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Immunology and Infection

Hibridização doi: 10.3791/3709 Published: June 28, 2012

Summary

Análises de expressão temporal e espacial de genes têm um papel crucial em genômica funcional. Todo mount-hibridização

Abstract

Os mosquitos são vetores para um conjunto diverso de patógenos, incluindo arbovírus, protozoários e nematóides. Investigação de transcrições e reguladores de genes que são expressos em tecidos em que o mosquito hospedeiro e interagir patógeno, e de órgãos envolvidos na reprodução são de grande interesse para as estratégias para reduzir o mosquito-borne transmissão da doença e impedir o desenvolvimento do ovo. Um certo número de ferramentas foram utilizados para estudar e validar a regulação temporal e tecido específico da expressão do gene. Aqui, nós descrevemos protocolos que têm sido desenvolvidos para obter informação espacial, que aumenta a nossa compreensão de onde genes específicos são expressos e os seus produtos acumular. O protocolo descrito foi utilizado para validar expressão e determinar os padrões de acumulação de transcritos em tecidos relacionados com transmitida por mosquitos transmissão de patógenos, tais como do sexo feminino glândulas salivares, bem como compartimentos subcelulares de ovários e embriões, que retarde para reprodução do mosquito e desenvolvimento.

Os procedimentos seguintes representam uma metodologia optimizado que melhora a eficiência de vários passos do protocolo sem perda de sinais de alvo específicas de hibridação. Diretrizes para a preparação do RNA sonda, a dissecção dos tecidos moles e ao procedimento geral para a fixação e hibridação estão descritos na Parte A, enquanto os passos específicos para a coleta, fixação, hibridação e pré-hibridação de embriões de mosquitos são detalhados na Parte B.

Protocol

A. Hibridação in situ de partes moles: Mosquito glândulas salivares e ovários

Receitas para soluções e tampões necessários para os procedimentos seguintes são apresentadas na Tabela 1.

1. RNA Preparação Probe e Análise de Qualidade

  1. Primers de Design para PCR amplificar o alvo transcrição de interesse. Recomenda-se que o fragmento amplificado é igual ou superior a 600 nucleótidos de comprimento e, mais importante que a sequência de amplicão é única para a transcrição de destino. Sequências que são não-exclusivo são evitados, para eliminar a possibilidade de gerar sondas de RNA com reactividade cruzada.
  2. Clone do produto da PCR no vetor protocolo PCR4-TOPO, ou vetor de clonagem semelhante. O protocolo PCR4-TOPO vector de clonagem contém T7 e T3 RNA polimerase sítios de priming que permitem a produção de ambos sentido e anti-sentido produtos run-off de transcrição a partir de um único clone.
  3. Sequência do amplicon clonados para verificar seqüência fidelity e orientação no interior do plasmídeo vector.
  4. Realizar uma reacção de restrição digerir com uma enzima adequada para produzir um anti-sentido in vitro do produto de transcrição. Linearização do plasmídeo é feita simples, seleccionando um sítio de restrição localizado na região de clonagem múltipla do vector de protocolo PCR4-TOPO, tais como Spe ​​I, Pst I, ou não I. Assegure-se que o sítio de restrição seleccionada não está presente no fragmento clonado. O clone mesmo pode ser usado para gerar uma sonda sentido vertente-RNA, que serve como um controle de fundo. A hibridação in situ com uma sonda sentido deve dar pouco ou nenhum sinal, quando comparada com a de a sonda anti-sentido complementar.
  5. Verificar por electroforese em gel de que o clone protocolo PCR4-TOPO é completamente linearizado.
  6. Purifica-se o DNA plasmídeo linearizado através da realização de uma extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol. Quando precipitar o DNA de plasmídeo, recomenda-se usar uma concent definitivaração de acetato de amónio 2 M, com 2,5 volumes de etanol para reduzir a transição de sal residual para a reacção de transcrição in vitro.
  7. Preparar a digoxigenina (DIG)-rotulado de cadeia simples da sonda de RNA através da realização de um run-off in vitro reacção de transcrição, utilizando 1 ug de DNA do plasmídeo linearizado como um modelo. Preparar a reacção com RNA polimerase, tampão de transcrição e de RNA DIG mistura de rotulagem, como descrito por instruções do fabricante.
  8. Purifica-se o DIG-rotulado, em produtos de transcrição in vitro por precipitação com etanol e ressuspender o RNA peletizadas em DEPC tratada com água destilada.
  9. Verificar a qualidade e peso molecular esperado da sonda purificada RNA DIG-rotulados por electroforese em gel de formaldeído. A sonda de RNA preparada pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -80 ° C até à utilização.

