiver acetylcholin på ASM (figur 1). De store ASM acetylcholin receptorer er muskarine M2 og M3, som er G I / O og GQ koblede receptorer, henholdsvis
Her præsenterer protokoller til isolering af murine trachealringe og in vitro måling af deres kontraktile produktion. Inkluderet er beskrivelser af det solgte udstyrs konfiguration, luftrør ring isolation og kontraktile målinger. Eksempler er givet for at fremkalde kontraktioner indirekte ved hjælp af højt kaliumindhold stimulation af nerver og direkte ved depolarisering af ASM muskel til at aktivere spændingsafhængig calciumindstrømning (1. Høj-K +, figur 1). Derudover er fremgangsmåder præsenteret for stimulering af nerver alene ved hjælp af elektrisk felt-stimulering (2. EFS, figur 1) eller til direkte stimulering af ASM muskel ved hjælp af exogent neurotransmitter anvendes til badet (3. Exogent ACH, figur 1). Dette FLExibility og lette fremstilling gør det isolerede trachea ringen model et robust og funktionelt assay for en række signaleringskaskader involveret i luftvejenes glatte muskulatur kontraktion.
Protocol
1. Udstyr
Hovedkomponenterne i en sammentrækning måleindretningen er vist skematisk i figur 2A).
- En vævsbadet. Vævsbadet opretholder en oxygeneret fysiologisk opløsning ved varm temperatur. For mus trachea ringe, anvender vi en 10 ml vævsbad, som indeholder en vandkappe til at cirkulere en opvarmning opløsning, en frittet glas indløb til at boble oxygen (95% / 5% O2 / CO 2 blanding) og indløbs-og udløbsporte for at ændre opløsninger. Et reservoir PSS Opløsningen opbevares med konstant bobling af 95% / 5% O2 / CO 2 blanding i et 37 ° C vandbad (ikke vist). Til opløsning udvekslinger er PSS opløsning pumpes fra reservoiret til vævsbadet indløb (bundport) ved omtrent 100 ml pr minut for at tillade relativ hurtig opløsning udveksling. Opløsningen udløb er gennem et overløb port (top port), der tillader en konstant mængde (ca. 10 ml) i vævet bath under løsning udveksling. Vi anvender et Haake opvarmning cirkulator at pumpe varmt vand gennem vævsbadet kappen (for at opretholde 37 ° C). Vævsbadene kan fås fra en række leverandører og kommer i mange forskellige størrelser og stilarter, der passer til de eksperimentelle behov investigator.
- En krafttransducer. At måle isometrisk spænding er luftrøret røret gevind på L-formede ender af to rustfri stål-stænger (fig. 2A). Der skal sørges for at anvende en rustfri ståltype, som er kompatibel med biologisk materiale. Den øverste stang er forbundet via en klemme til en isometrisk krafttransducer. Den nederste stang holder trachea i en fast position og er monteret på en mikrometer til justering af passiv spænding og / eller muskel længde. Sammentrækning af luftrøret skaber spændinger på krafttransducer, som omdannes til et spændingssignal på forforstærkeren. Den nederste stang kan også være konfigureret til at omfatte to rektangulære platin plader (4 mm fra hinanden) t hat flanke trachea (figur 2B). Platin Pladerne er forbundet til en Grass S88 stimulator, der tillader levering af et elektrisk felt over trachea. Åbne ledningerne og loddemetal er belagt med Sylgard (Sylgard 184 silikoneelastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI), for at forhindre udvaskning af metaller i badet opløsningen.
- A / D konverter, computer og erhvervelse software. Signaler fra forforstærkeren er optaget på en MacLab 8 A / D-system. Dette er en ældre version af den aktuelle ADInstrument Powerlab hardware. Vi bruger programmet Chart (ADlnstruments), der giver mulighed for kontinuerlig registrering af spændinger i hele forsøget. Spændinger generation af luftrøret muskler er ganske langsomt, og derfor finder vi, at erhvervelsen af 100 point per sekund er tilstrækkelig. Spændingen Målingen kalibreret under anvendelse af kendte vægte (op til 5 g) før hvert eksperiment. Tilsvarende systemer er tilgængelige fra andre venders (f.eks BioPac, GW Instruments).
