Hybridisering Published: June 28, 2012 doi: 10.3791/3709

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jennifer Juhn¹, Anthony A. James^1,2

¹Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, ²Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Summary

Temporala och spatiala genuttryck analyser har en avgörande roll i funktionsgenomik. Hela-mount hybridisering

Abstract

Myggor är vektorer för en mängd olika patogener, inklusive arbovirus, protozoiska parasiter och nematoder. Undersökning av avskrifter och lagstiftare gen som uttrycks i vävnader där mygga värd och patogen interagera och i organ som deltar i reproduktionen är av stort intresse för strategier för att minska myggor smittspridning och störa ägg utveckling. Ett antal verktyg har använts för att studera och validera den tidsmässiga och vävnadsspecifika reglering av genuttryck. Här beskriver vi protokoll som har utvecklats för att få geografisk information, vilket ökar vår förståelse för där specifika gener uttrycks och deras produkter samlas. Protokollet som beskrivs har använts för att validera uttryck och bestämma ackumulering mönster av transkript i vävnader i samband med myggor patogen överföring, såsom kvinnliga spottkörtlar samt subcellulära fack av äggstockar och embryon som ärsent att mygga reproduktion och utveckling.

Följande procedurer utgör en optimerad metod som förbättrar effektiviteten hos olika steg i protokollet utan förlust av mål-specifika hybridiseringssignaler. Riktlinjer för RNA-prob förberedelse, är dissekering av mjuka vävnader och det allmänna förfarandet för fixering och hybridisering som beskrivs i del A, medan åtgärder som är specifika för insamling, fixering, pre-hybridisering och hybridisering av mygga embryon beskrivs i del B.

Protocol

A. Hybridisering in situ för mjuka vävnader: Mosquito Salivkörtlar och äggstockar

Recept för lösningar och buffertar som krävs för följande förfaranden beskrivs i tabell 1.

1. RNA Probe Förberedelser och kvalitetsanalys

1. Konstruera primrar för PCR-amplifiering av transkriptet målet av intresse. Det rekommenderas att amplikonet är minst 600 nukleotider i längd och, ännu viktigare att amplikonet sekvensen är unik för den mål-transkriptet. Sekvenser som är icke-unika undviks, för att eliminera möjligheten att generera korsreaktiva RNA-prober.
2. Klona PCR-produkten in i pCR4 TOPO-vektorn, eller liknande kloningsvektor. Den pCR4 TOPO-kloningsvektor innehåller T7 och T3 RNA-polymeras ställen primerlösningar som möjliggör produktion av både sens-och antisens köra-off transkriptionsprodukter från en enda klon.
3. Sekvensen av det klonade amplikon för att verifiera sekvensen fidelity och orientering inom vektorplasmid.
4. Utföra en restriktionsdigerering reaktion med ett enzym lämpligt för att framställa en antisens transkription in vitro produkt. Plasmiden linearisering görs enkelt genom att välja ett restriktionsställe beläget i den multipla kloningsregionen av pCR4 TOPO-vektom såsom Spe I, Pst I, eller Not I. Säkerställa att den valda restriktionsställe är inte närvarande i den klonade fragmentet. Samma klon kan användas för att generera en sense-sträng-RNA-sond, som tjänar som en bakgrundskontroll. Hybridisering in situ med en sensproben bör ge liten eller ingen signal, jämfört med den för den komplementära antisens-sond.
5. Verifiera genom gelelektrofores att pCR4-TOPO klon helt linjäriseras.
6. Rena den lineariserade plasmid-DNA genom att utföra en fenol-kloroform-extraktion, följt av etanolutfällning. Vid utfällning av plasmid-DNA är det rekommenderat att använda en slutlig concentranson av 2 M ammoniumacetat med 2,5 volymer etanol för att reducera överföring av kvarvarande salt i transkriptionsreaktionen in vitro.
7. Framställa digoxigenin (DIG)-märkta enkelsträngade RNA-sond genom att utföra en run-off-transkription in vitro reaktion, med användning av 1 ng av lineariserat plasmid-DNA som mall. Förbered reaktionen med RNA-polymeras, transkription buffert och DIG RNA märkning mix som beskrivs av tillverkarens instruktioner.
8. Rena den DIG-märkt in vitro-transkriptionsprodukter av etanolutfällning och återsuspendera de pelleterade RNA: t i DEPC-behandlat destillerat vatten.
9. Kontrollera kvaliteten och förväntade molekylvikten av den renade DIG-märkt RNA-sond från formaldehyd-gel-elektrofores. Den preparerade RNA-sond kan delas in i alikvoter och lagrades vid -80 ° C fram till användning.

