संकरण Published: June 28, 2012 doi: 10.3791/3709

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Jennifer Juhn¹, Anthony A. James^1,2

¹Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, ²Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Summary

टेम्पोरल और स्थानिक जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण कार्यात्मक जीनोमिक्स में एक महत्वपूर्ण भूमिका है. पूरे माउंट संकरण

Abstract

मच्छरों arboviruses, प्रोटोजोआ परजीवी नेमाटोड सहित रोगजनकों के एक विविध सेट के लिए वैक्टर हैं. जांच के टेप और जीन नियामकों कि ऊतकों में व्यक्त कर रहे हैं जिसमें मच्छर मेजबान और रोगज़नक़ इंटरेक्ट, और अंगों में प्रजनन में शामिल मच्छर जनित रोग संचरण को कम करने और अंडे विकास को बाधित करने के लिए रणनीतियों के लिए बहुत रुचि के हैं. उपकरणों की एक संख्या के अध्ययन करने के लिए और जीन अभिव्यक्ति की अस्थायी और ऊतक विशेष विनियमन को मान्य करने के लिए नियोजित किया गया है. यहाँ, हम प्रोटोकॉल है कि स्थानिक जानकारी है, जो जहां विशेष जीन व्यक्त कर रहे हैं और उनके उत्पादों जमा की हमारी समझ को बढ़ाता है प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है का वर्णन. वर्णित प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति मान्य है और मच्छर जनित रोगज़नक़ प्रसारण करने के लिए संबंधित जैसे ऊतकों, महिला लार की गिल्टी, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंडाशय और भ्रूण की subcellular डिब्बों में टेप के संचय पैटर्न को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जो फिर सेमच्छर प्रजनन और विकास के लिए देर हो चुकी है.

निम्न कार्यविधियों एक अनुकूलित पद्धति है कि लक्ष्य विशिष्ट संकरण संकेतों की हानि के बिना प्रोटोकॉल में विभिन्न चरणों की दक्षता में सुधार का प्रतिनिधित्व करते हैं. शाही सेना जांच तैयारी के लिए दिशा - निर्देश, मुलायम ऊतकों और निर्धारण और संकरण के लिए सामान्य प्रक्रिया के विच्छेदन के एक भाग में वर्णित हैं, जबकि विशिष्ट संग्रह, निर्धारण, पूर्व संकरण और मच्छर भ्रूण के संकरण के लिए कदम भाग बी में विस्तृत रहे हैं

Protocol

कोमल ऊतकों के लिए में स्वस्थानी संकरण: मच्छर लार ग्रंथि और अंडाशय

निम्नलिखित प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक समाधान और buffers के लिए व्यंजन विधि तालिका 1 में रेखांकित कर रहे हैं.

1. शाही सेना तैयारी और जांच गुणवत्ता विश्लेषण

1. पीसीआर के लिए डिजाइन प्राइमरों ब्याज की प्रतिलिपि लक्ष्य बढ़ाना. यह अनुशंसा की जाती है है कि amplicon ≥ लंबाई में 600 nucleotides और अधिक महत्वपूर्ण बात यह कि amplicon अनुक्रम लक्ष्य प्रतिलिपि करने के लिए अद्वितीय है. नहीं अद्वितीय दृश्यों से परहेज कर रहे हैं, पार प्रतिक्रियाशील शाही सेना जांच पैदा करने की संभावना को खत्म करने.
2. वेक्टर pCR4, Topo, या इसी तरह की क्लोनिंग वेक्टर में पीसीआर उत्पाद क्लोन. pCR4 - Topo क्लोनिंग वेक्टर T7 और T3 के शाही सेना पोलीमरेज़ भड़काना साइटों है कि दोनों और एक ही क्लोन से चलाने के बंद प्रतिलेखन उत्पादों antisense भावना के उत्पादन में सक्षम होते हैं.
3. क्लोन अनुक्रम अनुक्रम खूंटी को सत्यापित ampliconऔर वेक्टर प्लाज्मिड के भीतर elity अभिविन्यास.
4. एक विट्रो प्रतिलेखन उत्पाद में एक antisense उत्पादन के लिए उपयुक्त एंजाइम के साथ एक प्रतिबंध को पचाने प्रतिक्रिया प्रदर्शन. प्लाज्मिड linearization प्रतिबंध विशेष मैं, pst मैं के रूप में वेक्टर pCR4 - Topo के कई क्लोनिंग के क्षेत्र में स्थित साइट का चयन करके सीधा या मैं भी किया जाता है सुनिश्चित करें कि चयनित प्रतिबंध साइट क्लोन टुकड़ा में मौजूद नहीं है. एक ही क्लोन भावना किनारा शाही सेना जांच है, जो एक पृष्ठभूमि के नियंत्रण के रूप में कार्य करता है उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भावना जांच के साथ बगल में संकरण कम या कोई संकेत है, जब पूरक antisense जांच की तुलना देना चाहिए.
5. जेल वैद्युतकणसंचलन कि pCR4 - Topo क्लोन पूरी तरह से linearized है के द्वारा सत्यापित करें.
6. Linearized प्लास्मिड डीएनए निष्कर्षण फिनोल - क्लोरोफॉर्म, इथेनॉल घन द्वारा पीछा किया प्रदर्शन करके शुद्ध. जब प्लास्मिड डीएनए precipitating यह एक अंतिम concent का उपयोग करने के लिए सिफारिश की हैइथेनॉल के 2.5 संस्करणों के साथ 2 एम अमोनियम एसीटेट का राशन ले अवशिष्ट नमक के अधिक में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में कम करने के लिए.
7. Digoxigenin (डीआईजी) इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में एक रन प्रदर्शन, linearized प्लास्मिड डीएनए के एक टेम्पलेट के रूप में 1 μg का उपयोग करके एकल असहाय शाही सेना जांच लेबल तैयार करें. शाही सेना पोलीमरेज़, प्रतिलेखन बफर और डीआईजी शाही सेना लेबलिंग के रूप में निर्माता के निर्देशों के द्वारा वर्णित मिश्रण के साथ प्रतिक्रिया तैयार.
8. इन विट्रो प्रतिलेखन उत्पादों में, इथेनॉल तेज़ी से डीआईजी लेबल शुद्ध है और DEPC इलाज आसुत जल में pelleted शाही सेना resuspend.
9. गुणवत्ता को सत्यापित करने और formaldehyde के जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा शुद्ध डीआईजी लेबल शाही सेना जांच की उम्मीद की आणविक भार. aliquots तैयार शाही सेना जांच में विभाजित किया जा सकता है और -80 में संग्रहीत ° सी का उपयोग करें जब तक.

