Hybridisatie Published: June 28, 2012 doi: 10.3791/3709

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jennifer Juhn¹, Anthony A. James^1,2

¹Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, ²Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Summary

Temporele en ruimtelijke genexpressie analyses moeten een cruciale rol in de functionele genomica. Whole-mount hybridisatie

Abstract

Muggen zijn vectoren voor een gevarieerde set van pathogenen, waaronder arboviruses, protozoaire parasieten en nematoden. Onderzoek van de transcripten en gen toezichthouders die zijn uitgedrukt in weefsels waarin de mug gastheer en pathogeen interactie krijgen en in organen die betrokken zijn bij de voortplanting van groot belang zijn voor strategieën om muggen overgedragen overdracht van de ziekte te verminderen en te verstoren ei-ontwikkeling. Een aantal hulpmiddelen zijn gebruikt om te bestuderen en valideren van de tijdelijke en weefsel-specifieke regulatie van genexpressie. Hier wordt beschreven protocollen die zijn ontwikkeld om ruimtelijke informatie, die inzicht waar specifieke genen tot expressie en producten verbetert accumuleren verkrijgen. De beschreven protocol is gebruikt om uitdrukking te valideren en te bepalen accumulatie patronen van transcripten in weefsels die verband houden met muggen overgedragen pathogeen transmissie, zoals vrouwelijke speekselklieren, en subcellulaire compartimenten van de eierstokken en embryo's, waarin islaat om muggen voortplanting en ontwikkeling.

De volgende procedures een geoptimaliseerde methode die de efficiëntie van verschillende stappen in het protocol verbetert zonder verlies van doelwitspecifieke hybridisatie signalen. Richtlijnen voor het RNA-probe voorbereiding, zijn ontleding van zachte weefsels en de algemene procedure voor fixatie en hybridisatie beschreven in deel A, terwijl de stappen die specifiek zijn voor het verzamelen, fixatie, pre-hybridisatie en hybridisatie van muggen embryo's worden gedetailleerd beschreven in deel B

Protocol

A. in situ hybridisatie voor de zachte weefsels: Mosquito speekselklieren en Eierstokken

Recepten voor oplossingen en buffers vereist voor de volgende procedures worden aangegeven in tabel 1.

1. RNA-Probe Voorbereiding en Kwaliteit Analyse

1. Ontwerp primers voor PCR versterken de transcriptie doelwit van belang. Het verdient aanbeveling het amplicon is ≥ 600 nucleotiden lang en nog belangrijker dat het amplicon sequentie uniek het doel transcript. Sequenties die niet-unieke vermeden om te genereren kruisreactieve RNA probes elimineren.
2. Kloon het PCR product in de pCR4-TOPO vector of dergelijke kloneringsvector. De pCR4-TOPO kloneringsvector bevat T7 en T3 RNA polymerase priming sites die de productie van zowel sense en antisense run-off transcriptie producten van een enkele kloon mogelijk te maken.
3. Sequence de gekloonde amplicon om de sequentie van FID te controlerenelity en oriëntatie binnen de vector plasmide.
4. Voer een restrictiedigest reactie met een geschikt enzym een antisense in vitro transcriptie product. Plasmide linearisatie is eenvoudig door het selecteren van een restrictieplaats in het meervoudige kloneergebied de pCR4-TOPO vector zoals Spe I, Pst I of niet I. Ervoor dat de geselecteerde restrictieplaats niet aanwezig is in het gekloneerde fragment. Hetzelfde kloon kan worden gebruikt om een ​​sense-RNA probe, die dient als een achtergrondcontrole genereren. Hybridisatie in situ met een gevoel probe moeten geven weinig of geen signaal vergeleken met die van de complementaire antisense probe.
5. Controleer door gelelektroforese de pCR4-TOPO kloon volledig gelineariseerd.
6. Zuiver het gelineariseerde plasmide DNA door het uitvoeren van een fenol-chloroform extractie gevolgd door ethanol precipitatie. Bij het neerslaan van de plasmide DNA is het aanbevolen om een ​​laatste concent te gebruikenverhouding van 2 M ammoniumacetaat met 2,5 volumes ethanol aan de overdracht van de resterende zout in de in vitro transcriptie reactie verminderen.
7. Stel de digoxigenine (DIG)-gemerkte enkelstrengs RNA probe van het uitvoeren van een uitloop in vitro transcriptie reactie met 1 pg van het gelineariseerde plasmide DNA als template. Bereid de reactie met RNA-polymerase, transcriptie buffer en DIG RNA etikettering mix zoals beschreven door instructies van de fabrikant.
8. Zuiver het DIG-gemerkte, in vitro transcriptie producten door ethanol precipitatie en resuspendeer de gepelleteerd RNA in DEPC behandeld gedestilleerd water.
9. Controleer de kwaliteit en de verwachte molecuulgewicht van het gezuiverde DIG-gelabelde RNA probe van formaldehyde gelelektroforese. De bereide RNA probe kan worden onderverdeeld in porties en bewaard bij -80 ° C tot gebruik.