2. Dissektion av Mosquito Salivkörtlar och äggstockar

1. Dissekera mygga saliv Glands användning av en prob och pincett som beskrivits tidigare för AE. aegypti. ^1,2 För An. gambiae och spottkörtlar kan dissekeras som beskrivits för Ae. aegypti, eller alternativt som beskrivs i MR4 Metoder för Anopheles forskning manual. ³
2. Dissekera mygga äggstockar med användning av tänger som beskrivits tidigare för Ae. aegypti. ⁴ korthet använda en pincett för att ta tag i bröstkorgen, medan en annan pincett drar av den näst sista buken segmentet att frigöra äggstockarna.
3. Samla dissekerade spottkörtlar eller äggstockar i Ambion RNAs-fri 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 50 ^ il PBS.
4. Behåll prover på is tills fixering.

3. Fixering

1. Fixera dissekerade vävnaderna i nyframställd mjukvävnad fixeringslösning (tabell 1) vid rumstemperatur med nickning under 30 min till 1 timme. Fixeringen lösning framställs färskt att förhindra oxidatjon av formaldehyd fixativ. Fixering under 1-1,5 timmar rekommenderas för spottkörtlar. En minimal volym av 1 ml rekommenderas för fixering vävnader i en 1,5 ml mikrofugrör.
2. Tillåta vävnaden att sedimentera till botten av mikrofugrör. Detta är ett viktigt steg, som följer alla förändringar av lösningar i protokollet och kommer att minimera betydande urval förlust.
3. Dekantera den fixeringen lösningen genom försiktig pipettering, vilket 50-100 fil av volym i mikrofugrör och tvätta sedan 3 ×, 5 min vardera med PBT.
4. Valfria ekvilibreringstider steg för mjukpapper förvaring. Stegvis skölja PBT med antingen etanol eller metanol. Utföra stegvis tvättar med PBT / alkohol (3:1, 1:1 och 1:3, 5 min vardera). Lagra i 100% (200 proof) alkohol vid -20 ° C. Vävnader kan lagras under flera månader utan nedbrytning av vävnad ultrastruktur. Innan du utför följande steg i protokollet måste vävnaderna tillbaka till PBT genom stegvis jämvikt med alkohol / PBT (3:1, 1:1,1:3, 5 min vardera).
5. Utföra PBT tvättar 3 x, 5 min vardera.
6. Utföra proteinet digerering med 0,01 mg / ml proteinas K / PBT, 5 min vid rumstemperatur. Alternativt, om både immunolokalisering av proteinmål och hybridisering in situ av RNA önskas, kan äggstockarna inkuberas med 80% aceton / _H2O vid -20 ° C under 10 minuter i stället för behandling med proteinas K.
   Proteinas K-behandling har utelämnats för framställning av spottkörtlar. Gå direkt till steg 3,10.
7. Omedelbart dekantera matsmältningen lösningen genom försiktig pipettering. Tvätta 2 ×, 5 min vardera med iskall PBT för att stoppa matsmältning.
8. Utföra ytterligare PBT tvättar 2 x, 5 min vardera vid rumstemperatur.
9. Post-fixa i mjuk vävnad fixering lösning vid rumstemperatur med nickning under 30 min. Post-fixering steg inte utförs för spottkörtlar.
10. Utför PBT tvättar 5 ×, 5 min vardera.

4. Hybridisering

1. Häll så mycket Hyb / PBT som möjligt. Tillsätt 1 ml av Hyb i varje provrör.
2. Linda provröret i förslutna luft skyddande förpackning (bubbelplast) och placera i en hybridisering flaska. Försegla flaskan med en hybridise-flaskkapsyl.
3. Förhybridisering och hybridisering steg kan utföras enkelt i en hybridiseringsugn. Utföra förhybridisering vid 55 ° C under 30 minuter under rotation.
4. Tillräcklig tid för vävnaderna att sedimentera till botten av mikrofugrör, som Hyb är tätare än PBT. Dekantera försiktigt före hybridiseringslösningen. Vävnader kan bli genomskinliga och svåra att visualisera. Provet kan reduceras genom att låta 50-100 pl av lösning volymen i varje provrör.
5. Tillsätt 50 pl volym av Hyb i provröret och bibehålla i ett värmeblock vid 55 ° C.
6. Denaturera RNA-sond vid 85 ° C under 5-10 min. Omedelbart genom att placera den denaturerade sonden på is under 5 minuter.
7. Pipettera RNA-sond in i provröret. RNA-proben kommer att flyta till ytan av den Hyb. Blanda genom att ställa röret försiktigt.
8. Utföra hybridisering i en total volym av 50-100 | il av Hyb per prov. Proven i en fast kuggstång mikrofug inuti en hybridiseringsugn, eller i en flytande mikrofugrör stället i ett vattenbad vid 55 ° C under 16-24 timmar.

