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Immunology and Infection

이종 교잡 doi: 10.3791/3709 Published: June 28, 2012

Summary

시간적 및 공간적 유전자 발현 분석은 기능 유전체학에 중요한 역할을합니다. 전체 마운트 하이브리드화

Abstract

모기 arboviruses, protozoan 기생충 및 nematodes 포함한 병원균의 다양한 집합에 대한 벡터입니다. 재생에 관련된 모기 호스트와 병원체 상호 작용, 그리고 장기에이 모기 질병일 전송을 줄이고 달걀 개발을 중단하는 전략에 대해 큰 관심되는 티슈로 표현되는 성적 증명서 및 유전자 규제 당국의 조사. 도구의 숫자는 유전자 발현의 시간적 및 조직 관련 규정을 연구하고 검증 고용되었습니다. 여기서는 특정 유전자가 표현하고 그들의 제품이 축적되는 곳이 우리의 이해를 향상시켜 공간적 정보를 얻기 위해 개발되었습니다 프로토콜을 설명합니다. 설명한 프로토콜은 다시하는 표현을 확인하고 이러한 여성 침샘뿐만 아니라 난소와 배아의 subcellular 구획 등 모기 매개로 병원체 전송에 관련된 조직에 성적 축적 패턴을 결정하는 데 사용되었습니다모기 복제 및 개발에 늦었어.

다음 절차는 대상 특정 하이브리드화 신호의 손실없이 프로토콜의 여러 단계의 효율성을 향상 최적화된 방법론을 나타냅니다. 수집, 고정, 사전 하이브리드화 및 모기 배아의 하이브 리다이 제이션을위한 구체적인 단계는 부품 B.에 상세히하는 동안 RNA 프로브 준비에 대한 지침은 부드러운 조직 및 고정과 하이브 리다이 제이션을위한 일반적인 절차의 해부는 부분에 설명되어 있습니다

Protocol

부드러운 티슈에 대한 원래의 장소에 답변 하이브리드화 : 모기 침샘과 난소

다음 절차에 필요한 솔루션과 버퍼를위한 조리법은 표 1에 요약되어 있습니다.

1. RNA 프로브 준비 및 품질 분석

  1. PCR로 디자인 primers 관심의 성적 대상을 증폭. 그것은 amplicon은 ≥ 600의 길이는 세포핵 그리고 더 중요한 것은 amplicon 시퀀스가​​ 대상 성적표에 고유한는 점입니다 것을 권장합니다. - 고유하지 않은 시퀀스는 교차 반응성 RNA 프로브를 생성할 가능성을 제거하기 위해 피할 수 있습니다.
  2. pCR4-TOPO 벡터, 또는 이와 유사한 복제 벡터로 PCR 제품을 복제. pCR4-TOPO 클로닝 벡터는 T7과 단일 클론에서 감각과 안티 센스 실행 - 오프 전사 제품의 생산을 활성화 T3 RNA의 효소의 마중물 사이트를 포함하고 있습니다.
  3. 시퀀스 시퀀스 FID를 확인하기 위해 복제된 amplicon벡터 플라스미드 내의 elity와 방향.
  4. 시험 관내 전사 제품에 안티 센스를 생산하기에 적합한 효소로 제한 다이제스트 반응을 수행합니다. 플라스미드 선형화는 나 같은 Spe I, PST 나 같은 pCR4-TOPO 벡터의 다중 복제 지역에 거주 제한 사이트를 선택하여 간단 아닌지 이루어집니다 선택된 제한 사이트가 복제된 조각에 존재 없다는 것을 확인하십시오. 동일한 클론은 배경 제어 역할을하는 감각 - 스트랜드 RNA 프로브를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 감지 프로브가있는 현장에서 하이브 리다이 제이션은 상호 보완적인 안티 센스 프로브의에 비해 거의 없거나 전혀없는 신호를 줘야한다.
  5. pCR4-TOPO의 클론이 완전히 선형되는 겔 전기 영동으로 확인합니다.
  6. 에탄올 침전 다음에 페놀 - 클로로포름 추출을 수행하여 선형 플라스미드 DNA를 정화. 플라스미드 DNA를 precipitating 때 그것은 최종 concent 사용을 권장합니다에탄올 2.5 권 2 M의 암모늄 아세테이트의 배급은 연행 이상 잔류 소금의 시험 관내 전사 반응로를 줄일 수 있습니다.
  7. digoxigenin (잘해봐) - 라벨 템플릿으로 선형 플라스미드 DNA 1 μg를 사용하여 시험 관내 전사 반응에서 실행 해제를 수행하여 단일 좌초된 RNA 프로브를 준비합니다. RNA의 효소 전송 버퍼와 같은 제조 업체의 지침에 기술된 쫄지마 RNA 라벨 믹스와 반응을 준비합니다.
  8. 에탄올 침전에 의해 시험 관내 전사 제품, 쫄지마-레이블을 정화하고 DEPC-처리된 증류수에 pelleted RNA를 resuspend.
  9. 포름 알데히드 겔 전기 영동에 의한 품질 및 정화 쫄지마-라벨이 RNA 프로브의 예상 분자량을 확인합니다. 준비한 RNA 프로브가 aliquots로 나누어 -80에 저장할 수 ° C에서 사용까지.