2. मच्छर लार ग्रंथि और अंडाशय के विच्छेदन

1. मच्छर लार glan काटनाडी एस एक जांच और संदंश के रूप में ऐ के लिए पहले से वर्णित का उपयोग कर. aegypti एक के लिए ^1,2. gambiae, लार ग्रंथियों के रूप में ऐ के लिए वर्णित dissected किया जा सकता है. aegypti, या वैकल्पिक रूप से के रूप में एनोफ़ेलीज़ अनुसंधान मार्गदर्शन के लिए MR4 तरीके में वर्णित ^3.
2. मच्छर संदंश का उपयोग कर के रूप में ऐ के लिए पहले से वर्णित अंडाशय काटना. aegypti संक्षेप में ^4. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए छाती समझ, जबकि संदंश की एक और जोड़ी के अंत से पहले पेट खंड अंडाशय रिलीज खींचती है.
3. Ambion RNase मुक्त 1.5 मिलीलीटर microfuge पीबीएस के 50 μl युक्त ट्यूबों में विच्छेदित लार ग्रंथियों या अंडाशय लीजिए.
4. निर्धारण जब तक बर्फ पर नमूने बनाए रखें.

3. नियतन

1. हौसले से तैयार कमरे के तापमान पर नरम ऊतक नियतन (1 टेबल) 30 मिनट से 1 घंटे के लिए सिर का इशारा के साथ समाधान में विच्छेदित ऊतकों को ठीक करें. नियतन समाधान ताजा तैयार किया जाता है oxidat को रोकने केformaldehyde के लगानेवाला की आयन. 1-1.5 घंटे के लिए निर्धारित लार की गिल्टी के लिए सिफारिश की है. 1 मिलीलीटर की एक न्यूनतम मात्रा 1.5 मिलीग्राम microfuge ट्यूब में ऊतकों को तय करने के लिए सिफारिश की है.
2. ऊतकों microfuge ट्यूब के नीचे के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. यह एक महत्वपूर्ण कदम है, जो प्रोटोकॉल में समाधान के लिए सभी परिवर्तन इस प्रकार है और महत्वपूर्ण नमूना नुकसान को कम कर देंगे है.
3. सावधान pipetting द्वारा नियतन समाधान छानना, microfuge ट्यूब में मात्रा के 50-100 μl छोड़ने और फिर 3 × 5 मिनट प्रत्येक पीबीटी साथ धो.
4. वैकल्पिक संतुलन ऊतक भंडारण के लिए कदम. Stepwise बाहर भी इथेनॉल या मेथनॉल के साथ पीबीटी कुल्ला. / पीबीटी शराब (03:01, 01:01 और 01:03, 5 मिनट प्रत्येक) के साथ कदम वार washes के प्रदर्शन. -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% (200 सबूत) में स्टोर शराब ऊतकों फैटी ऊतक की गिरावट के बिना कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. प्रोटोकॉल के बाद के चरणों का प्रदर्शन करने से पहले, ऊतकों पीबीटी stepwise संतुलन द्वारा किया जाना चाहिए के साथ शराब / पीबीटी (03:01, 01:01 लौटा,01:03, 5 मिनट प्रत्येक).
5. प्रदर्शन करना पीबीटी 3 ×, प्रत्येक 5 मिनट washes बनाने के लिए.
6. 0.01 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर / पीबीटी, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के साथ प्रोटीन के पाचन का प्रदर्शन करते हैं. वैकल्पिक रूप से, यदि प्रोटीन और शाही सेना के बगल में लक्ष्य संकरण की दोनों immunolocalization के वांछित हैं, अंडाशय सी -20 ° में 80% एसीटोन / एच ₂ हे के साथ किया जा सकता है को 10 के बजाय मिनट proteinase लालकृष्ण साथ इलाज के लिए incubated
   Proteinase कश्मीर उपचार लार की गिल्टी की तैयारी के लिए छोड़ दिया जाता है. सीधे आगे बढ़ना करने के लिए 3.10 कदम.
7. तुरंत सावधान pipetting द्वारा पाचन समाधान के छानना. धो 2 ×, बहुत ठंडा पीबीटी के साथ 5 मिनट प्रत्येक पाचन को रोकने के लिए.
8. प्रदर्शन करना अतिरिक्त पीबीटी 2 ×, कमरे के तापमान पर 5 मिनट प्रत्येक washes.
9. कमरे के तापमान पर नरम ऊतक नियतन समाधान में 30 मिनट के लिए सिर का इशारा के साथ परसर्ग. पोस्ट - निर्धारण कदम लार की गिल्टी के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं.
10. पीबीटी 5 × 5 मिनट प्रत्येक washes बनाने के लिए प्रदर्शन करते हैं.

4. संकरण

1. छानना के रूप में संभव के रूप में / Hyb पीबीटी ज्यादा. प्रत्येक नमूना ट्यूब में Hyb के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
2. सील हवा सुरक्षात्मक बुलबुला लपेटो एक संकरण बोतल के अंदर और पैकेजिंग जगह में लपेटें नमूना ट्यूब. बोतल एक संकरण बोतल टोपी के साथ में सील.
3. पूर्व संकरण और संकरण कदम एक संकरण ओवन में आसानी से प्रदर्शन कर सकते हैं. 55 ° C पर रोटेशन के साथ 30 मिनट के लिए पूर्व संकरण प्रदर्शन करते हैं.
4. पर्याप्त समय के लिए ऊतकों microfuge ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए, के रूप में Hyb पीबीटी से अधिक घने है की अनुमति दें. पूर्व संकरण ध्यान से समाधान छानना. ऊतकों पारदर्शी और कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है. नमूना नुकसान समाधान मात्रा की प्रत्येक नमूना ट्यूब में 50-100 μl छोड़ने के द्वारा कम किया जा सकता है.
5. नमूना ट्यूब में 50 Hyb की μl मात्रा में जोड़ें और 55 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक में बनाए रखने के
6. 85 ° C पर 5-10 मिनट के लिए शाही सेना जांच denature. तुरंत, बर्फ पर विकृत जांच 5 मिनट के लिए जगह है.
7. नमूना ट्यूब में शाही सेना जांच विंदुक. शाही सेना जांच Hyb की सतह के लिए जारी करेगी. ट्यूब धीरे flicking द्वारा मिश्रण.
8. नमूना प्रति Hyb की 50-100 μl की कुल मात्रा में संकरण प्रदर्शन करते हैं. एक संकरण ओवन के अंदर एक निश्चित microfuge के रैक में, या एक नहाने के पानी में एक अस्थायी microfuge ट्यूब रैक, 55 ° 16-24 घंटे के लिए सी में नमूने सेते हैं.