5. RNas A-behandling

1. Ta bort Hyb innehåller sonden. Det är viktigt att hålla proverna vid 55 ° C under tvättstegen för att minska icke-specifik bindning av återstående obunden prob. Om flera prover hybridiserades, rekommenderas att hålla provrör i en inställd värmeblock vid 55 ° C för att bibehålla den hybridiseringstemperaturen hela tvättningsstegen.
2. Utför en snabb tvätt med Hyb genom att pipettera 1 ml lösning i mikrofugen badkarete och invertering av provröret 5-6 gånger.
   Alla efterföljande snabba tvättar i protokollet utförs på liknande sätt genom att tillsätta lösningen som behövs och vända på provröret flera gånger.
3. Utföra två ytterligare tvättningar med Hyb vid 55 ° C, 30 min vardera med rotation i den hybridiseringsugn.
4. Jämvikta i PBT genom inkubation vid rumstemperatur med Hyb / PBT (1:1) under 15 min med nickning.
5. Utför PBT tvättar 5 ×, 5 min vardera.
6. Framställ färsk RNAse A-buffert. Utföra RNas A-behandling genom att inkubera i 20 | ig / ml RNAs A / PBT vid 37 ° C, under 30 minuter. RNAse A klyver enkelsträngat RNA och kommer att resultera i nedbrytning av ohybridiserad sond-RNA.
7. Dekantera RNAse en buffert och utför en snabb tvätt med PBT.
8. Utföra PBT tvättar 3 x, 5 min vardera.

6. Antikropp Inkubation

1. Framställ färsk blockeringslösning (5% kycklingserum / 1% Western blockeringsreagens / PBT) och blocket prover genom inkubatorting i 1 ml lösning i 30 min vid rumstemperatur med nickning.
2. Tillsätt 200 pl av en 1:1000 utspädning av anti-DIG-alkaliskt fosfatas (AP)-konjugerad antikropp i blockerande lösning. Inkubera vid 4 ° C över natten med nickning.

7. Alkaliskt fosfatas Färgning

1. Avlägsna antikroppen och blockerande lösning.
2. Utför en snabb tvätt med PBT.
3. Utföra ytterligare PBT tvättar 5 ×, 10 min vardera. Alternativt proverna kan tvättas 3x, 10 min vardera följt av en förlängd tvättning vid 4 ° C över natten med nickning.
4. Bered en färsk AP färgning buffert.
5. Utför snabb tvätt med AP färgning buffert.
6. Utföra ytterligare tvättar med AP färgning buffert 3 ×, 5 min vardera nutation.
7. Förbered, enligt tillverkarens instruktioner, färsk AP färgning lösning innehållande AP underlaget NBT / BCIP.
8. Inkubera varje prov med 500 pl av AP-färgning lösning vid rumstem-arbetstemperaturE med nickning, i mörkret. Proverna kan inkuberas genom att täcka rör med en ogenomskinlig behållare eller aluminiumfolie. Reaktion progression ska följas upp var 1-2 minuter för bildandet av en lila fällning. Beroende på sondens koncentration, koncentration av mål-RNA och närvaro av icke-specifika mål, kan färgning fortgå under flera minuter till flera timmar.
9. Avlägsna så mycket av färglösningen som möjligt. Otillfredsställande dekantering resulterar i bildningen av en vit flockig utfällning under efterföljande tvättsteg.
10. Färgningen stoppas helt genom att utföra två snabba tvättar med PBT.
11. Utföra ytterligare PBT tvättar 3 x, 5 min vardera.