2. Dissectie van Mosquito speekselklieren en Eierstokken

1. Ontleden mug speeksel Glands met een probe en tang als eerder beschreven voor Ae. aegypti. ^1,2 voor een. gambiae, speekselklieren kan worden ontleed zoals beschreven voor Ae. aegypti, of anders in de MR4 Methoden voor Anopheles Research hand ^3.
2. Ontleden mug eierstokken behulp van een tang als eerder beschreven voor Ae. aegypti. ⁴ In het kort, gebruik dan een pincet om de thorax te begrijpen, terwijl een ander pincet trekt de voorlaatste buik-segment naar de eierstokken vrij te geven.
3. Verzamel ontleed speekselklieren of eierstokken in Ambion RNAse-vrij 1,5 ml microfugebuisje buizen met 50 pi PBS.
4. Bewaar de monsters op ijs tot fixatie.

3. Bevestiging

1. Fix ontleed weefsels in vers bereide weke fixatie-oplossing (tabel 1) bij kamertemperatuur met nutatie gedurende 30 minuten tot 1 uur. De fixatie oplossing wordt bereid in verse toestand aan oxidat te voorkomenion van het formaldehyde fixeermiddel. Fixatie voor 1-1.5 uur wordt aanbevolen voor speekselklieren. Een minimum volume van 1 ml wordt aanbevolen voor het bevestigen van weefsels in een 1,5 ml microfugebuis.
2. Laat het weefsel om zich te vestigen op de bodem van de microfugebuis. Dit is een belangrijke stap, die alle wijzigingen van oplossingen in het protocol volgt en minimaliseert significante steekproef verlies.
3. Schenk de fixatie oplossing door een zorgvuldige pipetteren, waardoor 50-100 ul van volume in de microfugebuis en daarna wassen 3 ×, 5 min elk met PBT.
4. Optioneel evenwicht stappen voor weefsel opslag. Stapsgewijze spoelen PBT met ofwel ethanol of methanol. Voer stapsgewijze wassen met PBT / alcohol (3:1, 1:1 en 1:3, 5 min elk). Bewaren in 100% (200 proof) alcohol bij -20 ° C. Weefsels kunnen worden opgeslagen voor een aantal maanden zonder afbraak van weefsel ultrastructuur. Voordat u de volgende stappen van het protocol, moet weefsels worden teruggestuurd naar PBT door stapsgewijs evenwicht met alcohol / PBT (3:1, 1:1,1:3 5 min elk).
5. Voer PBT wast 3 ×, 5 minuten per stuk.
6. Voer spijsvertering met 0,01 mg / ml Proteinase K / PBT, 5 min bij kamertemperatuur. Alternatief, indien beide immunolocalization van eiwitdoelwitten en hybridisatie in situ van RNA gewenst kan eierstokken worden geïncubeerd met 80% aceton / H ₂ O bij -20 ° C gedurende 10 min in plaats van het behandelen met Proteinase K
   Proteïnase K behandeling wordt gelaten voor de voorbereiding van speekselklieren. Ga direct naar 3,10 stap.
7. Onmiddellijk decanteren de spijsvertering oplossing door voorzichtig pipetteren. Was 2 ×, 5 min elk met ijskoude PBT om de spijsvertering te stoppen.
8. Voer extra PBT wast 2 x, 5 min elk bij kamertemperatuur.
9. Post-vast te stellen in weke delen fixatie oplossing bij kamertemperatuur met nutatie gedurende 30 minuten. Post-fixatie stappen worden niet uitgevoerd voor speekselklieren.
10. Voer PBT wast 5 ×, 5 minuten per stuk.

4. Hybridisatie

1. Decanteren zoveel Hyb / PBT mogelijk. Voeg 1 ml Hyb in elk monster buis.
2. Wikkel de monsterbuis in verzegelde lucht beschermende verpakking (noppenfolie) en plaats in een hybridisatie fles. Sluit de fles met een hybridisatie dop van de fles.
3. Pre-hybridisatie en hybridisatie stappen kan gemakkelijk worden uitgevoerd in een hybridisatie oven. Voer pre-hybridisatie bij 55 ° C gedurende 30 minuten met rotatie.
4. Voldoende tijd om de weefsels op de bodem van de microfugebuis, de Hyb dichter is dan PBT. Decanteer zorgvuldig de pre-hybridisatie-oplossing. Weefsels kunnen worden doorschijnend en moeilijk te visualiseren. Voorbeeld verlies kan worden beperkt door 50-100 pi oplossing volume in elk monster buis.
5. Voeg 50 pi volume Hyb in het monster buis en een verwarmingsblok handhaven op 55 ° C.
6. Denatureren de RNA probe van 85 ° C gedurende 5-10 minuten. Onmiddellijk, plaats de gedenatureerde probe op ijs gedurende 5 minuten.
7. Pipetteer de RNA-probe in het monster buis. De RNA-probe zal drijven aan het oppervlak van de Hyb. Meng door de knop de buis voorzichtig.
8. Voer hybridisatie in een totaal volume van 50 tot 100 ul Hyb per monster. Incubeer de monsters in een vaste microfuge rek in een hybridisatie oven of in een zwevende microfugebuis rooster in een waterbad bij 55 ° C gedurende 16-24 uur.