5. एक उपचार RNase

1. जांच युक्त Hyb निकालें. 55 ° C पर धोने के लिए गैर विशिष्ट अवशिष्ट अनबाउंड जांच के बंधन को कम करने के चरणों के दौरान नमूने बनाए रखने के लिए यह महत्वपूर्ण है. यदि कई नमूने का संकरित कर रहे हैं, यह 55 ° C पर एक गर्मी ब्लॉक सेट में नमूना ट्यूबों धोने कदम भर में संकरण तापमान बनाए रखने के रखने की सिफारिश की है.
2. समाधान की microfuge टब में 1 मिलीग्राम pipetting द्वारा Hyb साथ एक त्वरित धोने प्रदर्शनई और inverting के नमूना ट्यूब 5-6 बार.
   प्रोटोकॉल बाद में सभी त्वरित washes के इसी तरह आवश्यक समाधान और inverting नमूना ट्यूब कई बार जोड़कर किया जाता है.
3. दो 55 में Hyb के साथ अतिरिक्त washes के डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट प्रत्येक संकरण ओवन में रोटेशन के साथ प्रदर्शन करते हैं.
4. Hyb / पीबीटी (1:1) के साथ सिर का इशारा के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubating के द्वारा पीबीटी में संतुलित करना.
5. पीबीटी 5 × 5 मिनट प्रत्येक washes बनाने के लिए प्रदर्शन करते हैं.
6. ताजा RNase एक बफर तैयार. RNase 30 मिनट के लिए 20 μg / एमएल RNase एक / पीबीटी 37 डिग्री सेल्सियस, में incubating उपचार प्रदर्शन करते हैं. एक cleaves एक असहाय शाही सेना RNase और unhybridized शाही सेना जांच की गिरावट के परिणाम होगा.
7. पसाना RNase एक बफर और पीबीटी साथ एक त्वरित धोने प्रदर्शन.
8. प्रदर्शन करना पीबीटी 3 ×, प्रत्येक 5 मिनट washes बनाने के लिए.

6. एंटीबॉडी ऊष्मायन

1. ताजा अवरुद्ध समाधान तैयार (5% चिकन सीरम / 1% पश्चिमी अवरुद्ध / अभिकर्मक पीबीटी) और ब्लॉक incuba द्वारा नमूनेसिर का इशारा के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक समाधान की मिलीलीटर में ting.
2. विरोधी डीआईजी क्षारीय (एपी) फॉस्फेट संयुग्मित अवरुद्ध समाधान में एंटीबॉडी के 1:1000 कमजोर पड़ने के 200 μl जोड़ें. डिग्री सेल्सियस 4 में सेते हैं, रातोंरात सिर का इशारा के साथ.

7. Alkaline फॉस्फेट धुंधला

1. एंटीबॉडी और अवरुद्ध समाधान निकालें.
2. पीबीटी साथ एक त्वरित धोने का प्रदर्शन करते हैं.
3. प्रदर्शन करना अतिरिक्त पीबीटी 5 ×, 10 मिनट प्रत्येक washes. वैकल्पिक रूप से नमूने धोया जा 3x, 10 मिनट प्रत्येक 4 में एक विस्तारित धोने ° सी, सिर का इशारा के साथ रात भर सकते हैं.
4. ताजा एपी धुंधला बफर तैयार.
5. एपी धुंधला बफर के साथ जल्दी धोने का प्रदर्शन करते हैं.
6. एपी धुंधला 3 बफर के साथ अतिरिक्त washes × 5 मिनट प्रत्येक सिर का इशारा के साथ प्रदर्शन करते हैं.
7. निर्माता निर्देश, ताजा एपी धुंधला एपी सब्सट्रेट एनबीटी / BCIP के समाधान के अनुसार, तैयार.
8. कमरे temperatur में 500 μl एपी धुंधला समाधान के साथ प्रत्येक नमूना सेते हैंई अंधेरे में विदोलन, के साथ. नमूने को एक अपारदर्शी कंटेनर या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर ट्यूब incubated किया जा सकता है. प्रतिक्रिया प्रगति एक बैंगनी वेग के गठन के लिए हर 1-2 मिनट निगरानी की जानी चाहिए. जांच एकाग्रता, लक्ष्य शाही सेना की एकाग्रता और गैर विशिष्ट लक्ष्य की उपस्थिति पर निर्भर करता है, धुंधला हो जाना कई घंटे तक कई मिनट के लिए आगे बढ़ सकते हैं.
9. के रूप में संभव के रूप में धुंधला समाधान की बहुत निकालें. बाद में धोने कदम दौरान सफेद गुम्फेदार वेग के गठन में असंतोषजनक निस्तारण परिणाम है.
10. धुंधला पीबीटी साथ दो त्वरित washes के प्रदर्शन से पूरी तरह से बंद कर दिया है.
11. प्रदर्शन करना अतिरिक्त पीबीटी 3 ×, प्रत्येक 5 मिनट washes.