2. Dissecção de glândulas salivares do mosquito e ovários

  1. Dissecar glan salivar do mosquitods usando uma sonda e uma pinça, como descrito anteriormente para o Ae. aegypti 1,2. Para Uma. gambiae, glândulas salivares podem ser dissecados como descrito para Ae. aegypti, ou, alternativamente, como descrito nos Métodos para MR4 Anopheles Research manual. 3
  2. Dissecar ovários de mosquito, utilizando fórceps, como descrito anteriormente para Ae. aegypti. 4 Resumidamente, use um par de pinças para agarrar o tórax, enquanto outro par de fórceps tira o penúltimo segmento abdominal para liberar os ovários.
  3. Collect dissecados glândulas salivares ou ovários em Ambion RNase tubos de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 50 ul de PBS.
  4. Manter as amostras em gelo até a fixação.

3. Fixação

  1. Fixar tecidos dissecados em recém-preparado solução do tecido mole de fixação (Tabela 1) à temperatura ambiente com nutação durante 30 min a 1 h. A solução de fixação é preparado fresco para evitar a oxidatião do fixador formaldeído. Fixação para 1-1,5 horas é recomendado para as glândulas salivares. Um volume mínimo de 1 ml é recomendada para a fixação de tecidos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Permitir que os tecidos para assentar no fundo do tubo de microcentrífuga. Este é um passo importante, que se segue todas as alterações das soluções no protocolo e irá minimizar a perda de amostra significativa.
  3. Decantar a solução de fixação por pipetagem cuidadosa, deixando 50-100 uL de volume no tubo de microcentrífuga e depois lavar 3 ×, 5 min cada um com PBT.
  4. Opcionais passos de equilíbrio para o armazenamento de tecido. Stepwise enxaguar PBT com etanol ou metanol. Realizar passo a passo lavagens com PBT / álcool (3:1, 1:1 e 1:3, 5 min cada). Armazenar em 100% (200 proof) de álcool a -20 ° C. Os tecidos podem ser armazenados durante vários meses sem degradação do ultraestrutura tecido. Antes de realizar os passos subsequentes do protocolo, os tecidos deve ser devolvida à PBT por equilibração stepwise com álcool / PBT (3:1, 1:1,1:3, 5 min cada).
  5. Realizar PBT lava 3 ×, 5 min cada.
  6. Realizar a digestão de proteínas com 0,01 mg / ml de Proteinase K / PBT, 5 min à temperatura ambiente. Alternativamente, se ambos imunolocalização de proteínas alvo e hibridização in situ do RNA são desejados, os ovários pode ser incubada com acetona a 80% / H2O a -20 ° C durante 10 min em vez de tratar com proteinase K.
    Proteinase K tratamento é omitido para a preparação das glândulas salivares. Prossiga directamente para o passo 3.10.
  7. Imediatamente decantar a solução de digestão por pipetagem cuidadosa. Lavar 2 ×, 5 min cada um com gelada PBT para parar a digestão.
  8. Realizar PBT adicional lava 2 ×, 5 min cada, à temperatura ambiente.
  9. Pós-fixação em solução de tecido mole de fixação à temperatura ambiente com nutação durante 30 min. Pós-fixação etapas não são realizadas para as glândulas salivares.
  10. Execute PBT lava 5 ×, 5 min cada.

4. Hibridização

  1. Decantar tanto HYB / PBT quanto possível. Adicionar 1 ml de HYB em cada tubo de amostra.
  2. Enrole o tubo de amostra de ar selado embalagem protetora (bolha) e coloque dentro de uma garrafa de hibridização. Sele a garrafa com uma tampa de garrafa de hibridização.
  3. Etapas de pré-hibridação e hibridação podem ser realizadas facilmente num forno de hibridação. Realizar a hibridação pré-, a 55 ° C durante 30 min com rotação.
  4. Permitir tempo suficiente para os tecidos para assentar no fundo do tubo de microcentrífuga, como o HYB é mais denso do que PBT. Decantar cuidadosamente a solução de pré-hibridização. Os tecidos podem tornar-se translúcido e de difícil visualização. Perda de amostra pode ser reduzida, deixando 50-100 uL de volume de solução em cada tubo de amostra.
  5. Adicionar 50 ul de volume de HYB no tubo de amostra e manter em um bloco de aquecimento a 55 ° C.
  6. Desnaturar a sonda de ARN a 85 ° C durante 5-10 min. Imediatamente, colocar a sonda desnaturada em gelo durante 5 min.
  7. Pipetar a sonda de RNA para dentro do tubo de amostra. A sonda de RNA irá flutuar à superfície do HYB. Misture sacudindo suavemente o tubo.
  8. Realizar a hibridação em um volume total de 50-100 ul de HYB por amostra. Incubar as amostras em um bastidor de microcentrífuga fixo dentro de um forno de hibridação, ou em um rack flutuante de microcentrífuga tubo num banho de água, a 55 ° C durante 16-24 hr.