5. RNAse A Behandeling

1. Verwijder de Hyb met de sonde. Het is belangrijk de monsters te handhaven bij 55 ° C tijdens de wasstappen niet-specifieke binding van de resterende niet-gebonden probe verminderen. Indien meerdere monsters gehybridiseerd wordt aanbevolen monsterbuizen houden in een vast blok warmte bij 55 ° C om de hybridisatietemperatuur handhaven gedurende de wasstappen.
2. Voer een snelle wasbeurt met Hyb door pipetteren 1 ml van de oplossing in de microfuge bade en het omkeren van de monsterbuis 5-6 keer.
   Alle volgende snelle wasbeurten in het protocol worden op dezelfde wijze uitgevoerd door het toevoegen van de gewenste oplossing en het omkeren van de monsterbuis een paar keer.
3. Voer twee extra wassen met Hyb bij 55 ° C, 30 min elk rotatie in de hybridisatie oven.
4. Evenwicht in PBT door incubatie bij kamertemperatuur Hyb / PBT (1:1) gedurende 15 minuten met nutatie.
5. Voer PBT wast 5 ×, 5 minuten per stuk.
6. Bereid verse RNAse een buffer. Voer RNAse A behandeling door incubatie in 20 ug / ml RNAse A / PBT bij 37 ° C, gedurende 30 minuten. RNAse A splitst enkelstrengs RNA en zal resulteren in de afbraak van unhybridized RNA probe.
7. Giet RNAse Een buffer en het uitvoeren van een snelle wasbeurt met PBT.
8. Voer PBT wast 3 ×, 5 minuten per stuk.

6. Antilichaam incubatie

1. Bereid het blokkeren oplossing (5% kip serum / 1% West-blokkeren van reagens / PBT) en blok monsters door incubatorting in 1 ml oplossing gedurende 30 min bij kamertemperatuur met nutatie.
2. Voeg 200 ul van een 1:1000 verdunning van anti-DIG-alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd antilichaam in blokkeeroplossing. Incubeer bij 4 ° C, 's nachts met nutatie.

7. Alkalische fosfatase Staining

1. Verwijder het antilichaam en blokkeeroplossing.
2. Voer een snelle wasbeurt met PBT.
3. Voer extra PBT wast 5 ×, 10 min. per stuk. Alternatief kunnen de monsters worden 3x gewassen, 10 min. elk aan een uitgebreide wassen bij 4 ° C, 's nachts met nutatie.
4. Bereid verse AP vlekken buffer.
5. Voer snel wassen met AP vlekken buffer.
6. Voer extra wassen met AP vlekken buffer 3 x, 5 min elk met nutatie.
7. Bereid, volgens instructies van de fabrikant, verse AP kleuroplossing met de AP substraat NBT / BCIP.
8. Incubeer elk monster met 500 ul van AP kleuroplossing bij kamertemperatuur Temperatuure met nutatie, in het donker. De monsters kunnen worden geïncubeerd met betrekking tot de buizen met een ondoorzichtige houder of aluminiumfolie. Reactie progressie worden gecontroleerd om 1-2 minuten voor de vorming van een paarse neerslag. Afhankelijk van de probe concentratie concentratie van doel-RNA en de aanwezigheid van niet-specifieke targets kunnen de vlekken gaat enkele minuten tot enkele uren.
9. Verwijder zoveel van de kleuring oplossing mogelijk. Onvoldoende decanteren resulteert in de vorming van een wit vlokkig neerslag tijdens latere wasstappen.
10. De kleuring wordt volledig gestopt door het uitvoeren van twee snelle wassen met PBT.
11. Voer extra PBT wast 3 ×, 5 minuten per stuk.