8. ग्लिसरॉल बढ़ते

1. Microfuge ट्यूब से एक Pyrex स्थान प्लेट की अलग - अलग दौर नीचे कुओं में एक बड़े बोर 200 μl पिपेट टिप, स्थानांतरण के नमूने का उपयोग करना.
2. ध्यान से नमूना से हटाने के रूप में पीबीटी का जितना संभव.
3. नमूना 70% ग्लिसरॉल / ₂ एच ओ के शीर्ष पर विंदुक ग्लिसरॉल की अनुमति दें करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना ऊतक तर करने के लिए, रात भर. स्लाइड बढ़ते ग्लिसरॉल उपचार के दौरान ऊतकों के शुष्क्ीकरण रोकता है.
4. पोंछते स्लाइड सतह Kimwipes साथ साफ कर खुर्दबीन स्लाइड तैयार करते हैं. स्लाइड पर अदृश्य टेप समानांतर के दो टुकड़े एक दूसरे से इतना है कि वे एक संकीर्ण चैनल (चित्रा 2) के रूप में लागू करें.
5. एक कलात्मक ब्रश का उपयोग, एक से एक नमूने लेने और उन्हें चैनल की लंबाई के साथ जगह है, एक ही उन्मुखीकरण के साथ / पूर्वकाल पीछे और पृष्ठीय / उदर संरेखण के लिए सम्मान के साथ प्रत्येक नमूना स्थिति.
6. प्रत्येक नमूना स्थिति के बाद, एक Kimwipe झाड़ू का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त ग्लिसरॉल समाधान के आसपास के ऊतकों (चित्रा 3) को अवशोषित. अतिरिक्त ग्लिसरॉल का हटाया जाना बुलबुले के गठन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, जब एक कवर पर्ची के तहत स्लाइड पर घुड़सवार नमूने सील.
7. केंद्र और जगह ध्यान से एसीगठबंधन नमूने युक्त चैनल पर पर्ची पर. प्रत्यय कवर स्लाइड पर semipermanently पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची के कोनों dabbing द्वारा पर्ची.
8. एक 200 μl pipettor के का उपयोग, पर्याप्त 70% करने के लिए केशिका कार्रवाई से क्षेत्र और कवर पर्ची के तहत चैनल के पूरे जगह को भरने के ग्लिसरॉल चैनल के एक छोर में धीरे से बांटना.
9. स्थायी रूप से कवर पर्ची के सभी चार पक्षों के साथ नेल पॉलिश लागू करने के द्वारा घुड़सवार नमूने सील. संकरित पूरे माउंट ऊतकों की तस्वीरें पहले पर्याप्त सूखी पॉलिश नाखून की अनुमति दें. यह करने के लिए बढ़ते के बाद तुरंत तस्वीर नमूनों की छवियों के लिए सिफारिश की है.

बी संकरण बगल में मच्छर भ्रूण के लिए

समाधान और buffers मच्छर भ्रूण के लिए में स्वस्थानी संकरण के लिए आवश्यक है (तालिका 1) में वर्णित हैं. निर्धारण और संकरण यहाँ प्रस्तुत प्रक्रियाओं thos से संशोधित किया गया हैई पहले एनोफ़ेलीज़ gambiae, ^5,6 एडीज ⁷ aegypti और क्युलेक्स quinquefasciatus के लिए सूचना दी ^8.

1. भ्रूण संग्रह

1. भ्रूण 300 mated करने, महिला वयस्क (48 ज के लिए पुरुषों, 3 दिन बाद उभरने के साथ संभोग करने की अनुमति) रक्त खिला बाद 72 घंटा मच्छरों से एकत्र कर रहे हैं. मच्छरों 3 एम sucrose के समाधान पर रखा जाता है, क्रम में लिए oviposition इरादा संग्रह अवधि से पहले रोकने के.
2. एक 16 ऑउंस अस्तर द्वारा भ्रूण संग्रह कंटेनर तैयार है. Saatilene हाईटेक जाल के साथ पेपर कप ताकि कप के अंदर सतह पूरी तरह से कवर किया जाता है. जाल एक एकल प्रधान का उपयोग करके चिपका जा सकता है. इस जाल का प्रयोग बहुत रेशेदार contaminants कि वर्तमान अगर वाटमान फिल्टर पेपर, या कागज तौलिए का इस्तेमाल कर रहे हैं कम कर देता है.
3. कंटेनर डिस्टिल्ड पानी के साथ आधा भरा भरें.
4. भ्रूण पिंजरे में संग्रह कंटेनर, जो बाद में कवर किया जाता है रखकर 1 घंटे के लिए एकत्र कर रहे हैंएक काले कपड़े से oviposition को प्रोत्साहित करने के लिए.
5. एकत्र भ्रूण मानक के पालन की स्थिति (85% सापेक्ष आर्द्रता / 26 डिग्री सेल्सियस) में पिंजरे के बाहर वांछित विकास के चरणों को परिपक्व करने के लिए अनुमति दी जाती है. भ्रूण के विभिन्न चरणों के लिए परिपक्वता भ्रूण वर्णित (तालिका 2) की घटनाओं की अनुमानित विकास समय पाठ्यक्रम के बाद समय (घंटे बाद oviposition) सहसंबद्ध किया जा सकता है. इस तालिका में एडीज aegypti, Cupp Raminani और द्वारा रिपोर्ट के लिए भ्रूण के विकास में प्रमुख घटनाओं का सार है, ^9,10 एनोफ़ेलीज़ gambiae ¹¹ इवानोवा - Kazas द्वारा पहले वर्णित और आगे Goltsev और उनके सहयोगियों, ^12,13 और क्युलेक्स डेविस द्वारा की सूचना दी quinquefasciatus द्वारा सविस्तार ^14. समय वर्णित पाठ्यक्रम भ्रूण के संग्रह के लिए पूर्ण समय, विशेष चरणों में विकास के अंक के बजाय प्रारंभिक अनुमान है, के रूप में सेवा करने का इरादा कर रहे हैं.