5. RNase A Tratamento

  1. Remover o HYB contendo a sonda. É importante manter as amostras a 55 ° C durante os passos de lavagem para reduzir a ligação não específica de sonda não ligada residual. Se várias amostras são hibridados, recomenda-se para manter os tubos de amostra num bloco de aquecimento definir a 55 ° C para manter a temperatura de hibridação ao longo dos passos de lavagem.
  2. Realizar uma lavagem rápida com HYB por pipetagem de 1 ml de solução para a banheira de microcentrífugaE e tubo da amostra invertendo 5-6 vezes.
    Todos os lavagens subsequentes rápidas no protocolo são realizadas de forma semelhante, adicionando a solução necessária e os tempos de invertendo o tubo de amostra várias.
  3. Executar duas lavagens adicionais com HYB a 55 ° C, 30 min cada, com rotação no forno de hibridação.
  4. Equilibre em PBT por incubação à temperatura ambiente com HYB / PBT (1:1) durante 15 min com nutação.
  5. Execute PBT lava 5 ×, 5 min cada.
  6. Prepare RNAse fresco Um buffer. Realizar RNAse Um tratamento por incubação em 20 ug / ml de RNAse A / PBT, a 37 ° C, durante 30 min. RNase A cliva individuais RNA de cadeia e irá resultar na degradação da sonda não hibridada RNA.
  7. Decantar RNAse tampão A e realizar uma lavagem rápida com PBT.
  8. Realizar PBT lava 3 ×, 5 min cada.

6. Incubação do anticorpo

  1. Preparar solução de bloqueio fresco (5% de soro de galinha / 1% de ocidentais de bloqueio de reagente / PBT) e amostras de bloco por incubaçãoting em 1 ml de solução durante 30 min à temperatura ambiente com nutação.
  2. Adicionar 200 ul de uma diluição de 1:1000 de anti-DIG-fosfatase alcalina (AP)-anticorpo conjugado em solução de bloqueio. Incubar a 4 ° C, durante a noite com nutação.

7. A coloração da fosfatase alcalina

  1. Remover o anticorpo e solução de bloqueio.
  2. Realizar uma lavagem rápida com PBT.
  3. Execute PBT adicional lava 5 ×, 10 min cada. Em alternativa, as amostras podem ser lavadas 3x, 10 min cada seguido por uma lavagem prolongada, a 4 ° C, durante a noite com nutação.
  4. Prepare tampão coloração fresca AP.
  5. Realizar lavagem rápida com AP tampão coloração.
  6. Realizar lavagens adicionais com AP tampão coloração 3 ×, 5 min cada um com nutação.
  7. Preparar, de acordo com as instruções do fabricante, a solução de coloração fresco AP contendo o substrato NBT AP / BCIP.
  8. Incubar cada amostra com 500 ul de solução de coloração AP em temperatur quartoe com nutação, no escuro. As amostras podem ser incubadas cobrindo os tubos com um recipiente opaco ou folha de alumínio. Progressão de reacção deve ser monitorizada a cada 1-2 minutos para a formação de um precipitado púrpura. Dependendo da concentração de sonda, a concentração de RNA alvo e na presença de não-específicos alvos, a coloração pode prosseguir durante vários minutos a várias horas.
  9. Remover o máximo da solução de coloração quanto possível. Insatisfatórios resultados de decantação na formação de um precipitado branco floculento durante as etapas de lavagem subsequentes.
  10. A coloração é parado completamente através da realização de duas lavagens rápidas com PBT.
  11. Realizar PBT adicional lava 3 ×, 5 min cada.