2. 모기 침샘과 난소의 해부

  1. 모기 타액 glan 해부같은 애를 위해 이전에 설명된 프로브와 집게를 사용하여 DS. 들어 aegypti. 1,2. 애에 대해 설명하는 것처럼 gambiae, 침샘은 해부를 할 수 있습니다. aegypti, 또는 양자 택일과 같은 아노 펠 레스 리서치 매뉴얼에 대한 MR4 방법에서 설명한 3.
  2. 위해 이전에 설명된대로 집게를 사용하여 모기 난소를 해부. aegypti 4. 간단히, 포셉 또 한 쌍의은 난소를 공개하는 어미에서 두 번째의 음절 복부 부분을 떼어내는 동안 흉부을 파악하는 데 포셉 한 쌍을 사용합니다.
  3. PBS의 50 μl를 포함 Ambion RNAse 프리 1.5 ML의 microfuge 튜브의 해부 침샘이나 난소를 수집합니다.
  4. 고정까지 얼음에 샘플을 유지합니다.

3. 응시

  1. 30 분 ~ 1 시간을위한 머리를 굽힘과 상온에서 갓 준비된 부드러운 조직 고정 솔루션 (표 1)에서 해부하는 조직을 수정합니다. 고정 솔루션은 oxidat을 방지하기 위해 신선한을 준비하고 있습니다포름 알데히드 정착액의 이온. 1-1.5 시간에 대한 고정은 침샘을 권장합니다. 한 ML의 최소 볼륨은 1.5 ML의 microfuge 튜브에 조직을 고정시키는 것이 좋습니다.
  2. 조직이 microfuge 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 이것은 프로토콜의 솔루션의 모든 변경 사항을 다음과 상당한 샘플의 손실을 최소화하는 것입니다 중요한 단계입니다.
  3. 3 ×, 5 분마다 PBT로 씻고 나서 microfuge 튜브의 볼륨 50-100 μl를 떠나, 조심 pipetting으로 고정 솔루션을 가만히 따르다합니다.
  4. 조직 스토리지 옵션 평형 단계. Stepwise는 에탄올이나 메탄올 중으로 PBT를 린스. PBT / 알코올 (3시 1분, 1시 1분 및 1시 3분, 5 분마다)로 단계 현명한 세차장을 수행합니다. -20 ° C. 100 %가 스토어 (200 증명서)는 알코올 조직은 조직 ultrastructure의 저하없이 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 프로토콜의 후속 단계를 수행하기 전에 휴지는 알코올 / PBT (3시 1분, 1시 1분과 stepwise 평균하여 PBT로 반환되어야합니다1시 3분, 5 분 각각).
  5. PBT는 3 × 각 5 분을 씻어 수행합니다.
  6. 상온에서 0.01 밀리그램 / ML Proteinase K / PBT, 5 분과 단백질 소화를 수행합니다. RNA의 현장에있는 단백질의 목표와 하이브리드화 두 immunolocalization이 원하는 경우 또는, 난소은 10 분 대신 Proteinase K '로 치료를 위해 -20 ° C에서 80 % 아세톤 / H 2 O와 incubated 수
    Proteinase K 처리는 침샘의 준비를 위해 생략됩니다. 3.10 단계로 바로 진행합니다.
  7. 즉시주의 pipetting에 의한 소화 솔루션을 가만히 따르다. 얼음처럼 차가운 PBT와 ×, 5 분, 각 소화를 중지 2 씻으십시오.
  8. 수행 추가 PBT는 2 ×, 실온에서 5 분 각각 씻는다.
  9. 30 분 위해 머리를 굽힘과 함께 실온에서 부드러운 조직 고정 용액에 이후의 수정 프로그램입니다. 이후 고정 단계가 침샘을 위해 수행되지 않습니다.
  10. PBT는 5 × 5 분마다을 씻어 수행합니다.

4. 이종 교잡

  1. 가만히 따르다 Hyb / PBT 가능한 한 많이. 각 샘플 튜브에 Hyb 1 ML을 추가합니다.
  2. 하이브 리다이 제이션 병 안의 밀폐된 공기 보호 포장 (버블 랩)과 장소에서 샘플 튜브를 넣어. 하이브 리다이 제이션 병 뚜껑과 병을 밀봉합니다.
  3. 사전 하이브리드화 및 하이브리드화 단계 하이브 리다이 제이션 오븐에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 회전과 30 분 동안 55 ° C에서 사전 하이브 리다이 제이션을 수행합니다.
  4. Hyb는 PBT보다 고밀도이기 때문에 조직이 microfuge 튜브의 바닥에 정착하기 위해 충분한 시간을 허용하십시오. 조심스럽게 사전 하이브 리다이 제이션 솔루션을 가만히 따르다. 조직은 반투명하고 시각화하기 어려운 될 수 있습니다. 샘플 손실은 각 샘플 튜브 솔루션 볼륨 50-100 μl 이별로 줄일 수 있습니다.
  5. 55 ° C.에 열 블록에 샘플 튜브에 Hyb 50 μl 볼륨을 추가하고 유지
  6. 5-10 분 동안 85 ° C에서 RNA 프로브를 변성. 즉시, 5 분 동안 얼음 변성 프로브를 놓습니다.
  7. 샘플 튜브에 RNA 프로브를 피펫. RNA 프로브는 Hyb의 표면에 부유합니다. 부드럽게 튜브를 flicking하여 섞는다.
  8. 샘플 당 Hyb의 50-100 μl의 총 볼륨에 하이브 리다이 제이션을 수행합니다. 하이브 리다이 제이션 오븐 내부에 고정 microfuge 걸이에, 또는 55에서 물을 욕조에 떠있는 microfuge 튜브 랙, ° 16-24 시간에 대한 C에서 샘플을 품어.