8. Glycerol Montage

1. Met behulp van een grote diameter 200 ul pipetpunt, transfer monsters van microcentrifuge buizen in individuele ronde bodem putten van een Pyrex plek plaat.
2. Verwijder het monster deel van de PBT mogelijk.
3. Pipetteer bovenop het monster 70% glycerol / H O ₂ Laat glycerol de weefselmonster permeaat bij 4 ° C, 's nachts. Glycerol behandeling voorkomt uitdroging van de weefsels tijdens de dia-montage.
4. Bereid objectglaasjes door het schoonvegen van de glijbaan oppervlak schoon te maken met Kimwipes. Pas op de slede twee stukken onzichtbare tape evenwijdig aan elkaar zodat ze een smal kanaal (figuur 2) vormen.
5. Met behulp van een artistieke borstel, pick-up monsters een voor een en plaats ze langs de lengte van het kanaal, het plaatsen van elk monster met dezelfde oriëntatie, met betrekking tot de anterior / posterior en dorsale / ventrale uitlijningen.
6. Na het plaatsen elk monster gebruiken Kimwipe wattenstaafje overtollige glycerol oplossing rond het weefsel (figuur 3) te absorberen. Verwijdering van de overmaat glycerol is belangrijk voor de vorming van bellen voorkomen bij het afdichten van de gemonteerde monster op de schuif onder dekglas.
7. Center en plaats zorgvuldig acop slip op het kanaal dat de lijn monsters. Bevestig het deksel semipermanently glijden op de glijbaan door ze de hoeken van het deksel slip met transparante nagellak.
8. Een 200 ul pipet langzaam afvullen in een uiteinde van het kanaal 70% glycerol voldoende te vullen door capillaire werking de gehele ruimte van het kanaal en de ruimte onder de afdekking slip.
9. Permanent verzegeling van de monsters bevestigd door het aanbrengen van nagellak langs alle vier de zijden van het dekglas. Laat de nagellak voldoende drogen alvorens het fotograferen van de gehybridiseerde whole-mount weefsels. Het verdient aanbeveling om beelden van de monsters fotograferen onmiddellijk na montage.

B. in situ hybridisatie voor Mosquito embryo's

Oplossingen en buffers nodig hybridisatie in situ mug embryo beschreven (Tabel 1). Fixatie en hybridisatie procedures die hier zijn gewijzigd van Those voor het eerst gemeld voor de Anopheles gambiae, ^5,6 Aedes aegypti ⁷ en Culex quinquefasciatus ^8.

1. Embryo Collectie

1. Embryo's worden verzameld van 300 gedekt, vrouwelijke volwassen muggen (mag paren met mannetjes gedurende 48 uur, 3 dagen na-opkomst) 72 uur na het bloed geven. De muggen gehandhaafd 3 M sucrose-oplossing, om ovipositie voorkomen voor de beoogde verzamelperiode.
2. Bereid embryoteam containers door voering een 16 oz. papieren beker met Saatilene Hitech mesh zodat het binnenoppervlak van de beker geheel bedekt. Het gaas kan worden aangebracht met behulp van een nietje. Met behulp van deze mesh sterk vermindert vezelachtige verontreinigingen die aanwezig zijn als Whatman filtreerpapier of papieren handdoeken worden gebruikt.
3. Vul het reservoir half vol met gedestilleerd water.
4. Embryo verzameld gedurende 1 uur bij plaatsing van de opvangbak in de kooi, die vervolgens onderdoor een donkere doek om ovipositie te stimuleren.
5. Verzamelde embryo's rijpen om de gewenste ontwikkelingsstadia buiten de kooi in standaard kweekomstandigheden (85% relatieve vochtigheid / 26 ° C). Rijping van embryo's om de verschillende stadia kunnen worden gecorreleerd aan tijd (uur na ovipositie) naar aanleiding van de geschatte ontwikkeling tijdsverloop van embryonale gebeurtenissen beschreven (tabel 2). Deze tabel geeft een overzicht van belangrijke gebeurtenissen in de embryonale ontwikkeling voor de Aedes aegypti, gerapporteerd door Raminani en Cupp, ^9,10 Anopheles gambiae beschreven eerst door Ivanova-Kazas ¹¹ en verder uitgewerkt door Goltsev en collega's, ^12,13 en Culex quinquefasciatus gerapporteerd door Davis. ¹⁴ De beschreven tijd cursussen zijn bedoeld om te dienen als de eerste ramingen, in plaats van absolute tijd punten, voor het verzamelen van embryo's op bepaalde stadia van ontwikkeling.