8. Glicerol Montagem

  1. Usando um grande furo 200 uL ponta de pipeta, as amostras de transferência a partir de tubos de microcentrífuga em individuais de fundo redondo de poços de uma placa de mancha Pyrex.
  2. Cuidadosamente remover da amostra, tal como a maior parte do PBT possível.
  3. Pipetar no topo da amostra de glicerol 70% / H 2 O. Permitir que o glicerol para permear o tecido da amostra a 4 ° C, durante a noite. Tratamento glicerol impede a dessecação dos tecidos durante a montagem de slides.
  4. Preparar lâminas de microscópio limpando a superfície da lâmina limpar com Kimwipes. Aplicar sobre a lâmina dois pedaços de fita adesiva invisível paralelo uns aos outros de modo que formam um canal estreito (Figura 2).
  5. Usando uma escova artístico, pegar amostras um-por-um e colocá-los ao longo do comprimento do canal, posicionando cada amostra com a mesma orientação, com respeito a alinhamentos anterior / posterior e dorsal / ventral.
  6. Depois de posicionar cada amostra, utilizando um pano de Kimwipe para absorver o excesso solução de glicerol que envolve os tecidos (Figura 3). A remoção do excesso de glicerol é importante para prevenir a formação de bolhas, quando selagem das amostras montado na corrediça sob uma lamela.
  7. Centro e coloque cuidadosamente acMais de deslizamento ao longo do canal contendo as amostras alinhadas. Cole a tampa semi-permanente escorregar sobre a lâmina, esfregando os cantos da lamínula com unhas polonês transparente.
  8. Usando uma pipeta de 200 uL, dispensar lentamente em uma extremidade do canal suficiente 70% de glicerol para encher por acção capilar todo o espaço do canal ea área sob o deslizamento da tampa.
  9. Permanentemente selar as amostras montadas aplicando unha polonês ao longo de todos os quatro lados da lamínula. Permitir que a unha polonês para secar suficientemente antes de fotografar os hibridizados todo montagem tecidos. Recomenda-se para fotografar imagens das amostras imediatamente após a montagem.

B. hibridação in situ para embriões de mosquitos

Soluções e tampões necessários para a hibridação in situ para os embriões de mosquitos são descritos (Tabela 1). Fixação e hibridização procedimentos apresentados aqui foram modificados a partir those relatada pela primeira vez para o Anopheles gambiae, 5,6 Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus 7 8.

1. Colheita de embriões

  1. Os embriões são coletados de 300 cobertas, mosquitos adultos do sexo feminino (permitido para acasalar com machos de 48 h, 3 dias pós-emergência) 72 h após o repasto sanguíneo. Os mosquitos são mantidos em 3 de solução M de sacarose, a fim de evitar oviposição antes do período de recolha pretendido.
  2. Prepare recipientes de colheita de embriões por revestimento de um 16 onças. copo de papel com Saatilene Hitech malha de modo que a superfície interior do copo é coberto completamente. A malha pode ser afixada usando um grampo único. Usando este malha reduz grandemente os contaminantes que estão presentes fibrosos se papel de filtro Whatman, ou toalhas de papel são utilizados.
  3. Encha o depósito meio cheio com água destilada.
  4. Os embriões são recolhidos durante 1 hora, colocando o recipiente de recolha na gaiola, que é subsequentemente cobertopor um pano escuro para estimular a oviposição.
  5. Embriões colhidos são permitidos para amadurecer a desejados estádios de desenvolvimento fora da gaiola em condições de criação padrão (85% de humidade relativa / 26 ° C). Maturação de embriões a vários estágios pode ser correlacionada com o tempo (horas pós-oviposição) seguindo o curso de tempo aproximado de desenvolvimento de eventos embrionárias descritos (Tabela 2). Esta tabela resume os principais eventos no desenvolvimento embrionário de Aedes aegypti, relatado por Raminani e Cupp, 9,10 Anopheles gambiae descrito primeiro por Ivanova-Kazas 11 e mais elaborada por Goltsev e colegas, 12,13 e Culex quinquefasciatus, relatado por Davis 14. A cursos tempo descritos destinam-se a servir como estimativas iniciais, em vez de pontos de tempo absoluto, para a coleta de embriões em estágios particulares do desenvolvimento.