8. Glycerol Montering

1. Användning av en stor öppning 200 mikroliter pipettspets, överföra prover från mikrofugrör till individuella rundbottnade brunnar i en Pyrex-provplatta.
2. Försiktigt bort från provet så mycket av PBT som möjligt.
3. Pipett på toppen av provet 70% glycerol / H ₂ O Låt glycerol till genomsyra vävnadsprover vid 4 ° C över natten. Glycerol behandling förebygger uttorkning av vävnaderna under bildspel montering.
4. Förbered objektglas genom att torka av glidytan rent med Kimwipes. Applicera på bilden två stycken osynliga band parallellt med varandra så att de bildar en smal kanal (figur 2).
5. Användning av en konstnärlig borste, plocka upp prover en i taget och placera dem utmed längden av kanalen, att positionera varje prov med samma orientering, med avseende på främre / bakre och dorsala / ventrala inriktningar.
6. När du har placerat varje prov, använd en Kimwipe bomullstopp för att absorbera överskottet glycerollösning omgivande vävnaderna (Figur 3). Avlägsnande av överskott av glycerol är viktig för att förhindra bildning av bubblor, när förslutning de monterade proven på objektglaset under ett täckglas.
7. Center och plats noggrant ACöver slip över kanalen innehåller inriktade proven. Fäst locket glider halvpermanent på bilden genom att badda hörnen på täckglaset med transparent nagellack.
8. Med hjälp av en 200 ul pipett, dosera långsamt i ena änden av kanalen tillräcklig 70% glycerol för att fylla genom kapillärkraft hela utrymmet i kanalen och området under täckglaset.
9. Permanent försegla de monterade proven genom att applicera lack längs alla fyra sidor av täckglaset. Låt nagellack att torka tillräckligt innan fotografering av de hybridiserade hel-mount vävnader. Det rekommenderas att fotografera bilder av proven omedelbart efter montering.

B. Hybridisering in situ för Mosquito Embryon

Lösningar och buffertar som krävs för hybridisering in situ för myggnät embryon beskrivs (tabell 1). Fixering och hybridisering förfaranden som presenteras här har ändrats från Those redovisas först för Anopheles gambiae, ^5,6 Aedes aegypti ⁷ och Culex quinquefasciatus. ⁸

1. Embryosamlingsgrupp

1. Embryon in från 300 parade, kvinnliga vuxna myggor (tilläts att para med hanar under 48 h, 3 dagar efter uppkomst) 72 h efter blod utfodring. Myggorna bibehålls på 3 M sackaroslösning, i syfte att förhindra oviponering före den avsedda insamlingsperioden.
2. Förbered behållare embryosamlingsgrupper genom att rikta en 16 oz. papperskopp med Saatilene Hitech mesh, så att den inre ytan av koppen är täckt helt. Nätet kan vara fäst med hjälp av en enda stapel. Med denna maskstorlek kraftigt minskar fibrösa föroreningar som finns om Whatman filterpapper eller pappershanddukar används.
3. Fyll behållaren halvfull med destillerat vatten.
4. Embryon uppsamlas under 1 h genom att placera uppsamlingsbehållaren i buren, som därefter täcksav en mörk duk för att stimulera äggläggning.
5. Insamlade embryon får mogna till önskade utvecklingsstadier utanför buren i standard häckningen (85% relativ luftfuktighet / 26 ° C). Mognad av embryon till olika stadier kan korreleras till tid (timmar efter oviponering-) efter den ungefärliga utvecklingsmässiga tidsförloppet för embryonala händelser som beskrivs (tabell 2). Denna tabell sammanfattar viktiga händelser i embryonal utveckling för Aedes aegypti, som rapporterats av Raminani och Cupp beskrev ^9,10 Anopheles gambiae först genom Ivanova-Kazas ¹¹ och vidareutvecklas av Goltsev och kollegor, ^12,13 och Culex quinquefasciatus rapporteras av Davis ^14. Den tid som beskrivs kurserna är avsedda att tjäna som första uppskattningar, snarare än absoluta tidpunkter, för insamling av embryon vid särskilda stadier av utveckling.