2. Dechorionation, निर्धारण, और Endochoriविघटन पर

1. संग्रह कंटेनर से एक Saatilene जाल dechorionation पकड़ ट्यूब (चित्रा 3) में भ्रूण स्थानांतरण.
   एडीज भ्रूण के लिए एक बीकर कि काफी आसुत जल से भरा है ताकि पकड़ ट्यूब की मात्रा एक आधा भरा हुआ है में पकड़ ट्यूब जगह है. एक कलात्मक ब्रश Saatilene जाल से भ्रूण जगह देना और उन्हें पानी भर पकड़ ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
   एनोफ़ेलीज़ भ्रूण के लिए संग्रह कंटेनर से Saatilene जाल अलग और ध्यान से जाल गुना करने के लिए एक चिमनी के रूप में. एक हाथ से होल्डिंग जाल कीप, दूसरे हाथ का उपयोग करने के लिए एक पॉलीथीन धार बोतल के माध्यम से कीप के पक्ष के साथ आसुत जल पकड़ ट्यूब में भ्रूण धोने बांटना. यह विधि एनोफ़ेलीज़ भ्रूण के लिए लागू किया जा सकता है क्योंकि वे एडीज भ्रूण की सतह है, जो अंडे oviposition substrates के लिए छड़ी पर मौजूद चिपकने वाला पदार्थ की कमी है.
2. पीआरepare dechorionation समाधान के 40 मिलीलीटर (1 मात्रा 5.25% सोडियम hypochlorite: आसुत पानी की 3 मात्रा). एक 100 मिमी पेट्री डिश में समाधान डालो.
3. एक 100 मिलीलीटर आसुत पानी की 50 मिलीलीटर वाले बीकर तैयार है और अलग निर्धारित करें. dechorionation कदम समय के प्रति संवेदनशील और तुरंत निम्नलिखित सोडियम hypochlorite उपचार भ्रूण इस पानी में डूब जाएगा, dechorionation समाधान पतला है.
4. पेट्री डिश dechorionation समाधान के साथ भर में ट्यूब डाल द्वारा जाल ट्यूब पकड़ने के भ्रूण Dechorionate. एक डिस्पोजेबल पॉलीथीन हस्तांतरण विंदुक या पाश्चर विंदुक उपयोग करने के लिए भ्रूण धोने, जबकि पकड़ शीशी घूमता इतना है कि भ्रूण जलमग्न रहते हैं और dechorionation समाधान में उत्तेजित.
   35 सेकंड के एक अधिकतम के एडीज भ्रूण के dechorionation के लिए आवश्यक है, जबकि 75 सेकंड लिए एनोफ़ेलीज़ और क्युलेक्स भ्रूण (तालिका 3) पर्याप्त है. Dechorionation prot की सबसे संवेदनशील कदम की हैocol और सोडियम hypochlorite उपचार के विस्तार, विशेष रूप से एडीज भ्रूण के लिए जरायु का उचित खुर को रोकने जाएगा.
5. तुरंत डूब पानी युक्त बीकर में पकड़ शीशी.
6. पानी से भरे बीकर से पकड़ ट्यूब को हटाने और एक धारा निकलना बोतल या टयूबिंग के साथ लगे नल से आसुत पानी के साथ पकड़ ट्यूब के भीतरी और बाहरी दीवारों rinsing के द्वारा शेष dechorionation समाधान धो भ्रूण से.
7. Dechorionation कम बढ़ाई विदारक माइक्रोस्कोप के साथ भ्रूण visualizing द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. Dechorionated एडीज भ्रूण जाल की तरह exochorion कमी और केवल चिकनी, काला endochorion की पॉलिश सतह स्पष्ट है dechorionated एनोफ़ेलीज़ भ्रूण के लिए, exochorionic मंगाई और रिज संरचनाओं अनुपस्थित रहे हैं (चित्रा 4).
8. एक कलात्मक ब्रश का उपयोग, एक जगमगाहट आसुत पानी की 5 मिलीलीटर वाली शीशी में dechorionated भ्रूण स्थानांतरणआतंकवाद (चित्र 5-1). यदि कई नमूने तैयार किए जा रहे हैं, पानी में ट्यूब पकड़ बनाए रखने के लिए भ्रूण की शुष्क्ीकरण को रोकने के लिए.
9. भ्रूण जगमगाहट शीशी के आधार पर बसा है और संभव के रूप में शीशी से ज्यादा पानी के रूप में दूर है.
10. , हेपटैन की जगमगाहट शीशी (5-2 चित्रा) में 5 मिलीलीटर जोड़ें. किसी भी अवशिष्ट पानी कि जगमगाहट शीशी में रहता निकालें.
11. हौसले से तैयार भ्रूण निर्धारण समाधान की जगमगाहट शीशी 5 मिलीलीटर (1 टेबल) में जोड़ें.
12. उलटा के साथ 30 मिनट के लिए भ्रूण इतना ठीक है कि जैविक और जलीय चरणों मिश्रण अच्छी तरह से, लेकिन नहीं सख्ती.
13. निर्धारण एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर समाधान निकालने के लिए, सावधान किया जा रहा करने के लिए अंतराप्रावस्था है, जो (चित्रा 5-3) भ्रूण परेशान नहीं.
14. बंद के रूप में ज्यादा आसुत पानी के साथ संभव के रूप में जगमगाहट शीशी भरने के द्वारा अवशिष्ट निर्धारण समाधान धो लें. शीशी 5 बार और पलटनातो आसुत जल की सभी को हटा दें.
15. और 30 मिनट के लिए inverting शीशी द्वारा आसुत पानी के मिश्रण के 20 मिलीग्राम के साथ जगमगाहट शीशी भरें.
16. जगमगाहट शीशी से पानी के सभी निकालें.
17. पर्याप्त जगमगाहट शीशी में उबलते आसुत जल जोड़ें इतना है कि अकार्बनिक हेपटैन चरण शीशी के शीर्ष तक पहुँच जाता है.
18. 30 सेकंड के लिए सेते हैं और फिर उबलते पानी के सभी हटा.
19. बर्फ ठंड आसुत पानी जोड़ें अकार्बनिक चरण तक शीशी के शीर्ष तक पहुँचता है. 10 मिनट के लिए बर्फ में शीशी सेते हैं.
20. पहले जलीय और फिर कार्बनिक चरणों निकालें. हेपटैन इस कदम (5-4 चित्रा) में अपारदर्शी दिखाई देगा.
21. शीशी में नई हेपटैन के 5 मिलीलीटर जोड़ें. शीशी से सभी शेष पानी निकालें.
22. शीशी में मेथनॉल के 5 मिलीलीटर जोड़ें. शीशी 1-2 बार में energetically भंवर मिलाते हुए बिना (चित्रा 6). यदि हेपटैन अकार्बनिक और कार्बनिक मेथनॉल चरणों हिल सख्ती वाई भ्रूणendochorion टूटना के दौरान नष्ट हो जाएगा. यह उल्लेखनीय है उल्लेख है कि हम एडीज aegypti भ्रूण के विभिन्न प्रकारों के लिए endochorion विघटन की क्षमता में भिन्नता मनाया.
23. कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए सेते हैं. इस चरण के दौरान, चरणों जर्दी घटकों (5-5 चित्रा) की रिहाई की वजह से परेशान हो जाएगा.
24. दोनों कार्बनिक और अकार्बनिक चरणों निकालें और मेथनॉल के साथ 3 बार धोने के लिए सभी अवशिष्ट हेपटैन निकालें.
25. भ्रूण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल में संग्रहीत किया जा सकता है कई महीनों के लिए.