2. Dechorionation, fixatie, en Endochoriover storingen

1. Transfer embryo's uit de collectie container in een Saatilene mesh dechorionation vangst buis (figuur 3).
   Voor Aedes embryo's, plaatst u de vangst buis in een bekerglas dat gevuld is met genoeg gedestilleerd water, zodat het volume van de vangst buis is de helft vol. Een artistieke borstel kan worden gebruikt om de embryo's los van de Saatilene gaas en dragen ze in de met water gevulde vangst buis.
   Voor Anopheles embryo's, maak de Saatilene gaas uit de collectie container en zorgvuldig vouw de mesh om een trechter te vormen. Houd de mesh trechter met een hand, gebruik dan de andere hand om gedestilleerd water afzien door middel van een polyethyleen spuit fles langs de zijkanten van de trechter naar de embryo's te wassen in de vangst buis. Deze methode kan worden toegepast Anopheles embryo omdat zij niet de klevende stof op het oppervlak van Aedes embryo's die eieren een vast aan ovipositie substraten.
2. Prepare 40 ml dechorionation oplossing (1 volume 5,25% natriumhypochloriet: 3 delen gedestilleerd water). Giet de oplossing in een 100 mm petrischaal.
3. Maak een bekerglas van 100 ml met 50 ml gedestilleerd water en zet apart. De dechorionation stap is de tijd-gevoelig en onmiddellijk na de natriumhypochloriet behandeling van de embryo's ondergedompeld worden in dit water, aan de dechorionation oplossing te verdunnen.
4. Dechorionate de embryo's in het gaas te vangen buis door het plaatsen van de buis in de petrischaal gevuld met dechorionation oplossing. Gebruik een wegwerp polyethyleen transferpipet of Pasteur pipet om de embryo's te wassen, terwijl wervelende de vangst flacon zodat de embryo's ondergedompeld blijven en geagiteerd in de dechorionation oplossing.
   Maximaal 35 sec vereist voor dechorionation van Aedes embryo, terwijl 75 sec volstaat Anopheles en Culex embryo (Tabel 3). Dechorionation een van de meest gevoelige treden van de protocol en over-de uitbreiding van de natriumhypochloriet behandeling, speciaal voor Aedes embryo's zal belemmeren kraken van het chorion.
5. Onmiddellijk onder water de vangst flacon in de bekerglas met water.
6. Was de resterende dechorionation oplossing uit de embryo's door het verwijderen van de vangst los van de met water gevulde bekerglas en het afspoelen van de binnen-en buitenwanden van de vangst buis met gedestilleerd water uit een spuit fles of kraan uitgerust met buizen.
7. Dechorionation kan worden geverifieerd door het visualiseren van de embryo's met een dissectie microscoop bij een lage vergroting. Dechorionated Aedes embryo's niet over het net-achtige exochorion en alleen de gladde, gepolijste oppervlak van de zwarte endochorion blijkt Voor dechorionated Anopheles embryo's, de exochorionic praalwagens en ridge structuren afwezig zijn (figuur 4).
8. Met behulp van een artistieke borstel, breng de dechorionated embryo's in een scintillatie flacon met 5 ml gedestilleerd water (Figuur 5-1). Als er meerdere monsters zijn in voorbereiding, onderhouden van de vangst buizen in water om verdroging van de embryo's te voorkomen.
9. Laat de embryo bezinken naar de onderkant van de scintillatieflesje en verwijder zoveel water uit de flacon mogelijk.
10. Voeg 5 ml heptaan in de scintillatieflesje (Figuur 5-2). Verwijder het resterende water dat achterblijft in de scintillatieflesje.
11. Voeg in de scintillatieflesje 5 ml vers bereide embryo fixatie-oplossing (tabel 1).
12. Bevestig de embryo's gedurende 30 minuten met inversie, zodat de organische en waterige fasen goed te mengen, maar niet krachtig.
13. Verwijder de fixatie oplossing om met een glas Pasteur pipet, zorg dat u de interfase, waarin de embryo's bevat (Figuur 5-3) te verstoren.
14. Was de resterende fixatie oplossing door het vullen van de scintillatieflesje met zoveel gedestilleerd water mogelijk te maken. Keer de injectieflacon 5 keer enverwijder vervolgens al het gedestilleerd water.
15. Vul de scintillatieflesje met 20 ml gedestilleerd water en meng door het flesje gedurende 30 minuten.
16. Verwijder al het water uit de scintillatieflesje.
17. Voeg kokend gedestilleerd water in de scintillatieflesje zodat de anorganische heptaan fase de bovenrand van de flacon.
18. Incubeer gedurende 30 sec en verwijder al het kokend water.
19. Voeg ijskoud gedestilleerd water totdat het anorganische fase de bovenrand van de flacon. Incubeer de flacon in ijs gedurende 10 minuten.
20. Verwijder eerst de waterige en organische fase. De heptaan zal ondoorzichtige verschijnen op deze stap (Figuur 5-4).
21. Voeg 5 ml nieuwe heptaan in de flacon. Verwijder al het resterende water uit de flacon.
22. Voeg 5 ml methanol in de flacon. Zwenk de flacon 1-2 keer energiek, zonder schudden (Figuur 6). Als anorganische heptaan en organische fasen worden methanol krachtig geschud de embryo wizal worden vernietigd tijdens endochorion scheuren. Het is opmerkelijk om te vermelden dat we variatie waargenomen in de efficiëntie van endochorion verstoring voor de verschillende stammen van het Aedes aegypti embryo's.
23. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 min. Tijdens deze fase zal de fasen worden als gevolg van het vrijkomen van dooier componenten (Figuur 5-5) troebel.
24. Verwijder zowel organische als anorganische fasen en was met methanol 3 keer om alle resterende heptaan te verwijderen.
25. Embryo's kunnen worden opgeslagen in methanol bij -20 ° C tot enkele maanden.