2. Dechorionation, fixerad och Endochoripå Störning

1. Överföra embryon från uppsamlingsbehållaren in i en Saatilene mesh dechorionation spärren rör (fig. 3).
   För Aedes embryon, placera fångsten röret i en bägare som är fylld med tillräckligt destillerat vatten så att volymen av fångsten röret är hälften full. Ett konstnärligt borste kan användas för att driva bort de embryon från Saatilene nätet och överföra dem i vattenfyllda bifångst rör.
   För Anopheles embryon, lossa Saatilene nät från uppsamlingsbehållaren och vik nätet försiktigt för att forma en tratt. Hålla masken tratten med en hand, använda den andra handen för att dispensera destillerat vatten genom en polyetylen sprutflaska längs sidorna av tratten för att tvätta de embryon in i spärren rör. Denna metod kan tillämpas på Anopheles embryon eftersom de saknar den adhesiva substansen är närvarande på ytan av Aedes embryon, vilket möjliggör ägg att fastna oviponering substrat.
2. Prepare 40 ml dechorionation lösning (1 volym 5,25% natriumhypoklorit: 3 volymer destillerat vatten). Häll ut lösningen på en 100 mm petriskål.
3. Förbered en 100 ml bägare innehållande 50 ml destillerat vatten och ställ åt sidan. Den dechorionation steget är tidskänslig och omedelbart efter natriumhypoklorit behandling embryona kommer att vara nedsänkt i vattnet, för att späda ut dechorionation lösningen.
4. Dechorionate embryona i ingrepp fånga röret genom att placera röret i en petriskål fylld med dechorionation lösning. Använda en engångspipett polyeten överföring eller pasteurpipett för att tvätta de embryon, under virvling haken flaskan så att embryona förblir nedsänkt och omrördes i dechorionation lösningen.
   Maximalt 35 sek krävs för dechorionation av Aedes embryon, medan 75 sek är tillräcklig för Anopheles-och Culex embryon (tabell 3). Dechorionation är en av de mest känsliga stegen av protocol och över-förlängning av natriumhypoklorit behandlingen, speciellt för Aedes embryon kommer att förhindra riktiga sprickbildning i chorion.
5. Omedelbart dränka fångsten flaskan i bägaren innehållande vatten.
6. Tvätta bort den återstående dechorionation lösningen från embryona genom att avlägsna spärren röret från det vattenfyllda bägare och sköljning av de inre och yttre väggarna av spärren rör med destillerat vatten från en sprutflaska eller kran försedd med rör.
7. Dechorionation kan verifieras genom att visualisera de embryon med ett dissekerande mikroskop vid låg förstoring. Dechorionated Aedes embryon saknar nät-liknande exochorion och endast jämn, polerad yta av den svarta endochorion framgår För dechorionated Anopheles embryon, de exochorionic flyter och strukturer åsen är frånvarande (Figur 4).
8. Med en konstnärlig pensel, överföra dechorionated embryona i en scintillationsflaska innehållande 5 ml destillerat waTER (Figur 5-1). Om multipla prover bereds, bibehålla de fångst rören i vatten för att förhindra uttorkning av embryona.
9. Låt embryona sedimentera till botten av scintillationsflaska och avlägsna så mycket vatten från flaskan som möjligt.
10. Tillsätt 5 ml heptan i scintillationsflaska (figur 5-2). Avlägsnande av eventuellt kvarvarande vatten som finns kvar i scintillationsflaska.
11. Lägg till scintillationsampull 5 ml nyframställd embryo fixering lösning (tabell 1).
12. Fäst embryon för 30 min med inversion så att de organiska fasen och vattenfasen blanda väl, men inte kraftigt.
13. Ta bort fixeringen lösningen med ett glas Pasteur pipett försiktigt så att inte störa interfas, som innehåller embryon (figur 5-3).
14. Tvätta bort kvarvarande fixeringslösning genom att fylla scintillationsflaska med så mycket destillerat vatten som möjligt. Vänd flaskan 5 gånger ochdärefter avlägsnande av all destillerat vatten.
15. Fylla scintillationsflaska med 20 ml destillerat vatten och blanda genom att vända flaskan under 30 min.
16. Avlägsna allt vatten från den scintillationsflaska.
17. Tillsätt tillräckligt kokande destillerat vatten in i scintillationsflaska så att den oorganiska fasen heptan når toppen av flaskan.
18. Inkubera under 30 sekunder och sedan avlägsna allt av det kokande vattnet.
19. Tillsätt iskallt destillerat vatten tills den oorganiska fasen når toppen av flaskan. Inkubera flaskan i is under 10 minuter.
20. Först ta bort den vattenbaserade och sedan organiska faser. Den heptan visas ogenomskinliga i detta steg (Figur 5-4).
21. Tillsätt 5 ml av ny heptan i flaskan. Ta bort alla kvarvarande vatten från flaskan.
22. Tillsätt 5 ml metanol i flaskan. Snurra flaskan 1-2 gånger energiskt, utan att skaka (Figur 6). Om de oorganiska heptan och organiska metanol faser skakas kraftigt embryona will förstöras under endochorion bristning. Det är värt att nämna att vi har observerat variation i effektivitet endochorion störningar för olika stammar av Aedes aegypti embryon.
23. Inkubera vid rumstemperatur under 15-20 min. Under detta skede kommer faserna blir grumlig på grund av utsläpp av äggula komponenter (Figur 5-5).
24. Ta bort både organiska och oorganiska faserna och tvätta med metanol 3 gånger för att avlägsna all återstående heptan.
25. Embryon kan lagras i metanol vid -20 ° C under upp till flera månader.