- Før væv isoleret kraften transduceren kalibreres med kendte vægte, og vævsbadet er fyldt med normale PSS (se tabel I). Luftindtaget justeres til opnåelse af en let strøm af O2 / CO2.
- Tracheas fra to måneder eller ældre mus er optimale. Yngre dyr kan anvendes, men tracheas hidrørende fra disse kræver større evner til at montere på krafttransducer ledningerne på grund af deres lille størrelse. Før dissektion, mus dybt bedøvet med isofluran. Den rette niveau af sedation er nået, når en tå-knivspids med pincet er i stand til at fremkalde en reaktion. Mus umiddelbart aflivet ved cervikal dislokation En vigtig. Bemærk: Vi har observeret, at Avertin (tribromethanol), et sedativt almindeligvis anvendes i mus, har stærke afslappende virkning på glat muskel i luftvejene og bør derfor ikke anvendes til trachea sammentrækning undersøgelser.
- Huden (og pels) fjernes fra brystkassen til halsen. RIBS er skåret fra bunden af brystbenet, lateralt (på begge sider) til toppen af hjertet. Den brystben og ribben bliver derefter trukket frem til halsen til at afsløre hjerte / lunger, thymus, luftrør (ventrale) og spiserør (knyttet til - og dorsale til luftrøret).
- Luftrøret udskæres ved at skære under bronkial forgreningen og over pharynx. Luftrøret er anbragt i en iskold oxygeneret (95/5) PSS-opløsning (sammensætning anført i tabel I).
- Trachea dissekeres fri for omgivende væv. Under rengøringen kan luftrøret holdes på svælget eller under bifurkaturen. Dog bør der udvises forsigtighed ikke direkte anvende tang til luftrøret selv. Fine saks kan bruges til at afskære det omgivende væv, men snittet skal altid være parallel med trachea for at undgå beskadigelse. Denne del af proceduren lettes, hvis trachea præparatet er fastgjort under forgreningen og over pharynx på en Sylgard-belagt beholder (Sylgard 184 SiliconeElastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI).
- Efter fjernelse omgivende væv, luftrøret skåret under pharynx og over bronkial bifurkaturen og forsigtigt anbragt på krafttransducer ledninger.
- Luftrøret er forsynet med gevind over to L-formede metaltænder (figur 2A). En krog er forbundet til en kraft-forskydningsprofil transducer til kontinuerlig registrering af isometrisk spænding. En anden gren er forbundet med et mikrometer. Vævsbadet hæves derefter, således at luftrøret er nedsænket i PSS. Montering af luftrøret bør ske så hurtigt som muligt for at minimere den tid, luftrør holdes uden for PSS. Med praksis, kan montering af luftrøret ske inden for et minut, men vi generelt undgå gange længere end 3 minutter for at undgå tab af levedygtighed.
- Mikrometer justeres langsomt til opnåelse af en passiv spænding på ~ 10 mN (~ 1 gram-kraft). Den optimale hvilespænding blev bestemt empirisk, og vi har fundet, at passiv spænding på ~ 5-10 MN resulterer i en ækvivalent maksimale respons på højt kaliumindhold stimulering. Dette er konsistent med en række andre undersøgelser, der anvender en passiv spænding i dette interval 16,17,18. Løbet af de første 5-10 minutter, tendens trachea passiv spænding at falde noget (stress-relaksation fænomen) og mikrometer anvendes til at justere den passive spænding ~ 10 mN under ækvilibrering. Trachea får lov at ækvilibrere i mindst 1 time før eksperimentelle udfordringer.
3. Høj Kalium Stimulation
Efter ækvilibrering er luftrøret udfordret to gange med en høj kalium PSS-opløsning (67 mM KCI, tabel I). Kontraktionen kræver generelt ~ 5-10 minutter for at nå steady-state, på hvilket tidspunkt vævsbadet skylles flere gange med normale PSS fuldstændigt slappe trachea. Kalium sammentrækning gentages endnu en gang, og en tredje tid (om nødvendigt), indtil reproducerbare kontraktioner opnås.