2. Fixação Dechorionation, e EndochoriRompimento em

  1. Transferência de embriões a partir do recipiente de recolha para um tubo de captura Saatilene malha dechorionation (Figura 3).
    Para embriões Aedes, colocar o tubo de captura para um copo de que é preenchido com água destilada suficiente para que o volume do tubo de captura é um meio-cheio. Uma escova artístico pode ser usado para desalojar os embriões a partir da malha Saatilene e transferi-los para a água-tubo cheio de captura.
    Para embriões Anopheles, retire a malha Saatilene do recipiente de recolha e dobrar a malha com cuidado para formar um funil. Segurando o funil de malha com uma mão, utilizar a outra mão para dispensar água destilada através de uma garrafa de esguicho de polietileno ao longo dos lados do funil para lavar os embriões para dentro do tubo de captura. Este método pode ser aplicado a embriões de Anopheles porque lhes falta a substância adesiva presente na superfície de embriões Aedes, que permite que os ovos para furar a substratos postura dos ovos.
  2. Prepare 40 ml de solução de dechorionation (1 volume de hipoclorito de sódio 5,25%: 3 volumes de água destilada). Verter a solução em uma placa de Petri 100 mm.
  3. Prepara-se uma proveta de 100 ml contendo 50 ml de água destilada e postas de lado. O passo dechorionation é o tratamento de hipoclorito sensíveis ao tempo e imediatamente a seguir os embriões de sódio será imerso nesta água, para diluir a solução dechorionation.
  4. Dechorionate os embriões no tubo de malha captura por colocação do tubo numa placa de Petri com solução dechorionation. Usar uma descartável polietileno transferência pipeta ou pipeta de Pasteur a lavar os embriões, enquanto agitando o frasco de captura de modo que os embriões permanecer submersa e agitada na solução dechorionation.
    Um máximo de 35 seg é necessário para dechorionation de embriões Aedes, enquanto que 75 seg é suficiente para Anopheles e embriões Culex (Tabela 3). Dechorionation é um dos passos mais sensíveis do protocol e extensão ao longo do tratamento hipoclorito de sódio, especificamente para embriões Aedes vai evitar rachaduras próprias do córion.
  5. Imediatamente mergulhe o frasco de captura no copo com água.
  6. Lavar a solução dechorionation remanescente a partir dos embriões através da remoção do tubo de captura do copo cheio de água e de lavagem para fora das paredes interior e exterior do tubo de captura com água destilada a partir de uma garrafa de esguicho ou torneira equipado com um tubo.
  7. Dechorionation pode ser verificada pela visualização dos embriões com um microscópio de dissecação com uma ampliação de baixa. Embriões Dechorionated Aedes falta a exocório compensação-like e apenas a superfície lisa e polida da endochorion preto é aparente para os embriões dechorionated Anopheles, os flutuadores exochorionic e estruturas de cristas estão ausentes (Figura 4).
  8. Usando uma escova artística, transferir os embriões dechorionated num frasco de cintilação contendo 5 ml de água destilada water (Figura 5-1). Se as amostras múltiplas estão a ser preparadas, manter os tubos de capturas em água para evitar a dessecação dos embriões.
  9. Deixe os embriões resolver para a base do frasco de cintilação e remover tanta água a partir do frasco quanto possível.
  10. Adicionar 5 ml de heptano para dentro do frasco de cintilação (Figura 5-2). Remover qualquer água residual que permanece no frasco de cintilação.
  11. Adicionar na cintilação ml frasco de 5 recém-preparado solução de fixação embrião (Tabela 1).
  12. Corrigir os embriões durante 30 min com inversão de modo que as fases orgânica e aquosa misturar completamente, mas não vigorosamente.
  13. Remover a solução de fixação usando uma pipeta de Pasteur de vidro, tendo cuidado para não perturbar a interfase, que contém os embriões (Figura 5-3).
  14. Lavar a solução residual de fixação através do enchimento do frasco de cintilação com o máximo de água destilada quanto possível. Inverta o frasco de 5 vezes eem seguida, remover toda a água destilada.
  15. Encher o frasco de cintilação com 20 ml de água destilada e misturar invertendo o frasco durante 30 min.
  16. Remover toda a água a partir do frasco de cintilação.
  17. Adicionar o suficiente água destilada em ebulição para dentro do frasco de cintilação de modo que a fase inorgânica heptano atinge o topo do frasco.
  18. Incubar por 30 segundos e, em seguida, remover toda a água fervente.
  19. Adicionar água gelada destilada até que a fase inorgânica atinge o topo do frasco. Incubar o frasco em gelo durante 10 min.
  20. Remover primeiro as fases aquosa e, em seguida, orgânicos. O heptano aparecerá opaco neste passo (Figura 5-4).
  21. Adicionar 5 ml de heptano novo para dentro do frasco. Retire toda a água restante do frasco.
  22. Adicionar 5 ml de metanol para dentro do frasco. Agitar o frasco 1-2 vezes energicamente, sem agitação (Figura 6). Se as fases inorgânicas metanol heptano e orgânicos são agitados vigorosamente os embriões wivai ser destruído durante a ruptura endochorion. É importante mencionar que observamos variação na eficiência de ruptura endochorion para diferentes estirpes de embriões Aedes aegypti.
  23. Incubar a temperatura ambiente durante 15-20 min. Durante esta fase, as fases se tornará turva devido à liberação de componentes gema (Figura 5-5).
  24. Remover ambas as fases orgânicas e inorgânicas e lavar com metanol 3 vezes para remover todo o heptano residual.
  25. Os embriões podem ser armazenados em metanol a -20 ° C até vários meses.