3. Peeling

1. Plaats een stuk dubbelzijdige plakband toupee in het midden van 3 cm petrischaal. Toupee band wordt gebruikt omdat de lijm is stabiel in aanwezigheid van methanol en ethanol.
2. Met behulp van een grote diameter (ongeveer 3 mm diameter) 200 ul pipetpunt, transfer embryo's uit methanol op de dubbelzijdige tape.
3. Laat 1-2 minuten voor de embryo's zich te vestigen en ADHere op het bandoppervlak.
4. Decanteren overmaat methanol en laat het oppervlak enigszins drogen 1-2 min.
5. Voeg 4 ml 95% (190 standaardsterkte) ethanol in de Petrischaal.
6. Pipetteer 600 ul van gedestilleerd water in de ethanol en zwenk om te mengen. De tape zal ondoorzichtig in kleur. Toevoeging van gedestilleerd water zorgt ervoor dat de tape te worden kleverig en de embryo's te immobiliseren tijdens de peeling. Deze stap kan worden weggelaten indien gewenst.
7. Gebruik een 27,5 naald bevestigd aan een 1 ml spuit los te laten de gekraakte endochorion (figuur 7). Na het loslaten van de witte embryo van de zwarte endochorion restanten, over te dragen de embryo's van de band om de ethanol reservoir van de petrischaal met een fijn-tip artistieke borstel. Met behulp van een 3-mm boring pipetpunt, overdracht van de embryo's in een Ambion 1,5 ml microfugebuis met 500 pi van 200 bewijs ethanol.
   De gepelde embryo's niet langer op de band gedurende langere tijd omdat ze zich perpermanent op de tape.
8. Voer 2-3 snel wassen met 100% (200 proof) ethanol en bewaar de embryo's in stipt ethanol bij -20 ° C. Geschild embryo's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende enkele maanden zonder dat morfologie of de latere hybridisatiesignaal.

4. Verduidelijking van Yolk

1. Voer een snelle wasbeurt met 200 bewijs ethanol. Nauwgezet ethanol worden gebruikt voor alle volgende wasstappen en voor de bereiding van de P-xyleen dooier verduidelijking oplossing.
2. Voer een ethanol wassen, 5 min met nutatie.
3. Incubeer in P-xylene/ethanol (9:1) bij kamertemperatuur 1 tot 1,5 h bij nutatie. Het xyleen stap maakt verduidelijking van de dooier massa verbetering van het signaal-ruisverhouding.
4. Verwijder de xyleen-ethanol-oplossing en het uitvoeren van twee snelle wassen met ethanol.
5. Voer een ethanol wassen, 5 min met nutatie.
6. Voer twee snelle wassen met methanol, gevolgd door een methanol wassen, 5 min metnutatie.
7. Evenwicht in 4% formaldehyde-oplossing fixatie door wassen eenmaal met methanol / formaldehyde fixatie-oplossing (1:1).

5. Fixatie en in situ hybridisatie

Fixatie en hybridisatie in situ procedures zijn identiek aan die beschreven in het protocol sectie A.

C. representatieve resultaten

De hybridisatie in situ protocol beschreven, resulteert in gekleurde kleurpatronen dat de aanwezigheid en de lokalisatie van de beoogde mRNA geven. Het is van belang te benadrukken dat de relatieve niveau van transcriptie overvloed niet kan worden bepaald door in situ hybridisatie. Hybridisatie resultaten zijn afhankelijk van de specifieke mRNA probe voor de hybridisatie procedure, de veelheid van de doel-mRNA in de gehybridiseerde weefsel alsmede probeconcentratie en hybridisatietemperatuur. Vergelijking van weefsels gehybridiseerd met antisense en de bijbehorende zin mRNA sondes mogelijk te maken de juiste interpretatie van kleurpatronen.

Hybridisatie in situ van de hele monteren speekselklieren van de vrouwelijke Aedes aegypti met mRNA sondes die zich richten op amylase1 (AAEL006719), D7s2 (AAEL006423) en D7L2 (AAEL006424) accumulatie van deze transcripten in proximale-laterale, distaal-laterale geven, en distale- laterale / mediale lobben, respectievelijk (figuur 8). ¹ hele-mount eierstokken van de drie muggensoorten werden gehybridiseerd met mRNA probes die specifiek gericht zijn op de respectieve orthologe transcripties van Oskar (Figuur 9). ^7,8 Hybridisatie in situ van de hele-mount embryo's van Ae. aegypti, An. gambiae en Cx. quinquefasciatus werd uitgevoerd met antisense RNA probes gericht op de respectieve mug oskar ortholoog transcripten (figuur 10). ^7,8

IGUUR 1 "src =" / files/ftp_upload/3709/3709fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van na hybridisatie montage opstelling.