5. RNAse 치료

  1. 프로브를 포함 Hyb를 제거합니다. 그것은 잔여 언바운드 프로브가 아닌 특정 바인딩을 줄이기 위해 세척 단계 동안 55 ° C에서 샘플을 유지하는 것이 중요합니다. 몇 가지 샘플 hybridized있다면, 그것은 세척 단계에 걸쳐 하이브리드화 온도를 유지하기 위해 55 ° C에서 설정한 열 블록에 샘플 튜브를 유지하는 것이 좋습니다.
  2. microfuge 욕조에 솔루션 1 ML을 pipetting하여 Hyb과 빠른 세차를 수행전자와 반전 샘플 튜브 5-6 번.
    프로토콜의 모든 후속 빠른 세차장이 필요한 솔루션 및 반전 샘플 튜브를 여러 번 추가하여 유사하게 수행됩니다.
  3. 55시 Hyb있는 두 개의 추가 세차장 ° C, 30 분 하이브 리다이 제이션 오븐에 회전 각을 수행합니다.
  4. 머리를 굽힘과 15 분 동안 Hyb / PBT (1:1)로 실온에서 잠복기가 PBT로 평형을 유지하다.
  5. PBT는 5 × 5 분마다을 씻어 수행합니다.
  6. 신선한 RNAse에게 버퍼를 준비합니다. RNAse 30 분 20 μg 37 / ML RNAse / PBT ° C에서 잠복기에 의한 치료를 수행합니다. RNAse 클리브 단일 좌초된 RNA하고 unhybridized RNA 프로브의 저하가 발생합니다.
  7. 가만히 따르다 RNAse는 버퍼와 PBT와 빠른 세차를 수행합니다.
  8. PBT는 3 × 각 5 분을 씻어 수행합니다.

6. 항체 보육

  1. incuba에 의해 (5 % 닭 혈청 / 1퍼센트 서양 차단 시약 / PBT) 및 블록 샘플 신선한 차단 솔루션을 준비머리를 숙임로 상온에서 30 분 대한 해결책 1 ML에 힘들.
  2. 안티 - 쫄지마-알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP) - 복합 솔루션을 차단에서 항체의 1:1000 희석 200 μl를 추가합니다. 머리를 굽힘과 함께 하룻밤, 4 ° C에서 품어.

7. 알칼리 인산 분해 효소의 염색법

  1. 항체 및 차단 솔루션을 제거합니다.
  2. PBT와 빠른 세차를 수행합니다.
  3. 수행 추가 PBT는 5 ×, 10 분 각각 씻는다. 또한 샘플은 3 배, 10 분 각 4에 확장 세차 ° C, 머리를 굽힘과 하룻밤 뒤에 씻어하실 수 있습니다.
  4. 신선한 에이피 염색법 버퍼를 준비합니다.
  5. 에이피 염색법 버퍼에 빠른 세차를 수행합니다.
  6. 에이피 염색법 버퍼 3 추가 세차장 ×, 5 분 머리를 굽힘 각을 수행합니다.
  7. 제조 업체의 지침, AP 기판 NBT / BCIP를 포함하는 신선한 에이피 염색법 솔루션에 따라 준비합니다.
  8. 객실 temperatur에서 에이피 염색법 솔루션을 500 μl 각 샘플을 품어어둠 속에서 머리를 굽힘과 E. 샘플은 불투명 용기 또는 알루미늄 박과 함께 튜브를 취재하여 incubated 수 있습니다. 반응의 진행은 자주색 침전물의 형성을위한 모든 1-2분를 모니터링해야합니다. 프로브 농도, 표적 RNA의 농도 및 비 구체적인 대상의 존재에 따라 염색법은 몇 시간 몇 분 동안 진행됩니다.
  9. 가능한 한 더럽히는 것 솔루션의만큼을 제거합니다. 이후 세척 단계 중 흰색 응집 침전물의 형성에 불만족 decantation 결과입니다.
  10. 염색법은 PBT 두 빠른 세차장를 수행하여 완전히 중지됩니다.
  11. 수행 추가 PBT는 3 × 각 5 분 씻는다.