3. Peeling

  1. Coloque um pedaço de fita de dupla face toupee no centro de uma placa de Petri de 3 cm. Fita Toupee é utilizado porque o adesivo é estável na presença de metanol e etanol.
  2. Usando um furo grande (aproximadamente 3 mm de diâmetro) 200 ponta Pipetar, embriões de transferência a partir do metanol para a fita dupla face.
  3. Permitir 1-2 min para os embriões para resolver e adhere para a superfície da fita.
  4. Metanol em excesso, decantar e permitir que a superfície secar um pouco para 1-2 min.
  5. Adicionar 4 ml de 95% (190 proof) etanol em placa de Petri.
  6. Pipetar 600 de água destilada para o etanol e agite para misturar. A fita vai se tornar opaco na cor. Adição de água destilada fará com que a fita para se tornar pegajosa e imobilizar os embriões durante descamação. Este passo pode ser omitido se desejado.
  7. Usar uma agulha de calibre 27,5 ligado a um tambor de seringa de 1 ml para retirar a endochorion cracking (Figura 7). Depois de libertar o embrião branco a partir de os restos endochorion negras, transferir os embriões a partir da fita para o reservatório de etanol da placa de Petri com um pincel de ponta fina artístico. Usando um 3-milímetros ponta de pipeta furo, transferir os embriões em um Ambion tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 ul de etanol 200 de prova.
    Os embriões pelados não deve permanecer na fita para um período prolongado de tempo, porque eles podem aderir porpermanentemente para a fita.
  8. Realizar 2-3 lavagens rápidas com 100% (200 proof) de etanol e armazenar os embriões em etanol meticuloso a -20 ° C. Embriões pelados pode ser armazenada a -20 ° C durante alguns meses, sem afectar a morfologia ou o sinal de hibridação subsequente.

4. Esclarecimento da Gema

  1. Realizar uma lavagem rápida com 200 etanol prova. Etanol meticuloso deve ser utilizado para todos os passos de lavagem subsequentes, e para a preparação da solução de clarificação P-xileno gema.
  2. Realizar uma lavagem de etanol, 5 min com nutação.
  3. Incubar em P-xylene/ethanol (9:1) à temperatura ambiente durante 1-1,5 h com nutação. O passo xileno permite clarificação da massa de gema para melhorar a relação sinal-ruído.
  4. Remover a solução de xileno-etanol e executar duas lavagens rápidas com etanol.
  5. Realizar uma lavagem de etanol, 5 min com nutação.
  6. Executar duas lavagens rápidas com metanol, seguido por uma lavagem de metanol, 5 min comnutação.
  7. Equilibrar em solução de 4% de formaldeído fixação por lavagem uma vez com metanol / formaldeído solução de fixação (1:1).

5. Fixação e hibridação in situ

Fixação e hibridação in situ em procedimentos são idênticos aos descritos no protocolo Secção A.

C. Representante Resultados

A hibridação in situ no protocolo aqui descrito, resulta em padrões de coloração de cor que indicam a presença e localização do mRNA alvo. É importante salientar que os níveis relativos de abundância transcrição não pode ser determinada por hibridação in situ. Resultados de hibridação são dependentes da sonda de ARNm específico utilizado para o processo de hibridação, a abundância do mRNA alvo no tecido hibridizada, bem como a concentração da sonda e da temperatura de hibridação. Comparação dos tecidos hibridado com anti-sentido e sondas de mRNA correspondentes sentido tornar possível a interpretação precisa de padrões de coloração.

Hibridização in situ de toda montagem glândulas salivares de Aedes aegypti do sexo feminino com sondas de mRNA que amylase1 alvo (AAEL006719), D7s2 (AAEL006423), e D7L2 (AAEL006424) indicam acúmulo desses transcritos em proximal-lateral, distal-lateral e distal- lobos laterais / medial, respectivamente (Figura 8). 1 inteiro de montagem-ovários de três espécies de mosquitos foram hibridadas com sondas de mRNA que visam especificamente as transcrições respectivas ortólogos de Oskar (Figura 9). 7,8 Hibridação in situ de todo-de montagem embriões de Ae. aegypti, An. gambiae e Cx. quinquefasciatus foi realizada utilizando sondas de RNA anti-sentido de segmentação dos transcritos de mosquito respectivos Oskar ortólogos (Figura 10). 7,8

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Figura 1. Diagrama esquemático de pós-hibridação montagem set-up.

A Figura 2
Figura 2. Preparação de Kimwipe mop usado durante a amostra de montagem. Um tecido Kimwipe é torcido fortemente para produzir um esfregão de ponta fina para absorver o excesso de meio de montagem das amostras e slides.

A Figura 3
Figura 3. Esquemática de Saatilene tubo de captura dechorionation mesh. A) A parte inferior de um tubo cónico de 50 ml de poliestireno é cortado para se obter um tubo oco de 4,5 cm de comprimento, aberto em ambas as extremidades. Uma abertura circular é cortada para fora da tampa do tubo cónico para permitir líquido a ser lavado por meio de uma peça de 6,5 centímetros quadrados de malha de 2 Saatilene. Os 330 fios por polegada, 34 micron diâmetro tela de malha fio mantém os embriões de mosquitos. B Ass)embled pegar tubo.