Figuur 2. Voorbereiding van Kimwipe mop gebruikt tijdens de steekproef montage. Een Kimwipe weefsel wordt strak gedraaid om een fijne punt mop om overtollig montage medium absorberen uit de monsters en schuif te produceren.

Figuur 3. Schematische Saatilene mesh dechorionation vangst buis. A) De onderkant van 50 ml polystyreen conische buis is afgesneden om een holle buis 4,5 cm in lengte aan beide uiteinden open verkregen. Een ronde opening is uitgesneden uit de conische buis deksel toe vloeistof te wassen met een 6,5 cm ² vierkant stuk Saatilene mesh. De 330 draden per inch, 34 micron diameter draad gaas houdt de mug embryo's. B) Assembled vangen buis.

Figuur 4. Aedes aegypti en Anopheles gambiae eieren, voor en na dechorionation. A) Aedes aegypti eieren voor dechorionation. De mesh-achtige exochorion ligt boven de zwarte endochorion en geeft het ei een gestructureerd karakter (inzet vergroting). Na verwijdering van de exochorion, alleen de gladde en gepolijste endochorion blijft (B en inzet uitbreiding). C) De eieren van de Anopheles gambiae voorafgaand aan dechorionation. Exochorion structuren zoals praalwagens te zien zijn (pijlen). D) De gladde en gepolijste oppervlak van de endochorion zichtbaar is na dechorionation. Bar = 100 pm.

Figuur 5. Een reeks van opeenvolgende stappen voor fixatie en endochorion verstoring van de Ae. aegypti eieren. A) Schuine-vooraanzichten B) laterale-view van scintillatieflesjes met Ae. aegypti eieren tijdens de opeenvolgende stappen van de fixatie en endochorion verstoring. 1) Embryo's in gedestilleerd water. 2) Embryo's zweven in de interfase tussen de bovenste heptaan fase en de waterige onderlaag. 3) Na de fixatie van de embryo's tegelijk in te pakken in een ronde massa. Embryo's blijven in de interfase tussen heptaan en fixeermiddel oplossing fasen. 4) Na behandeling met kokend water en incubatie in ijs, de heptaan fase wordt iets ondoorzichtig. 5) Embryo met verstoorde endochorions wordt in de interface tussen een ondoorzichtige en doorzichtige heptaan fase methanol fase.

Figuur 6. Endochorion verstoring van vaste Ae. aegypti eieren. A) Direct na het energieke wervelende heptaan en methanol fasen, kan de vorming van bellen en de verstoring van de endochorion worden gevisualiseerd. B) Following vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur.

Figuur 7. Mosquito eieren na verstoring en verwijdering van de endochorion. Eieren van Ae. aegypti (A), An. gambiae (B) en Cx. quinquefasciatus (C) na fixatie en verstoring van de endochorion. Wit, doorschijnende embryo's kunnen worden gezien binnen de gebarsten endochorion. Na verwijdering van de endochorion de doorschijnende embryo's van Ae. aegypti (D), An. gambiae (E) en Cx. quinquefasciatus (F) zijn duidelijk zichtbaar. Bar = 100 pm.

Figuur 8. Hybridisaties in situ voor drie genen die tot expressie in verschillende lobben van hele-mount, vrouwelijke Ae. aegypti speekselklieren. Kleuring is indicatief voor lokalisatie en de accumulatie van amylase1 (AAE L006719) (A), D7s2 (AAEL006423) (B) en D7L2 (AAEL006424) (B). Bar = 100 pm.

Figuur 9. Hybridisatie in situ voor muggen Oskar antisense-RNA-probes voor hele-mount muggen eicellen en verpleegkundige cellen. Fase IV eicellen (OOC) ontleed uit eierstokken van An. gambiae (A), Ae. aegypti (B) en Cx. quinquefasciatus (C) en gehybridiseerd met probes gericht RNA respectieve mug oskar mRNAs. Primaire follikels zijn georiënteerd met anterior aan de linkerkant. Vlekken op het achterste paal (blauwe pijl) wijzen geaccumuleerde Oskar mRNA's. Secundaire (F2) en tertiaire (f3) follikels worden getoond en kleuring (zwarte pijl) geven accumulatie van Oskar mRNA in de verpleegkundige cel cytoplasma (NCC). Kleuring is uitgesloten van de verpleegkundige celkernen (NCN). Bar = 50 urn.

ad/3709/3709fig10.jpg "/>
Figuur 10. Hybridisatie in situ voor muggen Oskar antisense-RNA-probes voor hele-mount mug embryo's. Embryo zijn georiënteerd met anterior links. Cellulaire blastoderm stadium embryo's van An. gambiae (A) en Cx. quinquefasciatus (C) worden gehybridiseerd met respectieve muggensoorten-specifieke probes oskar RNA. B) Een syncytieel blastoderm podium Ae. aegypti embryo gehybridiseerd met RNA-probes gericht op Ae. aegypti Oskar transcript. Kleuring is duidelijk in de achterste paal cellen van alle embryo's, met vermelding van lokalisatie en de accumulatie van muggen Oskar mRNA in deze cellen. Bar = 50 urn.