3. Peeling

1. Placera en bit dubbelsidig tejp tupén i centrum av en 3 cm Petri-skål. Tupén tejp används för att limmet är stabil i närvaro av metanol och etanol.
2. Användning av en stor borrning (ca 3 mm i diameter) 200 mikroliter pipettspets, embryon överföring från metanol till den dubbelsidiga tejpen.
3. Låt 1-2 min för de embryon som bosätta sig och adhere till bandets yta.
4. Dekantera överskott av metanol och låt ytan torka något för 1-2 min.
5. Tillsätt 4 ml av 95% (190 proof) etanol i en petriskål.
6. Pipett 600 | il av destillerat vatten i etanol och virvel för att blanda. Bandet blir opak färg. Tillsats av destillerat vatten kommer att orsaka att bandet att bli klibbigt och immobilisera de embryon under fanerskärningen. Detta steg kan uteslutas om så önskas.
7. Använda en 27,5 gauge nål fäst till en 1 ml spruta cylindern för att dra av den krackade endochorion (Figur 7). Efter frigöring av vita embryo från de svarta rester endochorion, överföra embryon från tejpen till etanolen reservoaren av petriskålen med användning av en fin spets konstnärliga borste. Med användning av en 3-mm borrning pipettspets, överföra embryon till ett Ambion 1,5 ml mikrofugrör innehållande 500 | il av 200 proof etanol.
   De skalade embryon får inte kvar på bandet under en längre tid eftersom de kan fastna pernent på tejpen.
8. Utföra 2-3 snabba tvättar med 100% (200 proof) etanol och lagra de embryon i pedantisk etanol vid -20 ° C. Skalade embryon kan lagras vid -20 ° C under några månader utan att påverka morfologin eller den efterföljande hybridiseringssignal.

4. Förtydligande av Yolk

1. Utför en snabb tvätt med 200 proof etanol. Punctilious etanol bör användas för alla efterföljande tvättsteg och för framställning av p-xylen äggula förtydligande lösning.
2. Gör en etanol tvätt, 5 min med nutation.
3. Inkubera i P-xylene/ethanol (9:1) vid rumstemperatur under 1-1,5 h med nickning. Xylen steg medger klargörande av gulan massa för att öka signal-brusförhållandet.
4. Ta bort xylen-etanol-lösning och utför två snabba tvättar med etanol.
5. Gör en etanol tvätt, 5 min med nutation.
6. Utför två snabba tvättar med metanol, följt av en metanol tvätt, 5 min mednickning.
7. Jämvikta i 4% formaldehyd fixeringslösning genom tvättning en gång med metanol / formaldehyd fixeringslösning (1:1).

5. Fixering och Hybridisering in situ

Fixering och hybridisering in situ förfaranden är identiska med de som beskrivits i protokollet avsnitt A.

C. Representativa resultat

Hybridiseringen in situ protokollet beskrivet här, resulterar i färgade färgningsmönster som indikerar närvaron och lokaliseringen av målsökt mRNA. Det är viktigt att betona att relativa nivåer av transkription överflöd inte kan bestämmas genom hybridisering in situ. Hybridiseringsresultaten är beroende av den specifika mRNA-sond som användes för hybridisering förfarande, mängden av mål-mRNA i den hybridiserade vävnad, såväl som probkoncentration och hybridiseringstemperaturen. Jämförelse av vävnader hybridiserades med antisens och motsvarande sense mRNA sonder gör det möjligt att exakt tolkning av färgningsmönster.

Hybridisering in situ av hela montera salivkörtlar kvinnliga Aedes aegypti med mRNA sonder som mål amylase1 (AAEL006719), D7s2 (AAEL006423) och D7L2 (AAEL006424) anger ansamling av dessa transkript i proximala-laterala, distal-laterala och distala- laterala / mediala lober, respektive (Figur 8). var ¹ hel-mount äggstockar av tre myggarter hybridiserade med mRNA prober som specifikt inriktade respektive ortologa utskrifter av Oskar (figur 9). ^7,8 Hybridisering in situ av hela mount embryon AE. aegypti, An. gambiae och Cx. quinquefasciatus utfördes med hjälp antisens RNA-prober som riktar respektive mygga Oskar ortologa transkript (Figur 10). ^7,8

IGUR 1 "src =" / files/ftp_upload/3709/3709fig1.jpg "/>
Figur 1. Skiss av post-hybridisering montering set-up.