8. 글리세롤은 마운트

  1. Pyrex 명소 플레이트의 개별 왕복 아래쪽 우물로 microfuge 튜브에서 큰 구멍 200 μl 피펫 팁, 전송 샘플을 사용합니다.
  2. 많은 PBT의 최대한 조심스럽게 시료에서 제거.
  3. 샘플 70 % 글리세롤 / H 2 O에 위에 피펫 하룻밤 사이, 4 ° C에서 샘플 조직을 침투하는 글리세롤을 허용합니다. 글리세롤 치료는 슬라이드 장착시 조직의 건조를 방지합니다.
  4. 슬라이드 표면 Kimwipes로 깨끗이 닦고하여 현미경 슬라이드를 준비합니다. 서로 보이지 않는 테이프 병렬 두 조각 그래서 그들은 좁은 채널 (그림 2)을 형성하는 슬라이드에 적용합니다.
  5. 예술적인 브러쉬를 사용하여 샘​​플을 하나씩 데리러와 후부 / 앞부분과 지느러미 / 복부 정렬과 관련하여, 동일한 방향으로 각각의 샘플을 포지셔닝, 채널의 길이에 따라 그들을 넣으십시오.
  6. 각각의 샘플을 배치한 후, 조직 (그림 3)을 둘러싼 과도한 글리세롤 용액을 흡수하여 Kimwipe 면봉을 사용합니다. 과잉 글리세롤의 제거는 커버 슬립 아래 슬라이드를 향해 탑재된 샘플을 씰링 때 거품의 형성을 방지하는 것이 중요합니다.
  7. 센터 및 장소 신중하게 교류정렬 샘플을 포함한 채널을 통해 전표여. 접사 커버 투명 매니큐어로 커버 슬립의 모서리를 dabbing하여 슬라이드에 semipermanently 슬립.
  8. 200 μl pipettor를 사용하여 채널에 충분한 70 % 글리세롤 모세관 현상에 의해 커버 슬립 아래 채널 및 지역의 전체 공간을 채울의 한쪽으로 천천히 분배.
  9. 영구적으로 커버 슬립의 모든 사면을 따라 매니큐어를 적용하여 마운트된 샘플을 봉인. hybridized 전체 마운트 티슈 촬영 전에 충분히 건조 손톱 폴란드 허용합니다. 그것은 바로 장착 후 샘플의 이미지 사진을 찍은 것을 권장합니다.

모기 배아의 현장에서 바실러스 하이브리드화

모기 배아의 현장에서 하이브 리다이 제이션에 필요한 솔루션 및 버퍼는 (표 1)에 설명되어 있습니다. 여기에 제시된 고정 및 하이브리드화 절차 도스에서 수정되었습니다전자 먼저 아노 펠 레스 gambiae, 5,6 Aedes aegypti 7 Culex quinquefasciatus에 대해 보고된 8.

1. 배아 컬렉션

  1. 태아도 300 성관계, 여성 성인 모기 (48 H을위한 남성, 사후 출현 삼일로 짝짓기 수) 혈액 수유 후 72 시간에서 수집하고 있습니다. 모기는 사전에 의도한 컬렉션 기간에 산란을 방지하기 위해, 3 미터 자당 솔루션을 유지 관리됩니다.
  2. 16온스 즐비한하여 배아 수거 용기를 준비합니다. 컵 안쪽 표면이 완전히 덮여 있도록 Saatilene Hitech 메쉬와 종이컵. 메쉬는 하나의 스테이플을 사용하여 첨부하실 수 있습니다. 이 메쉬를 사용하면 크게 워트 먼지 필터 종이 또는 종이 타올을 사용하는 경우 존재하는 섬유 오염 물질을 줄여 준다.
  3. 증류수로 반 전체 컨테이너를 채웁니다.
  4. 태아도 이후에 덮여 새장에서 수거 용기를 배치하여 1 시간을 위해 수집됩니다어두운 천으로에 의해 산란을 자극합니다.
  5. 수집된 배아가 표준 양육 조건 (85 ​​% 상대 습도 / 26 ° C)에서 새장 밖 원하는 발달 단계에 성숙하는 데 사용할 수 있습니다. 여러 단계의 태아의 성숙은 (표 2) 설명 배아 사건의 대략적인 발달 시간은 코스에 따라 시간 (시간 이후 산란)로 상호하실 수 있습니다. 이 테이블은 Raminani 및 Cupp에 의해보고 Aedes aegypti를위한 배아 발달의 주요 사건을 요약, 9,10 아노 펠 레스 gambiae은 이바 노바 - Kazas 11 시까지는 첫번째 설명과 자세한 Goltsev 및 동료, 12,13과 데이비스에 의해 보고된 Culex의 quinquefasciatus에 의해 정교. 14 설명 시간 과정은 오히려 발전의 특정 단계에서 배아의 수집을위한 절대 시간 점보다 초기 견적으로 제공하기위한 것입니다.