Tabel 1. Oplossingen en buffers voor formaldehyde gel-elektroforese, fixatie en hybridisatie in situ.

ftp_upload/3709/3709table2.jpg "/>
Tabel 2. Ontwikkelings-evenementen en morfologische waarnemingen overeenstemmen met opeenvolgende stadia tijdens embryogenese mug.

Tabel 3. Samenvatting van de belangrijkste verschillen in pre-hybridisatie stappen verschillende weefseltypen.

Discussion

De in situ hybridisatie en colorimetrische kleuringsprotocol presenteerde hier voor de hele-mount muggen weefsels en embryo's is een nuttige techniek voor de lokalisatie van transcripties in specifieke organen en celtypes. Deze procedures zijn een verbetering ten opzichte van onze eerder gemeld methoden, zowel in het stroomlijnen van uitgebreide wasstappen en het verstrekken van aanvullende technische details en reagens bronnen.

Onze ervaring is dat colorimetrische detectie van hybridisatie signalen is superieur in gevoeligheid en de helderheid van hybridisatie-signaal in vergelijking met fluorescentie detectie op basis van regelingen. Bovendien colorimetrische detectie omzeilt kwesties in verband met het signaal discriminatie in embryo's, die inherent auto-TL. Beperkingen in het opsporen van hybridisatie signalen zich voordoen als een lage-overvloed transcripties zijn gericht en achtergrondkleuring is evident. Het verhogen van de hybridisatietemperatuur van 65 ° C is gebleken verminderen teruggrond hybridisatiesignalen, maar niet voorgesteld vervanging voor het ontwerpen unieke doelwitspecifieke RNA probes.

Dit protocol is gebruikt om uit te voeren in situ hybridisatie van hele-mount speekselklieren van Aedes aegypti, en eierstokken en embryo's van Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti en Culex quinquefasciatus. Deze methode is ook toepasbaar op andere mug weefsels en vermoedelijk van andere insecten. Daarnaast hebben we samengesteld voor het eerst vergelijkende richtlijnen voor de enscenering van de embryonale ontwikkeling in drie vector muggen, Ae. aegypti, An. gambiae en Cx. fatigans. Zij zijn beschreven voor specifieke stammen van deze drie soorten onder discreet kweekomstandigheden. Het is belangrijk op te merken dat de ontwikkeling tijdsverloop kan variëren voor verschillende stammen van muggensoorten en onder verschillende kweekomstandigheden. Hybridisaties in situ supplement aan de gang zijnde inspanningen om anaLyze de transcriptomen van muggen en andere geleedpotigen, en kan een beter beeld van de regulatie van genexpressie in deze organismen te bieden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA	Ambion	AM9261
1M Tris-HCl	Ambion	AM9855G	pH8.0
10X PBS	Ambion	AM9625
20X SSC	Ambion	AM9763
1.5 ml microfuge tubes	Ambion	AM12400	Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Storage at 4 °C
DEPC water	Ambion	AM9932
Proteinase K	Ambion	AM2546
5.25% Sodium hypochlorite	Austin’s		A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus	Ambion	AM2733	Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase	Ambion	AM2082	Storage at -20 °C
95% Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-500
HPLC-grade methanol	Fisher Scientific	A452-1
Magnesium chloride	Fisher Scientific	M87-500
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-542A	18 x18 mm
N-Heptane	Fisher Scientific	H350-1
P-xylene	Fisher Scientific	O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate	Fisher Scientific	13-748B	100x85 mm
Sodium chloride	Fisher Scientific	AC32730-0025
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape	Hair Direct	RED-75R12	Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli	Invitrogen	K457501 K457540	20 reactions 40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA	Invitrogen	15632-011	Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche Applied Science	1093274	Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix	Roche Applied Science	1277073	Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution	Roche Applied Science	1681451	Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent	Roche Applied Science	11921673001	Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130)	Saati Print	330.34 UO PW	330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol	Sigma	G6279-1	70% in PBT
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
Tween 20	Sigma	P1379-500
37% Formaldehyde	Ted Pella	18508	10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids	The Paper Company	SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap	VWR International	66022-128	20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material	VWR International	500018-081	10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum			Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.