Luftrøret er flankeret af to rektangulære platin plader (elektroder), som tillader elektrisk felt-stimulering (EFS) til præparatet. Den kontraktile reaktion EFS er en funktion af frekvens og spænding. Det er også påvirket af fysiske parametre såsom område af elektroderne og afstanden mellem dem. De elektriske egenskaber stimulatoren også påvirke svar sådan, at ved højere spændinger og Strømudgange stimulatoren kan nå sit maksimum. De karakteristiske træk ved ethvert EFS bør fastlægges ved at undersøge muskel kontraktile respons på forskellige stimuli varigheder, frekvenser, spændinger og impulsvarigheder. Til vores eksperimentelle opsætning, har vi fundet, at elektroderne er adskilt med ~ 4 mm, og stimulering amplitude på 44 V (0,5 ms pulser) og 30 Hz er optimale for at opnå reproducerbare næsten maksimale kontraktile responser.
5. Sammentrækning Evoked af cholinerg stimulation
Reaktionsevne af luftrøret til eksogent anvendte forbindelser vurderes enten ved tilsætning af en enkelt dosis af lægemidlet af interesse eller ved multiple tilsætninger af lægemidlet i en kumulativ dosis måde. For luftrøret, rutinemæssigt vores laboratorium anvendes carbachol til at aktivere cholinerge receptorer, fordi, i modsætning til acetylcholin, carbachol ikke nedbrydes af acetylcholinesterase. En rimelig dosis-respons er fra 10 -8 til 10-5M carbachol. Montering af log [carbachol]-kontraktilt respons-kurve med en Hill-type ligning giver en estimering af EC50 (halv-maksimal effektiv koncentration), som er et mål for følsomhed af tracheal kontraktion af cholinerge agonist 19. Det er værd at bemærke, at en given dosis af carbachol giver en lidt større respons som en enkelt dosis end som en del af en kumulativ dosis-responskurve.
6. Repræsentative resultater Et eksempel på et kontraktilt respons på højt kaliumindhold er vist i figur 3A. Den sammentrækning når et maksimum inden for cirka 10 minutter, men kan vise et lille fald derefter. Under tidlig udvaskning af høj kalium kan muskel viser en forbigående stigning i sammentrækning, som skyldes et fald i temperatur som det lille volumen af uopvarmet PSS opløsning i opløsningen linier transient gennemløber vævet præparatet. Dette kan minimeres ved at have en minimal dødvolumen i slangen forbinder den opvarmede PSS reservoiret og vævsbad, og også ved at udveksle opløsning relativt hurtigt (vi generelt pumpe opløsninger ved 100 ml / min). Hver forberedelse vil have nogle forskelle i kontraktile respons på grund af forskelle i muskelmasse eller skader opstået under dissektion. Figur 3B viser to tracheas med forskellig muskelmasse udfordret med høj kalium og carbachol. Skønt de cholinerge-fremkaldte kontraktioner forskellige,y er ens efter normalisering til reaktion med højt kaliumindhold opløsning (figur 3C).
Figur 4 viser et eksempel på en carbachol (cholinerg) fremkaldte kontraktion med enkeltdoser (A) og en kumulativ stigning (B). De carbachol opløsninger tilsættes direkte til badet og boblet gas hjælper med hurtig blanding. Det er værd at bemærke, at tilsætningen af en enkelt dosis (dvs. 1 uM, figur 4A) har en lidt større respons end den tilsvarende koncentration i en kumulativ dosis-responskurve (1 uM, figur 4B). Figur 4C viser et plot af kontraktion kraft som en funktion af carbachol koncentrationer under anvendelse af data fra figur 4B. Virkningerne af carbachol mættes ved 10 -5 M koncentration. Selv cholinerge agonister initierer kontraktion ved calciumfrigivelse mekanismer, er en væsentlig komponent af kontraktionen også medieres af depolarisering ogaktivering af spændingsafhængige calciumkanaler 20.
Figur 5A viser et eksempel på EFS-fremkaldte kontraktioner. Tracheas stimuleres ved anvendelse af 0,5 millisekund varighed, 40 volt pulser indtil veerne nå et plateau (se indsat a1). En stigning i stimulation frekvens forårsager en øget kontraktilt respons (frekvens-respons-kurve er afbildet i figur 5B). Elektrisk felt stimulation er blevet vist at fremkalde kontraktioner overvejende ved at aktivere præsynaptiske nerver. Dette fremgår af virkningen af botulinumtoksin, en blokker af neurotransmitterfrigivelse, der blokerer de fleste EFS-fremkaldte kontraktioner af trachea 21. Desuden tetrodotoxin, et middel, der blokerer Na +-kanaler inhiberer også nerveaktivitet og eliminerer reaktion trachea på EFS.