2. Dechorionation, 고정 및 Endochori장애에 대한

  1. Saatilene 메쉬 dechorionation 캐치 튜브 (그림 3)에 수거 용기에서 배아를 전송합니다.
    Aedes의 배아의 경우 캐치 튜브의 볼륨을 한 반 가득 있도록 충분한 증류수로 가득 비커에 캐치 튜브를 넣습니다. 예술적인 브러쉬는 Saatilene 메쉬로부터 배아를 이동시키다과 물 가득 캐치 튜브로 그들을 전송하는 데 사용할 수 있습니다.
    아노 펠 레스의 배아의 경우 수거 용기에서 Saatilene 메쉬를 분리하고 깔때기를 형성하기 위해 신중하게 메쉬를 접으십시오. 한손으로 메쉬 퍼널을 개최하는 것은, 캐치 튜브로 배아를 씻어 깔때기의 측면을 따라 폴리에틸렌 물총 병으로 증류수 하는걸 다른 손을 사용합니다. 그들은 산란 기판에 충실하기 위해 계란을 가능하게 Aedes의 배아의 표면에 존재하는 접착 물질이 부족하기 때문에이 방법은 아노 펠 레스의 배아에 적용할 수 있습니다.
  2. PRdechorionation 솔루션의 epare 40 ML (1 부피 5.25 %의 나트륨 차아 염소 산염 : 증류수 3 권). 100mm 배양 접시에 솔루션을 하거라.
  3. 증류수 50 ML을 포함한 100 ML의 비커를 준비하고 따로 설정합니다. dechorionation 단계는 배아가 dechorionation 솔루션을 희석하기 위해,이 물에 뛰어든 것이다 시간에 민감한 즉시 다음과 같은 나트륨 차아 염소 산염 처리입니다.
  4. dechorionation 솔루션 가득 배양 접시에 튜브를 삽입하여 메쉬 잡을 튜브의 배아를 Dechorionate. 배아는 dechorionation 솔루션에 빠져들과 흥분 상태를 유지하도록 캐치의 병을 소용돌이 치는 동안 배아를 씻어 일회용 폴리에틸렌 송금 피펫이나 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
    75 초가 아노 펠 레스와 Culex의 배아 (표 3) 충분한 상태에서 35 초 중 최대, Aedes의 배아의 dechorionation 필요합니다. Dechorionation는 제자의 가장 민감한 단계 중 하나입니다ocol과 나트륨 차아 염소 산염 처리의 과잉 확장, 특히 Aedes의 배아에 대한 chorion의 적절한 균열을 방지할 수 있습니다.
  5. 물이 들어있는 비커에 바로 잠수함 캐치의 약병.
  6. 물이 채워진 비커에서 캐치 튜브를 제거하고 튜브를 들으며 물총 병이나 수도꼭지에서 증류수로 캐치 튜브의 내부 및 외벽을 rinsing하여 배아에서 나머지 dechorionation 솔루션을 씻으십시오.
  7. Dechorionation은 낮은 배율에서 해부 현미경으로 배아를 시각화하여 확인할 수 있습니다. Dechorionated Aedes의 배아는 그물 같은 exochorion 부족하고 검은 endochorion만을 부드러운 광택 표면은 dechorionated 아노 펠 레스의 배아의 경우 exochorionic 수레와 능선 구조는 (그림 4) 부재가 없었던 이유는.
  8. 예술적인 브러쉬를 사용하여 증류수 WA의 5 ML을 포함하는 섬광 유리병에 dechorionated 배아를 전송ter (그림 5-1). 여러 샘플 준비중인 경우 태아의 탈수를 방지하기 위해 물에 캐치 튜브를 유지합니다.
  9. 배아는 섬광 유리병의 기지로 정착​​하고 가능 한한 유리병에서 많은 물로 제거하자.
  10. 섬광 유리병 (그림 5-2)에 헵탄 5 ML을 추가합니다. 섬광 유리병에 남아있는 잔류 수분을 제거합니다.
  11. 갓 준비한 배아 고정 솔루션의 섬광 유리병 5 ML (표 1)에 추가합니다.
  12. 유기 및 수성 단계는 목숨 걸고 철저히 섞어 아니지만 너무 반전으로 30 분 동안 배아를 고정한다.
  13. (그림 5-3) 배아가 들어있는 계면을 방해하지 않도록주의되는 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 고정 솔루션을 제거합니다.
  14. 가능한 한 많은 증류수와 함께 섬광 유리병을 작성하여 잔류 고정 솔루션을 씻으십시오. 유리병에게 5 번 및 반전다음 증류수를 모두 제거합니다.
  15. 30 분 대한 반전 유리병에 의해 증류수와 혼합 20 ML과 함께 섬광 병을 채우십시오.
  16. 섬광 유리병에서 물을 모두 제거합니다.
  17. 무기 헵탄 단계는 약병의 상단에 도달하도록 섬광 유리병에 충분한 끓는 증류수를 추가합니다.
  18. 30 초 동안 부화 후 끓는 물에을 모두 제거합니다.
  19. 무기 단계는 약병의 상단에 도달할 때까지 얼음 차가운 증류수를 추가합니다. 10 분 동안 얼음에 유리병을 품어.
  20. 먼저 다음 수성 및 유기 단계를 제거합니다. 헵탄이 단계 (그림 5-4)에서 불투명한 나타납니다.
  21. 유리병에 새로운 헵탄 5 ML을 추가합니다. 유리병에서 모든 남아있는 물을 제거합니다.
  22. 유리병에 메탄올의 5 ML을 추가합니다. 1-2 번 energetically 소용돌이 유리병을 떨지 않고 (그림 6). 무기 헵탄 및 유기 메탄올의 위상이 흔들리고있다면 적극적으로 배아 WI를endochorion 파열 동안 파괴되고하겠습니다. 우리가 Aedes aegypti의 배아의 여러 변종에 대한 endochorion 장애의 효율성에 변화를 관찰한 것을 언급 주목할만한 것입니다.
  23. 15-20 분 동안 상온에서 품어. 이 단계 동안, 단계는 노른자 구성 요소 (그림 5-5)의 출시로 인해 흐린 될 것입니다.
  24. 유기 및 무기 단계를 모두 제거하고 모든 잔류 헵탄을 제거하기 위해 메탄올로 3 회 씻는다.
  25. 태아도 몇 개월 동안 -20 ° C에서 메탄올에 저장할 수 있습니다.