Figur 2. Beredning av Kimwipe mopp som används under provet montering. En Kimwipe vävnad vrids hårt för att producera en fin spets MOP för att absorbera överskottet monteringsmedium från prover och bildspel.

Figur 3. Schema över Saatilene mesh dechorionation spärren rör. A) botten en 50 ml polystyren koniskt rör skärs bort för att ge en ihålig slang 4,5 cm i längd, öppen vid båda ändarna. En cirkulär öppning skärs ut ur den koniska röret locket för att tillåta vätska som skall tvättas genom ett 6,5 cm ² kvadratisk bit av Saatilene mesh. De 330 trådar per tum, behåller 34 mikron diameter tråd mesh de mygga embryon. B) Assembled fånga röret.

Figur 4. Aedes aegypti och Anopheles gambiae ägg, före och efter dechorionation. A) Aedes aegypti ägg före dechorionation. Den nätliknande exochorion ligger ovanför den svarta endochorion och ger ägget en texturerat utseende (infälld förstoring). Efter avlägsnande av exochorion, förblir endast en smidig och polerade endochorion (B och infällda utvidgning). C) Ägg av Anopheles gambiae före dechorionation. Exochorion strukturer såsom flottörer är synliga (pilar). D) Den släta och polerad yta endochorion är synligt efter dechorionation. Bar = 100 ^ m.

Figur 5. En serie av sekventiella steg för fixering och endochorion avbrott i Ae. aegypti ägg. A) Slanted-frontvyoch B) lateral-bild av scintillationsflaskor innehållande Ae. aegypti ägg under sekventiella steg fixering och endochorion störningar. 1) Embryon i destillerat vatten. 2) Embryon flyta i mellanfasen mellan den övre heptan fasen och den undre vattenhaltiga fasen. 3) Efter fixering embryona packa ihop i en rund massa. Embryon kvar i gränsytan mellan heptan och Fixeringslösning faser. 4) Efter behandling med kokande vatten och inkubering i is blir heptan fasen svagt ogenomskinlig. 5) Embryon med sönderdelade endochorions visas i mellanfasen mellan en opak heptan fas och transparent metanolfasen.

Figur 6. Endochorion avbrott i fast Ae. aegypti ägg. A) Omedelbart efter energiska virvlande heptan och faser metanol, kan bildandet av bubblor och störningar i endochorion visualiseras. B) following fem minuter inkubation vid rumstemperatur.

Figur 7. Mosquito ägg efter avbrott och avlägsnande av endochorion. Ägg av AE. aegypti (A), An. gambiae (B) och Cx. quinquefasciatus (C) efter fixering och avbrott i endochorion. Vita, genomskinliga embryon kan ses inom spruckna endochorion. Efter avlägsnande av den endochorion, de genomskinliga embryon av Ae. aegypti (D), An. gambiae (E) och Cx. quinquefasciatus (F) är tydligt. Bar = 100 ^ m.

Figur 8. Hybridiseringar på plats för tre gener som uttrycks i olika lober hel-mount, hona AE. aegypti spottkörtlar. Färgning är ett tecken på lokalisering och ackumulering av amylase1 (AAE L006719) (A), D7s2 (AAEL006423) (B) och D7L2 (AAEL006424) (B). Bar = 100 ^ m.

Figur 9. Hybridisering in situ för mygga Oskar antisense-RNA sonder till hela-mount myggnät oocyter och celler sjuksköterska. Steg IV oocyter (OOC) skäras ut från äggstockarna hos An. gambiae (A), Ae. aegypti (B) och Cx. quinquefasciatus (C) och hybridiserades med RNA-prober riktade respektive mRNA mygga Oskar. Primära follikler är orienterade med främre till vänster. Färgning på den bakre polen (blå pilspets) indikerar ackumulerade Oskar mRNA. Sekundära (f2) och tertiära (F3) follikler visas och färgning (svart pil) indikerar ackumulering av oskar mRNA i sköterska cellcytoplasman (NCC). Färgning undantas från sjuksköterskan cellkärnan (NCN). Bar = 50 pm.

ad/3709/3709fig10.jpg "/>
Figur 10. Hybridisering in situ för mygga Oskar antisense-RNA sonder till hela-mount myggnät embryon. Embryon är orienterade med främre till vänster. Cellulära BLASTODERM steg embryon av en. gambiae (A) och Cx. quinquefasciatus (C) hybridiseras med respektive myggarter-specifika Oskar RNA-prober. B) En syncytial blastodermbildning steg Ae. aegypti embryot hybridiserades med RNA-prober riktade Ae. aegypti Oskar utskrift. Färgning är tydlig i de bakre pol celler av alla embryon, vilket indikerar lokalisering och ansamling av myggor Oskar mRNA i dessa celler. Bar = 50 pm.