3. छाल

1. एक 3 सेमी पेट्री डिश के केंद्र में दो तरफा टौपी टेप का एक टुकड़ा रखें. टौपी टेप क्योंकि चिपकने वाला मेथनॉल और इथेनॉल की उपस्थिति में स्थिर है प्रयोग किया जाता है.
2. मेथनॉल से डबल पक्षीय टेप पर एक बड़े (लगभग 3 मिमी व्यास) 200 μl विंदुक टिप बोर, हस्तांतरण भ्रूण का उपयोग करना.
3. भ्रूण के लिए 1-2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने और adh की अनुमति देंटेप सतह अरे.
4. पसाना अतिरिक्त मेथनॉल और सतह से थोड़ा 1-2 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
5. पेट्री डिश में 95% (190 सबूत) के 4 मिलीग्राम इथेनॉल जोड़ें.
6. विंदुक और इथेनॉल मिश्रण ज़ुल्फ़ में 600 आसुत पानी की μl. टेप रंग में अपारदर्शी हो जाएगा. आसुत जल के अलावा टेप चिपचिपा बनने के लिए और छीलने के दौरान भ्रूण को स्थिर करने के लिए कारण होगा. यह कदम अगर वांछित छोड़े गए किया जा सकता है.
7. 27.5 गेज 1 मिलीलीटर सिरिंज प्रति बैरल से टूट endochorion (चित्रा 7) बंद छील करने के लिए संलग्न सुई का प्रयोग करें. सफेद भ्रूण काले endochorion अवशेष से जारी करने के बाद, पेट्री डिश के इथेनॉल जलाशय के ठीक एक टिप कलात्मक ब्रश का उपयोग करने के लिए टेप से भ्रूण हस्तांतरण. 3 मिमी बोर विंदुक टिप का उपयोग करना, एक Ambion 1.5 मिलीलीटर microfuge 500 200 प्रमाण इथेनॉल μl युक्त ट्यूब में भ्रूण हस्तांतरण.
   खुली भ्रूण टेप पर समय की एक विस्तारित अवधि के लिए नहीं रहना चाहिए क्योंकि वे प्रति पालन कर सकते हैंmanently टेप करने के लिए.
8. 100% के साथ 2-3 त्वरित washes (200 सबूत) इथेनॉल प्रदर्शन और ज़रूरत से ज़्यादा परिशुद्ध इथेनॉल में -20 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण की दुकान खुली भ्रूण कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर आकारिकी या बाद में संकरण संकेत को प्रभावित किए बिना संग्रहित किया जा सकता है.

4. की जर्दी का स्पष्टीकरण

1. 200 प्रमाण इथेनॉल के साथ एक त्वरित धोने का प्रदर्शन करते हैं. ज़रूरत से ज़्यादा परिशुद्ध इथेनॉल बाद के सभी धोने कदम के लिए और पी xylene जर्दी स्पष्टीकरण समाधान की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
2. एक इथेनॉल धोने, सिर का इशारा के साथ 5 मिनट प्रदर्शन करते हैं.
3. सिर का इशारा के साथ 1-1.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर P-xylene/ethanol (9:01) में सेते हैं. xylene कदम जर्दी जन के स्पष्टीकरण के लिए शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ाने देता है.
4. Xylene इथेनॉल समाधान निकालें और इथेनॉल के साथ दो जल्दी washes के प्रदर्शन.
5. एक इथेनॉल धोने, सिर का इशारा के साथ 5 मिनट प्रदर्शन करते हैं.
6. मेथनॉल के साथ दो जल्दी washes के बाद, एक मेथनॉल धोने के द्वारा, के साथ 5 मिनट प्रदर्शनसिर का इशारा.
7. मेथनॉल / formaldehyde के निर्धारण समाधान (1:1) के साथ एक बार धोने से 4% formaldehyde के निर्धारण समाधान में संतुलित करना.

5. और बगल में फिक्सेशन संकरण

निर्धारण और स्वस्थानी प्रक्रियाओं में संकरण प्रोटोकॉल धारा ए में वर्णित उन लोगों के लिए समान हैं

प्रतिनिधि सी. परिणाम

सीटू प्रोटोकॉल में संकरण यहाँ वर्णित है, रंग धुंधला हो जाना पैटर्न में परिणाम कि लक्षित mRNA की उपस्थिति और स्थानीयकरण से संकेत मिलता है. यह महत्वपूर्ण है पर जोर देना है कि प्रतिलिपि बहुतायत के रिश्तेदार स्तर में स्वस्थानी संकरण द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है. संकरण परिणाम विशिष्ट mRNA जांच संकरण प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता, संकरित ऊतक में लक्ष्य mRNA के, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जांच एकाग्रता और संकरण तापमान की बहुतायत पर निर्भर हैं. ऊतकों की तुलना antisense साथ संकरित और इसी भावना mRNA के जांच संभव धुंधला पैटर्न की सही व्याख्या करते हैं.