A Figura 4
Figura 4. Aedes aegypti e ovos Anopheles gambiae, antes e depois dechorionation. A) ovos Aedes aegypti antes dechorionation. O exocório malha, como se encontra acima da endochorion preto e dá um ovo de aparência texturizada (alargamento de inserção). Após a remoção do exocório, apenas endochorion o liso e polido permanece (alargamento B e inserção). C) Os ovos de Anopheles gambiae antes dechorionation. Exocório estruturas, tais como carros alegóricos são visíveis (setas). D) A superfície lisa e polida da endochorion é visível após dechorionation. Barra = 100 mm.

A Figura 5
Figura 5. Uma série de passos seqüenciais para fixação e interrupção endochorion de Ae. ovos aegypti. A) vista Slanted-frontale B) vista-lateral de frascos de cintilação contendo Ae. ovos aegypti durante as etapas seqüenciais de fixação e interrupção endochorion. 1) Os embriões em água destilada. 2) Os embriões flutuar na interfase entre a fase superior de heptano ea fase aquosa inferior. 3) Após a fixação dos embriões encaixam em uma massa redonda. Embriões permanecem na interfase entre as fases solução de heptano e fixador. 4) Após o tratamento com água em ebulição e incubação em gelo, a fase de heptano torna-se ligeiramente opaca. 5) Os embriões com endochorions rompidas são mostrados na interfase entre uma fase opaca heptano e metanol fase transparente.

A Figura 6
Figura 6. Interrupção Endochorion de Ae fixo. ovos aegypti. A) Imediatamente após agitação enérgica de heptano e de fases de metanol, a formação de bolhas e da ruptura do endochorion pode ser visualizada. B) following cinco minutos de incubação, à temperatura ambiente.

A Figura 7
Figura 7. Os ovos de mosquitos após rompimento e remoção do endochorion. Ovos de Ae. aegypti (a), uma. gambiae (B) e Cx. quinquefasciatus fixação seguinte (C) e perturbação do endochorion. Brancas translúcidas, embriões pode ser visto dentro do endochorion rachado. Após a remoção do endochorion, os embriões translúcidas de Ae. aegypti (D), An. gambiae (E) e Cx. quinquefasciatus (F) são claramente visíveis. Barra = 100 mm.

A Figura 8
Figura 8. Hibridizações in situ de três genes expressos em lobos diferentes de todo o monte, feminino Ae. glândulas salivares aegypti. Coloração é indicativo de localização e acumulação de amylase1 (AAE L006719) (A), D7s2 (AAEL006423) (B) e D7L2 (AAEL006424) (B). Barra = 100 mm.

A Figura 9
Figura 9. Hibridização in situ para mosquito Oskar sondas antisense RNA para oócitos toda montagem de mosquitos e células de enfermagem. Oócitos no estágio IV (OOC) dissecada a partir de ovários de uma. gambiae (A), Ae. aegypti (B) e Cx. quinquefasciatus (C) e hibridado com sondas de RNA alvo mRNAs Oskar respectivos de mosquitos. Folículos primários são orientados com anterior do lado esquerdo. Coloração no pólo posterior (seta azul) indicam acumulado mRNAs Oskar. Secundário (f2) e terciário (F3) folículos são mostrados e coloração (preto seta) indicam acúmulo de mRNA oskar no citoplasma da célula enfermeira (NCC). A coloração é excluído do núcleo das células enfermeira (NCN). Barra = 50 uM.

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Figura 10. Hibridização in situ para mosquito Oskar sondas antisense RNA para embriões toda montagem do mosquito. Os embriões são orientados com anterior do lado esquerdo. Embriões blastoderme celulares palco de um. gambiae (A) e Cx. quinquefasciatus (C) são hibridizados com respectivas espécies de mosquito sondas específicas Oskar RNA. B) A fase Ae sincicial blastoderme. embrião aegypti hibridado com sondas de RNA alvo Ae. aegypti transcrição oskar. Coloração é evidente nas células pólo posterior de todos os embriões, indicando a localização e acumulação de mRNA oskar mosquito nestas células. Barra = 50 uM.

Tabela 1
Tabela 1. Soluções e tampões para formaldeído de fixação em electroforese em gel, e hibridação in situ.

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Tabela 2. Eventos Desenvolvimento e observações morfológicas correspondentes aos estágios consecutivos durante a embriogênese do mosquito.

Tabela 3
Tabela 3. Resumo das principais diferenças em pré-hibridação passos para diversos tipos de tecidos.