Figur 1. Diagram tHan større signalveje i en isoleret trachea præparat. Vist en cholinerg axon terminal innerverer en tracheal glat muskelcelle. De vigtigste signalveje er M3-og M2-muskarine acetylcholin-receptor-aktivering (mAChR), der forårsager calcium frigørelse gennem IP3 receptorer (M3) og reduktion af cAMP (M2). M2-receptorer (og et bidrag af M3-receptorer) også forårsage cholinerge-fremkaldte depolarisering, som aktiverer L-typen spændingsafhængige calciumkanaler og calciumindstrømning. Fælles kontraktile agenter og deres effektorer er 1. høj kalium (depolarisere glat muskelceller og cholinerg axon) 2. elektrisk felt stimulering (EFS, depolariserer kolinerge axon) og 3. exogen anvendelse af cholinerge midler, såsom acetylcholin eller carbachol (aktiverer muskarinreceptorer direkte).
Figur 2. Diagram af udstyr anvendt til at måle trakeale kontraktioner. A. krafttransducer, mikrometer og vævsbad er monteret på støtte stænger via skruetvinger. Den tracheale ring er forsynet med gevind på den øverste og nederste stænger. I diagrammet er vævsbadet anbragt under fremstillingen (dvs. under montering af trachea på krafttransducer). Under kontraktion undersøgelser er vævsbadet bevæges vertikalt for at bade præparatet. B. For elektrisk felt stimulation bunden stangen er modificeret til at indbefatte to platin plader, der er monteret lateralt til trachea bedrift ledning. Platin Pladerne er forbundet med elektriske ledninger til en stimulator.
Figur 3. Eksempler på højt kaliumindhold (67 mM) kontraktile respons i trachea. (A) viser dubletter, reproducerbare respons på højt kaliumindhold. (B) Eksempler på kontraktile respons over for carbachol af to forskellige tracheas. (C) Reaktionerne på tracheas i B er ens, når normalisered til den høje kalium respons.
Figur 4. Eksempler på carbachol-inducerede kontraktioner. (A) carbachol-inducerede kontraktioner med enkeltdoser efterfulgt af udvaskning. (B) Eksempel kumulativ dosis-responskurve for trachea i A. (C) top kontraktioner fra B er afbildet som en funktion af carbachol koncentration.
Figur 5. Eksempler på kontraktioner fremkaldt ved elektrisk felt-stimulering. (A) Elektrisk felt stimulering af luftrøret sammentrækning ved anvendelse af 0,5 ms puls, 40 volt, og forskellige stimulerende frekvenser som angivet. Indsat er tid udvidet sammentrækning ved 30 Hz. (B) Peak sammentrækninger fra A er plotted som en funktion af stimulation frekvensen.
Normale PSS
| Salt | Konc. (MM) | Mængde (g / 2 L) |
| NaCl | 119 | 13,91 |
| KCl | 4,7 | 0,7 |
| KH 2 PO 4 | 1,18 | 0,32 |
| MgSO 4 x 7H 2 O | 1,17 | 0,58 |
| NaHCO3 | 18 | 3,02 |
| EDTA | 0,026 | 0,1 ml 0,5 M |
| Glucose | 11 | 3,96 |
| Saccharose | 12,5 | 8,56 |
| CaCl2 | 2 | 400 ml 10 mM |
Høj-K + PSS (NACl og KCl justeringer)
| Salt | Konc. (MM) | Mængde (g / 2 L) |
| NaCl | 56,7 | 6,628 |
| KCl | 67 | 9,991 |
. Tabel 1 Opskrift på PSS løsninger. Bemærk: Løsninger er lavet frisk ugentligt med ultrarent vandkvalitet, og er gemt i et køleskab i længere tid end 5 dage for at undgå forurening vækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her tilvejebringer en fysiologisk præparat til at vurdere luftvejene muskelfunktion. Vi plejer at betjene 3-4 organbad præparater samtidigt, dog færdigpakkede systemer er tilgængelige fra en række leverandører, der tillader samtidige målinger af op til 8 præparater (ADlnstruments, Verden finmekaniske Harvard apparat). Vi har anvendt en række krafttransducere og væv organbade med tilsvarende resultater. Imidlertid finder vi, at elektrisk felt stimulation giver nogen variation baseret på små forskelle mellem stimulerende elektroder størrelse, afstanden mellem elektrodepladerne og placering af forberedelserne inden det elektriske felt. Derfor skal ekstra pleje foretages for at gøre feltelektroder så ens som muligt.