3. 필링

  1. 3cm 페트리 접시의 중앙에 양면 가발 테이프의 조각을 놓으십시오. 접착제는 메탄올과 에탄올의 면전에서 안정이기 때문에 가발 테이프가 사용됩니다.
  2. 양면 테이프로 메탄올로부터 대형 배기량 (약 3 밀리미터 직경) 200 μl 피펫 팁, 전송 배아를 사용.
  3. 1-2 이주 배아의 분 및 adh 허용테이프 표면 감수해야.
  4. 가만히 따르다 초과 메탄올과 표면 1-2 분 동안 약간 건조하실 수 있습니다.
  5. 배양 접시에 95 % 4 ML (190 증명) 에탄올을 추가합니다.
  6. 에탄올과 섞어 소용돌이에 증류수의 피펫 600 μl. 테이프 색상의 불투명이 될 것입니다. 증류수의 추가가 테이프가 볼품되어 필링 동안 배아를 고정하게됩니다. 원하는 경우이 단계는 생략할 수 있습니다.
  7. 금이 endochorion (그림 7) 벗기다에 1 ML의 주사기 배럴에 부착된 27.5 게이지 바늘을 사용합니다. 검은 endochorion의 잔존물에서 흰색 배아를 공개 후, 테이프에서 미세 팁을 예술 브러시를 사용하여 배양 접시의 에탄올 저수지로 배아를 전송합니다. 3 mm 구멍 피펫 팁을 사용, 200 증거의 에탄올 500 μl를 포함 Ambion 1.5 ML의 microfuge 관으로 배아를 전송합니다.
    그들은 당 준수 있으므로 벗겨 배아는 오랜 기간 동안 테이프에 남아 안됩니다manently 테이프에.
  8. 100 % 2-3 빠른 세차장 (200 증명) 에탄올을 수행하고 -20 ° C.에 격식을 차리는 에탄올에 배아를 저장 벗겨 태아는 형태학이나 이후의 하이브리드화 신호에 영향을 미치지 않고 몇 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

4. 노른자의 해명

  1. 200 증거의 에탄올과 빠른 세차를 수행합니다. 격식을 차리는 에탄올은 모든 후속 세척 단계와 P-크실렌 노른자의 해명 솔루션의 준비를위한 사용해야합니다.
  2. 한 에탄올 세척, 머리를 굽힘과 5 분을 수행합니다.
  3. 머리를 굽힘과 1-1.5 H 위해 상온에서 P-xylene/ethanol (9시 1분)에서 품어. 크실렌 단계는 잡음 비율로 신호를 향상시키는 노른자 질량의 허가를 허용합니다.
  4. 크실렌-에탄올 용액을 제거하고 에탄올을 가진 두 빠른 세차장을 수행합니다.
  5. 한 에탄올 세척, 머리를 굽힘과 5 분을 수행합니다.
  6. 한 메탄올 세척 다음에 메탄올을 가진 두 빠르게 세차장, 5 분 수행머리를 숙임.
  7. 메탄올 / 포름 알데히드 고정 용액 (1:1)로 한 번 세척하여 4 % 포름 알데히드 고정 용액으로 평형.

5. 원래의 장소에 고정 및 하이브리드화

원위치 절차에 고정과 하이브리드화 프로토콜이 섹션 A에서 설명된 것과 동일합니다

C. 대표 결과

원위치 프로토콜의 하이브리드화, 여기서 존재하는 타겟 mRNA의 지방화를 나타내는 색깔 염색법 패턴의 결과를 설명했다. 그것은 성적의 풍요의 상대적인 수준을 원래의 장소에 하이브 리다이 제이션에 의해 결정될 수 없다는 것을 강조하는 것이 중요합니다. 하이브 리다이 제이션 결과 하이브 리다이 제이션 절차에 사용되는 특정 mRNA 프로브, hybridized 조직의 표적 mRNA뿐만 아니라, 프로브 농도와 하이브리드화 온도의 풍부에 의존합니다. 조직의 비교는 안티 센스와 hybridized 및 해당 감각 mRNA 프로브는 염색법 패턴의 정확한 해석이 가능합니다.

대상 amylase1 (AAEL006719), D7s2 (AAEL006423) 및 D7L2 (AAEL006424)는 근위-가로, 말초-측면에서 이러한 성적 증명서 축적을 나타내는 것이 mRNA 프로브와 암컷 Aedes aegypti 전체 마운트 침샘의 현장에서 하이브 리다이 제이션, 그리고 말초- 각각 가로 / 중간 엽 (叶), (그림 8). 세 모기 종 1 전체 마운트 난소는 특히 오스카의 각 orthologous 녹취록 (그림 9)를 대상으로 mRNA 프로브에 hybridized되었다. 7,8 하이브 리다이 제이션은 전체 마운트 배아의 현장에서 애니다. aegypti,. gambiaeCX. quinquefasciatus은 각 모기 오스카 orthologous 성적 증명서 (그림 10)을 대상으로 안티 센스 RNA 프로브를 사용하여 수행되었다. 7,8

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1 그림. 이후 하이브 리다이 제이션의 개략도는 설정 장착.

그림 2
그림 2. Kimwipe 걸레의 준비 장착 샘플 중에 사용. Kimwipe 조직은 샘플 및 슬라이드에서 초과 장착 매체를 흡수하는 미세 스쳐지나 걸레를 생성하기 위해 긴밀하게 왜곡하고 있습니다.