MRNA के जांच के साथ महिला aegypti एडीज है कि लक्ष्य (AAEL006719) amylase1, D7s2 (AAEL006423), और (AAEL006424) D7L2 समीपस्थ पार्श्व, बाहर का पार्श्व में इन टेप के संचय का संकेत है की पूरे माउंट लार ग्रंथियों के बगल में संकरण, और बाहर पार्श्व / औसत दर्जे का lobes, क्रमशः (8 चित्रा) ¹ तीन मच्छर प्रजातियों के पूरे माउंट अंडाशय. mRNA के जांच है कि विशेष रूप से Oskar के संबंधित orthologous टेप (9 चित्रा) लक्ष्य के साथ संकरित गया. पूरे आरोह भ्रूण की बगल में ^7,8 संकरण ऐ की. aegypti, एक. gambiae और Cx. quinquefasciatus antisense शाही सेना जांच संबंधित मच्छर Oskar orthologous टेप (10 चित्रा) लक्ष्यीकरण का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया था ^7,8.

1 igure "" = "files/ftp_upload/3709/3709fig1.jpg /" />
आकृति 1. बाद संकरण के योजनाबद्ध आरेख सेट अप बढ़ते.

चित्रा 2. Kimwipe एमओपी की तैयारी नमूना दौरान इस्तेमाल किया बढ़ते Kimwipe ऊतक कस मुड़ जाता है के लिए एक ठीक इत्तला दे दी एमओपी उत्पादन अतिरिक्त नमूने और स्लाइड से बढ़ते मध्यम अवशोषित.

चित्रा 3. Saatilene जाल dechorionation पकड़ ट्यूब के योजनाबद्ध.) एक 50 मिलीलीटर polystyrene चोटीदार ट्यूब के नीचे काट रहा है एक खोखले ट्यूब लंबाई में 4.5 सेमी, दोनों सिरों पर खुला उपज. एक परिपत्र खोलने चोटीदार ट्यूब के लिए तरल की अनुमति के लिए एक 6.5 सेमी ² Saatilene जाल का चौकोर टुकड़ा के माध्यम से धोया जा ढक्कन के बाहर कट जाता है. इंच प्रति 330 धागे, 34 माइक्रोन व्यास धागा जाल स्क्रीन मच्छर भ्रूण बरकरार रखती है. बी) गधाट्यूब पकड़ने के embled.

चित्रा 4. एडीज aegypti और एनोफ़ेलीज़ gambiae अंडे, पहले और बाद में dechorionation.) एडीज aegypti अंडे पहले dechorionation के करने के लिए. जाल की तरह exochorion काले endochorion ऊपर स्थित है और अंडे एक textured उपस्थिति (इनसेट वृद्धि) देता है. हटाने बाद exochorion की, केवल चिकनी और पॉलिश endochorion के रहता है (बी और इनसेट इज़ाफ़ा). सी) अंडे एनोफ़ेलीज़ gambiae dechorionation के लिए पहले. ऐसे तैरता रूप में exochorion संरचनाओं दिखाई दे रहे हैं (तीर). डी) endochorion की चिकनी और पॉलिश सतह dechorionation के बाद दिखाई देता है. बार = 100 माइक्रोन.

चित्रा 5. निर्धारण और ऐ की endochorion विघटन के लिए अनुक्रमिक चरणों की एक श्रृंखला है. aegypti अंडे) slanted ललाट दृश्यऔर बी) जगमगाहट ऐ युक्त शीशियों के पार्श्व दृश्य. aegypti निर्धारण और endochorion अवरोध के अनुक्रमिक चरणों के दौरान अंडे. 1) आसुत जल में भ्रूण. 2) भ्रूण ऊपरी हेपटैन चरण और कम जलीय चरण के बीच अंतराप्रावस्था में तैरने लगते हैं. 3) के बाद निर्धारण भ्रूण एक दौर मास में एक साथ पैक. भ्रूण हेपटैन और लगानेवाला समाधान चरणों के बीच अंतराप्रावस्था में रहते हैं. 4) उबलते पानी और बर्फ में ऊष्मायन के साथ उपचार के बाद, हेपटैन चरण थोड़ा अपारदर्शी हो जाता है. 5) बाधित endochorions साथ भ्रूण एक अपारदर्शी हेपटैन चरण है और पारदर्शी मेथनॉल चरण के बीच अंतराप्रावस्था में दिखाया जाता है.

6 चित्रा. निश्चित ऐ endochorion विघटन. aegypti अंडे. के तुरंत बाद) एक ऊर्जावान हेपटैन और मेथनॉल चरणों घूमता, बुलबुले के गठन और endochorion के विघटन देखे जा सकते हैं. बी) followiएनजी ऊष्मायन के पांच कमरे के तापमान पर, पहले.

7 चित्रा. व्यवधान और endochorion के हटाने के बाद मच्छर अंडे ऐ के अंडे. (ए) aegypti, एक. (बी) gambiae और Cx. quinquefasciatus (सी) निम्नलिखित निर्धारण और endochorion के विघटन. सफेद, पारदर्शी के भ्रूण फटा endochorion के भीतर देखा जा सकता है. बाद endochorion को हटाने के, ऐ के पारदर्शी भ्रूण. (डी) aegypti, एक. (ई) gambiae और Cx. quinquefasciatus (एफ) स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. बार = 100 माइक्रोन.

संख्या 8. तीन पूरे माउंट, महिला ऐ अलग lobes में व्यक्त जीनों के लिए बगल में hybridizations. aegypti लार की गिल्टी. यह धुंधला स्थानीयकरण और amylase1 के संचय (AAE का संकेत है L006719) (ए), D7s2 (AAEL006423) (बी) और D7L2. (AAEL006424) (बी). बार = 100 माइक्रोन.

9 चित्रा. मच्छर Oskar antisense पूरे माउंट मच्छर oocytes और नर्स कोशिकाओं के लिए शाही सेना जांच के लिए में स्वस्थानी संकरण. स्टेज चतुर्थ oocytes (OOC) एक के अंडाशय से dissected किया. gambiae (ए), ऐ. (बी) aegypti और Cx. quinquefasciatus (सी) और शाही सेना जांच संबंधित मच्छर Oskar mRNAs लक्ष्यीकरण के साथ संकरित. प्राथमिक रोम बाईं तरफ के पूर्वकाल से उन्मुख होते हैं. पीछे ध्रुव (नीला नोक) पर धुंधला हो जाना Oskar mRNAs संचित संकेत. (F2) माध्यमिक और तृतीयक रोम (F3) दिखाया गया है और धुंधला (काला नोक) नर्स cytoplasm कोशिका (एनसीसी) में Oskar mRNA का संचय से संकेत मिलता है. धुंधला नर्स सेल नाभिक (ncn) से बाहर रखा गया है. बार = 50 माइक्रोन.