Tabell 1. Lösningar och buffertar för formaldehyd gelelektrofores, fixering och hybridisering in situ.

ftp_upload/3709/3709table2.jpg "/>
Tabell 2. Developmental händelser och morfologiska observationer motsvarar i följd steg under mygga embryogenes.

Tabell 3. Sammanfattning av viktiga skillnader i pre-hybridisering steg för olika vävnadstyper.

Discussion

Hybridiseringen in situ och kolorimetrisk färgning protokoll som presenteras här för Whole-mount mygga vävnader och embryon är en användbar teknik för lokalisering av transkript i specifika organ och celltyper. Dessa förfaranden är en förbättring jämfört med våra tidigare rapporterade metoder, både för att effektivisera omfattande tvättsteg och ge ytterligare tekniska detaljer och källor reagens.

Enligt vår erfarenhet är kolorimetrisk detektering av hybridiseringssignaler överlägsen känslighet och skärpa av hybridiseringssignal jämfört med fluorescensbaserade detekteringsscheman. Dessutom kolorimetrisk upptäckt kringgår frågor i samband med signalen diskriminering embryon, som är inneboende auto-fluorescerande. Begränsningar i att upptäcka hybridiseringssignaler uppstår när låg-överflöd transkript är riktade och bakgrund färgning är uppenbart. Att öka hybridiseringshastigheten temperaturen till 65 ° C har befunnits reducera tillbakamarken hybridiseringssignaler, men är inte ett förslag ersättning för att utforma en unik målspecifika RNA-prober.

Detta protokoll har använts för att utföra hybridisering in situ av hela mount salivkörtlar av Aedes aegypti, och äggstockar och embryon från Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti och Culex quinquefasciatus. Denna metod är också applicerbar på andra mygga vävnader, och förmodligen de som av andra insekter. Dessutom sammanställt vi för första gången jämförande riktlinjer för iscensättningen av embryonal utveckling i tre vektor myggor, Ae. aegypti, An. gambiae och Cx. fatigans. Observationer har rapporterats för specifika stammar av dessa tre arter, under diskreta häckningen. Det är viktigt att notera att den utvecklande tidsförloppet kan variera för olika stammar av myggarter och under olika uppfödningssystem förhållanden. Hybridiseringar på plats tillägg pågående insatser för att anaLyze de transcriptomes av myggor och andra leddjur, och kan ge en bättre bild av regleringen av genuttryck i dessa organismer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Ambion	AM9261
1M Tris-HCl	Ambion	AM9855G	pH8.0
10X PBS	Ambion	AM9625
20X SSC	Ambion	AM9763
1.5 ml microfuge tubes	Ambion	AM12400	Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Storage at 4 °C
DEPC water	Ambion	AM9932
Proteinase K	Ambion	AM2546
5.25% Sodium hypochlorite	Austin’s		A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus	Ambion	AM2733	Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase	Ambion	AM2082	Storage at -20 °C
95% Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-500
HPLC-grade methanol	Fisher Scientific	A452-1
Magnesium chloride	Fisher Scientific	M87-500
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-542A	18 x18 mm
N-Heptane	Fisher Scientific	H350-1
P-xylene	Fisher Scientific	O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate	Fisher Scientific	13-748B	100x85 mm
Sodium chloride	Fisher Scientific	AC32730-0025
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape	Hair Direct	RED-75R12	Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli	Invitrogen	K457501 K457540	20 reactions 40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA	Invitrogen	15632-011	Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche Applied Science	1093274	Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix	Roche Applied Science	1277073	Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution	Roche Applied Science	1681451	Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent	Roche Applied Science	11921673001	Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130)	Saati Print	330.34 UO PW	330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol	Sigma	G6279-1	70% in PBT
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
Tween 20	Sigma	P1379-500
37% Formaldehyde	Ted Pella	18508	10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids	The Paper Company	SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap	VWR International	66022-128	20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material	VWR International	500018-081	10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum			Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.