그림 3
그림 3. Saatilene 메쉬 dechorionation 캐치 관의 개략도.) 50 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브의 아래쪽은 양쪽 길이 4.5 cm, 오픈 속이 빈 튜브를 양보하기 위해 차단됩니다. 원형 개구부는 Saatilene 메쉬의 6.5 cm 사각형 조각을 통해 세탁하는 액체 허용하는 원뿔 튜브 뚜껑 밖으로 절단된다. 인치 당 330 스레드, 34 마이크론 직경 스레드 메쉬 화면 모기 배아를 보유합니다. B) 엉덩이튜브를 잡아 embled.

그림 4
4. Aedes aegypti과 아노 펠 레스 gambiae 달걀, dechorionation 전후.) Aedes aegypti 달걀 전에 dechorionation에 그림. 메쉬 같은 exochorion는 검은색 endochorion 위에 놓여와 계란에게 질감 모양 (삽입된 페이지 확대)를 제공합니다. exochorion을 제거 후, ​​전용 부드럽고 광택 endochorion은 (B 및 삽입된 페이지 확대) 남아 있습니다. C) dechorionation 이전 아노 펠 레스 gambiae의 계란. 같은 수레 같은 Exochorion 구조는 (화살표) 볼 수 있습니다. D) endochorion의 부드럽고 광택 표면은 dechorionation 후 볼 수 있습니다. 바 = 100 μm의.

그림 5
그림 5. 고정 및 애의 endochorion 장애에 대한 순차적인 단계 시리즈. aegypti 달걀.) 한쪽으로 치우 쳤던-전두엽보기애를 포함하는 섬광 튜브와 B) 측면 뷰. 고정 및 endochorion 장애의 연속적인 단계 동안 aegypti 달걀. 증류수 1) 태아. 2) 태아는 상단 헵탄 단계와 낮은 수성 단계 사이의 계면에 떠. 3) 다음과 같은 고정 배아는 둥근 덩어리에 함께 포장. 태아는 헵탄 및 정착액 솔루션 단계 사이의 계면에 남아 있습니다. 4) 얼음에 물을 끓여과 부화로 치료 후, 헵탄 위상이 약간 불투명이됩니다. 5) 교란 endochorions있는 태아도 불투명 헵탄 위상과 투명한 메탄올 단계 사이의 계면에 표시됩니다.

그림 6
6 그림. 고정 애의 Endochorion 장애. aegypti 달걀. ) 직후는 정력 헵탄과 메탄올의 단계로 소용돌이, 거품의 형성과 endochorion의 장애는 시각이 될 수 있습니다. B) Followi상온에서 부화로 NG가 5 분.

그림 7
그림 7. 장애 및 endochorion의 제거에 따라 모기 계란. 애의 계란. aegypti (A). gambiae (B)와 CX. quinquefasciatus (C) 다음과 같은 고정 및 endochorion의 혼란. 흰색, 반투명 배아는 금이 endochorion 내에서 볼 수 있습니다. 후 endochorion의 제거, 애의 반투명 배아. aegypti (D). gambiae (E)와 CX. quinquefasciatus (F)는 명확하게 볼 수 있습니다. 바 = 100 μm의.

그림 8
그림 8. 전체 마운트, 여자 애의 다른 엽 (叶)으로 표현 세 유전자에 대한 원래의 장소에 Hybridizations. aegypti 침샘. 염색법은 amylase1의 국산화 및 축적 (AAE는 지표이다 L006719) (), D7s2 (AAEL006423) (B)와 D​​7L2 (AAEL006424) (B). 바 = 100 μm의.

그림 9
9 그림. 전체 마운트 모기 oocytes와 간호사 세포에 모기 오스카 안티 센스 RNA 프로브에 대한 현장의 하이브 리다이 제이션. 단계 IV는 oocytes (ooc)는의 난소에서 해부 했어요. gambiae (), 애. aegypti (B)와 CX. quinquefasciatus (C)하고 각 모기 오스카의 mRNAs을 대상으로 RNA 프로브에 hybridized. 기본 모공이 왼쪽 앞부분과 지향합니다. 후부 극 (파란색 화살촉)에서 염색법 것은 오스카의 mRNAs을 축적 나타냅니다. 차 (F2)와 차 (F3) 모공이 표시 및 염색법 (블랙 화살촉)는 ​​간호사 세포 세포질 (NCC)의 오스카 mRNA의 축적을 표시하고 있습니다. 염색법은 간호사 세포 핵 (ncn)에서 제외됩니다. 바 = 50 μm의.

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10 그림. 전체 마운트 모기 배아에 모기 오스카 안티 센스 RNA 프로브에 대한 현장의 하이브 리다이 제이션. 태아는 왼쪽 앞부분과 지향합니다. 의 셀룰러 배반엽 단계의 배아. gambiae ()와 CX. quinquefasciatus은 (C) 각 모기 종 특정 오스카 RNA 프로브에 hybridized있다. B) syncytial 배반엽의 무대 애. aegypti의 배아는 애을 대상으로 RNA 프로브에 hybridized. aegypti 오스카 성적 증명서. 염색법은 이러한 세포의 모기 오스카의 mRNA의 국산화 및 축적을 나타내는 모든 배아의 사후 극 세포에 분명하다. 바 = 50 μm의.