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10 चित्रा. मच्छर Oskar antisense पूरे माउंट मच्छर भ्रूण करने के लिए शाही सेना जांच के लिए बगल में संकरण. भ्रूण बाईं तरफ के पूर्वकाल के साथ उन्मुख हैं. एक के सेलुलर निषिक्त चरण के भ्रूण. (ए) gambiae और Cx. quinquefasciatus (सी) संबंधित मच्छर प्रजातियों विशिष्ट Oskar शाही सेना जांच के साथ संकरित हैं. बी) syncytial निषिक्त चरण ऐ. aegypti भ्रूण जांच आरएनए ऐ लक्ष्यीकरण के साथ संकरित. aegypti Oskar प्रतिलेख. धुंधला सभी भ्रूण के पीछे ध्रुव कोशिकाओं में स्पष्ट है, और इन कोशिकाओं में मच्छर Oskar mRNA का स्थानीयकरण संचय का संकेत है. बार = 50 माइक्रोन.

तालिका 1 formaldehyde जेल वैद्युतकणसंचलन, और बगल में नियतन संकरण के लिए समाधान और बफ़र्स.

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तालिका 2 विकासात्मक घटनाओं और रूपात्मक टिप्पणियों मच्छर embryogenesis दौरान लगातार चरणों के लिए इसी.

तालिका 3 विभिन्न प्रकार के ऊतकों के लिए पूर्व संकरण कदम में मुख्य अंतर का सारांश.

Discussion

सीटू और वर्णमिति धुंधला प्रोटोकॉल में संकरण पूरे माउंट मच्छर ऊतकों और भ्रूण के लिए यहाँ प्रस्तुत विशिष्ट अंगों और सेल प्रकार के भीतर टेप के स्थानीयकरण के लिए एक उपयोगी तकनीक है. इन प्रक्रियाओं हमारे पहले की रिपोर्ट के तरीकों पर दोनों व्यापक धोने कदम को व्यवस्थित बनाने और अतिरिक्त तकनीकी जानकारी और अभिकर्मक के सूत्रों उपलब्ध कराने में सुधार कर रहे हैं.

हमारे अनुभव में, संकरण संकेतों का पता लगाने वर्णमिति प्रतिदीप्ति आधारित पता लगाने योजनाओं की तुलना में संवेदनशीलता और संकरण संकेत की स्पष्टता में बेहतर है. इसके अलावा वर्णमिति पता लगाने के भ्रूण, जो स्वाभाविक ऑटो फ्लोरोसेंट में संकेत भेदभाव के साथ जुड़े मुद्दों circumvents. संकरण संकेतों का पता लगाने में सीमाएँ होती है, जब कम बहुतायत टेप को लक्षित कर रहे हैं और पृष्ठभूमि धुंधला स्पष्ट है. 65 से संकरण तापमान बढ़ाने डिग्री सेल्सियस वापस कम पाया गया हैजमीन संकरण का संकेत है, लेकिन अद्वितीय विशिष्ट लक्ष्य शाही सेना जांच के डिजाइन के लिए एक विकल्प नहीं है.

इस प्रोटोकॉल एडीज aegypti के पूरे माउंट लार की गिल्टी, और अंडाशय और एनोफ़ेलीज़ gambiae, एनोफ़ेलीज़ stephensi, ऐ के भ्रूण के बगल में संकरण प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. aegypti और क्युलेक्स quinquefasciatus. यह विधि भी अन्य मच्छर के ऊतकों को लागू है, और अन्य कीड़ों के उन संभाव्यतः है. इसके अतिरिक्त, हम तीन वेक्टर मच्छरों, ऐ में भ्रूण के विकास के मंचन के लिए पहली बार तुलनात्मक दिशा निर्देशों के लिए संकलित. aegypti, एक. gambiae और Cx. fatigans. टिप्पणियों विचारशील पालन शर्तों के तहत इन तीन प्रजातियों के विशिष्ट उपभेदों, के लिए सूचित किया गया है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि विकास समय पाठ्यक्रम मच्छर प्रजातियों के विभिन्न प्रकारों के लिए और विभिन्न पालन शर्तों के तहत भिन्न हो सकते हैं. एना के लिए स्वस्थानी पूरक में hybridizations प्रयासों पर जा रहा हैमच्छरों और अन्य आर्थ्रोपोडा transcriptomes lyze, और इन जीवों में जीन अभिव्यक्ति के नियमन का एक बेहतर तस्वीर उपलब्ध करा सकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Ambion	AM9261
1M Tris-HCl	Ambion	AM9855G	pH8.0
10X PBS	Ambion	AM9625
20X SSC	Ambion	AM9763
1.5 ml microfuge tubes	Ambion	AM12400	Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Storage at 4 °C
DEPC water	Ambion	AM9932
Proteinase K	Ambion	AM2546
5.25% Sodium hypochlorite	Austin’s		A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus	Ambion	AM2733	Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase	Ambion	AM2082	Storage at -20 °C
95% Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-500
HPLC-grade methanol	Fisher Scientific	A452-1
Magnesium chloride	Fisher Scientific	M87-500
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-542A	18 x18 mm
N-Heptane	Fisher Scientific	H350-1
P-xylene	Fisher Scientific	O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate	Fisher Scientific	13-748B	100x85 mm
Sodium chloride	Fisher Scientific	AC32730-0025
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape	Hair Direct	RED-75R12	Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli	Invitrogen	K457501 K457540	20 reactions 40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA	Invitrogen	15632-011	Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche Applied Science	1093274	Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix	Roche Applied Science	1277073	Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution	Roche Applied Science	1681451	Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent	Roche Applied Science	11921673001	Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130)	Saati Print	330.34 UO PW	330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol	Sigma	G6279-1	70% in PBT
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
Tween 20	Sigma	P1379-500
37% Formaldehyde	Ted Pella	18508	10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids	The Paper Company	SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap	VWR International	66022-128	20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material	VWR International	500018-081	10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum			Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.