En af de mest kritiske parametre i isometriske kraft målinger er spørgsmålet om normalisering sammentrækninger for at kompensere for variationer i muskelmasse, ellersundhed muskelvæv mellem forskellige præparater. Delvist, kan forskelle kan minimeres ved at sammenligne dyr af samme alder og samme køn (hunmus tendens til at generere reduceret trachea spænding). Endvidere har vi fundet, at normalisering til trachea våd eller tør vægt mangler tilstrækkelig nøjagtighed, muligvis på grund af den lille størrelse af mus trachea. Snarere anvendelsen af multiple, høje kalium, sammentrækninger er ganske fordelagtigt. Høje kalium sammentrækninger tjener to formål. Den høje kalium sammentrækning ser ud til at "vække" den trakeal muskel og sikrer, at veerne er reproducerbare, før du fortsætter med eksperimentelle udfordringer. Den høje kalium kontraktion forekommer også at være en nøjagtig normalisering af aktiv muskelmasse, der er til stede i præparatet. Således er eksperimentelle spændingshovedpine målinger udtrykkes ofte som kraft normaliseret til høj kalium sammentrækning. Derudover kan kvaliteten af et præparat vurderes ved anvendelse af høje kalium-induceret kontraktion. For eksempel, finder vi, at 8 - 10 uger gamle C57BU6J hanmus har en høj kalium-fremkaldt kontraktion af 20 ± 3,8 mN (middelværdi ± standardafvigelse, n = 17). Hvis et luftrør forberedelse kontrakter ligger langt under dette interval (under 12 mN eller to standardafvigelser under betyde), så er det generelt betragtes som "beskadiget" og ikke anvendes til eksperimenter. Alternativt kan normalisering af spænding til den maksimale spænding i mættende cholinergisk agonist anvendes. Dette er nyttigt for at observere ændringer i følsomhed over for agonist, men kan gå glip af ændringerne, at effekten af den maksimale sammentrækning.
Metoder blev præsenteret for at aktivere sammentrækning enten ved hjælp af en kolinerg agonist eller med elektrisk stimulation. Cholinerg agonist ansøgning til vævsbadet direkte aktiverer glat muskel. I modsætning (op til 25 Hz), moderat EFS stimulering frekvens størstedelen af kontraktionen medieres via nerven aktivering og frigivelse af neurotransmitter 22. Således investigator har mulighed for at undersøge stoffer, som påvirker præsynaptisk / nerve-medieret kontraktion ved hjælp af EFS stimulation. Endelig undersøgelser indikerer, at andre celletyper, såsom mastceller 23 og epitelceller 24 også påvirker kontraktilitet i det isolerede trachea præparat. Således in vitro mus trachea præparat tilvejebringer en robust funktionelt assay for en række celletyper, der påvirker luftvejenes glatte muskulatur.
Sammenfattende har mus in vitro trachea præparat er særligt nyttige til analyse af genetiske ændringer, der påvirker luftvejene funktion. Nogle eksempler kan nævnes analyse af gen-knockouts af ionkanaler 17,20,25,26 og metabotropiske receptorer 27,28,29,30, og nedstrøms signalleringskaskader 31. Desuden er antigenet udfordret mus ofte anvendes til astma undersøgelser 32 og in vitrotrachea forberedelse giver en nyttig analyse for ændringer i kontraktilitet, som indledes efter udviklingen af astma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af en bevilling fra Center for Innovation i forebyggelse og behandling af luftvejssygdomme, NINDS tilskud (NS052574), og fra Sandler Program for Asthma Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analogue-Digital Converter |  ADInstruments |
PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20 °C) |
| Charting Software | ADInstrtuments |
LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
References
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
- Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
- Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
- Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
- Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
- Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
- Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
- Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
- Garssen, J., Loveren, H. V. an, Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
- Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
- Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
- Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
- Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
- Kenakin, T. P. A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , 3rd edn, Academic Press/Elsevier. (2009).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
- Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
- Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
- Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
- Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
- Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
- Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
- Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
- Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
- Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
- Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
- Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).