표 1
표 1. 현장의 포름 알데히드 겔 전기 영동, 고정 및 하이브 리다이 제이션을위한 솔루션 및 버퍼.

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표 2. 모기 embryogenesis 동안 연속적인 단계에 해당하는 발달 이벤트 및 형태학의 일이었습니다.

표 3
표 3. 다양한 조직 유형에 대한 사전 하이브 리다이 제이션 단계의 주요 차이점을 요약.

Discussion

현장과 colorimetric 염색법 프로토콜의 하이브 리다이 제이션은 전체 마운트 모기 조직 및 배아를 보시려면 여기를 제시하는 것은 특정 장기 및 세포 유형 내에서 성적의 지방화를위한 유용한 기술입니다. 이러한 절차는 우리 이전에 보고된 방법을 통해 모두 광범위한 세차 단계를 능률화 및 추가 기술적인 세부 사항 및 시약 소스를 제공하는 개선입니다.

우리의 경험에서 하이브 리다이 제이션 신호 colorimetric 감지 형광 기반의 탐지 방식에 비해 하이브리드화 신호의 감도와 선명도에서 우수합니다. 또한 colorimetric 감지 본질적 자동 형광 있습니다 배아에서 신호 차별과 관련된 문제를 circumvents. 낮은 풍부 성적이 타겟으로하는 경우 하이브리드화 신호 검출에 한계가 발생 배경 염색법은 분명하다. 65 하이브리드화 온도를 높이면 ° C는 다시 감소하는 것으로 확인되었습니다지상 하이브리드화 신호, 독특 대상 특정 RNA 프로브를 설계를위한 제안 대체할 수 없습니다.

이 프로토콜은 전체 마운트 타액 Aedes aegypti의 분비와 난소 및 아노 펠 레스 gambiae, 아노 펠 레스 stephensi, 애의 배아의 현장에서 하이브 리다이 제이션을 수행하는 데 사용되었습니다. aegyptiCulex quinquefasciatus. 이 방법은 또한 다른 모기 조직에 적용, 그리고 아마도 다른 곤충 분들입니다. 또한, 세 벡터 모기, 애의 배아 발달의 준비에 대해 처음으로 비교 지침에 대해 컴파일된. aegypti,. gambiae 및 CX. fatigans. 관찰은 신중하고 양육 조건이 세 종류의 특정 변종을 위해보고되었습니다. 그것은 발달 시간 코스 모기 종의 서로 다른 변종과 다른 양육 조건 하에서 다를 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 현장 보충제의 Hybridizations 아나에 노력을에 지속적모기와 다른 arthropods의 transcriptomes을 lyze, 이러한 생물의 유전자 발현의 조절의 더 나은 사진을 제공할 수 있습니다.

Disclosures

저자는 전혀 공개가 없습니다.

Acknowledgments

저자들은 이후 적응과에서 하이브 리다이 제이션을 위해 여기에서 설명한 프로토콜을 개발하기 위해 수정된 아노 펠 레스 gambiae의 배아의 현장에서 하이브 리다이 제이션을위한 프로토콜의 논의 부드러운 조직 및 유리 제품 Goltsev위한 원위치 방법으로 개발 하이브 리다이 제이션의 조언 마리카 월터스 감사드립니다 Aedes과 Culex의 배아의 현장. 또한 아담 정지와 데이빗 Kosman 준 유용한 권장 사항을 인정합니다. 우리는 과학적 논의 Osvaldo Marinotti 감사 및 프로토콜 텍스트 편집.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Ambion AM9261
1M Tris-HCl Ambion AM9855G pH8.0
10X PBS Ambion AM9625
20X SSC Ambion AM9763
1.5 ml microfuge tubes Ambion AM12400 Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide Ambion AM9342 Storage at 4 °C
DEPC water Ambion AM9932
Proteinase K Ambion AM2546
5.25% Sodium hypochlorite Austin’s A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus Ambion AM2733 Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase Ambion AM2082 Storage at -20 °C
95% Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
37% Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
HPLC-grade methanol Fisher Scientific A452-1
Magnesium chloride Fisher Scientific M87-500
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-542A 18 x18 mm
N-Heptane Fisher Scientific H350-1
P-xylene Fisher Scientific O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate Fisher Scientific 13-748B 100x85 mm
Sodium chloride Fisher Scientific AC32730-0025
Sodium hydroxide Fisher Scientific SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape Hair Direct RED-75R12 Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli Invitrogen K457501 K457540 20 reactions
40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA Invitrogen 15632-011 Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments Roche Applied Science 1093274 Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix Roche Applied Science 1277073 Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution Roche Applied Science 1681451 Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent Roche Applied Science 11921673001 Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130) Saati Print 330.34 UO PW 330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol Sigma G6279-1 70% in PBT
Heparin sodium salt Sigma H3393
Tween 20 Sigma P1379-500
37% Formaldehyde Ted Pella 18508 10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids The Paper Company SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap VWR International 66022-128 20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material VWR International 500018-081 10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.

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References

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이종 교잡<em&gt; 현장에서</em&gt; 침샘, 난소, 그리고 벡터 모기의 태아의
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Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes. J. Vis. Exp. (64), e3709, doi:10.3791/3709 (2012).More

Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes. J. Vis. Exp. (64), e3709, doi:10.3791/3709 (2012).

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