Discussion

A hibridização in situ protocolo de coloração e colorimétricas apresentadas aqui para tecidos toda montagem de mosquitos e de embriões é uma técnica útil para a localização de transcritos dentro dos órgãos e tipos específicos de células. Esses procedimentos são um avanço em relação nossos métodos reportados anteriormente, tanto na racionalização etapas de lavagem e proporcionando amplos detalhes técnicos adicionais e fontes de reagentes.

Na nossa experiência, a detecção colorimétrica de sinais de hibridação é superior em sensibilidade e clareza de sinal de hibridação em comparação com os regimes de fluorescência de detecção baseados em. Além disso detecção colorimétrica contorna problemas associados com a discriminação do sinal em embriões, que são inerentemente auto-fluorescente. Limitações na detecção de sinais de hibridação ocorrer, quando baixa abundância transcrições são alvejados e coloração de fundo é evidente. O aumento da temperatura de hibridação a 65 ° C, foi encontrada a reduzir para trássolo sinais de hibridação, mas não é um substituto sugerido para a concepção de sondas único alvo-específicas de RNA.

Este protocolo tem sido usado para realizar a hibridação in situ de toda montagem glândulas salivares de Aedes aegypti, e os ovários e embriões de Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus. Este método também é aplicável a outros tecidos de mosquito, e presumivelmente aqueles de outros insectos. Além disso, nós compilamos para as diretrizes da primeira vez comparativas para a realização do desenvolvimento embrionário em três mosquitos vetores, Ae. aegypti, An. gambiae e Cx. fatigans. Observações foram relatadas para as estirpes específicas destas três espécies, em condições de criação discretos. É importante notar que o curso de tempo de desenvolvimento podem variar para diferentes estirpes de espécies de mosquitos e sob condições de criação diferentes. Hibridizações em suplemento situ em curso esforços para analisar as transcriptomas de mosquitos e outros artrópodes, e pode fornecer uma melhor imagem da regulação da expressão genética nestes organismos.

Disclosures

Os autores não têm divulgações.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Marika Walters para o conselho de hibridização desenvolvimento de métodos in situ de tecidos moles e Goltsev Yury para discussão de protocolos para a hibridização in situ de embriões Anopheles gambiae, que foram posteriormente adaptados e modificados para desenvolver o protocolo descrito aqui para hibridização in situ de Aedes e Culex embriões. Reconhecemos também recomendações úteis dadas por Adam Paré e Kosman David. Agradecemos Osvaldo Marinotti para a discussão científica e editar o texto do protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Ambion AM9261
1M Tris-HCl Ambion AM9855G pH8.0
10X PBS Ambion AM9625
20X SSC Ambion AM9763
1.5 ml microfuge tubes Ambion AM12400 Less opaque than standard tubes; aids in visualizing samples
Deionized formamide Ambion AM9342 Storage at 4 °C
DEPC water Ambion AM9932
Proteinase K Ambion AM2546
5.25% Sodium hypochlorite Austin’s A-1 Brand
T3 RNA Polymerase-Plus Ambion AM2733 Storage at -20 °C
T7 RNA Polymerase Ambion AM2082 Storage at -20 °C
95% Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Fisherbrand disposable polyethylene transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
37% Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
HPLC-grade methanol Fisher Scientific A452-1
Magnesium chloride Fisher Scientific M87-500
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-542A 18 x18 mm
N-Heptane Fisher Scientific H350-1
P-xylene Fisher Scientific O5082-500
Pyrex 9-well Spot Plate Fisher Scientific 13-748B 100x85 mm
Sodium chloride Fisher Scientific AC32730-0025
Sodium hydroxide Fisher Scientific SS255-1
Superfrost/Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 25x75x1.0 mm
Davlyn Red Clear-liner Toupee tape Hair Direct RED-75R12 Poly/Skin base material 0.75 in x 12 yd tape roll
TOPOTA Cloning Kit for Sequening with One Shot Top10 chemically-competent E. coli Invitrogen K457501 K457540 20 reactions
40 reactions
Sonicated salmon sperm DNA Invitrogen 15632-011 Storage at -20 °C
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments Roche Applied Science 1093274 Storage at 4 °C
DIG RNA labeling mix Roche Applied Science 1277073 Storage at -20 °C
NBT/BCIP stock solution Roche Applied Science 1681451 Storage at 4 °C
Western Blocking Reagent Roche Applied Science 11921673001 Storage at 4 °C
Saatilene Hitech polyester mesh (330.130) Saati Print 330.34 UO PW 330 threads/inch, 34 micron thread diameter, orange color
Glycerol Sigma G6279-1 70% in PBT
Heparin sodium salt Sigma H3393
Tween 20 Sigma P1379-500
37% Formaldehyde Ted Pella 18508 10 ml aliquots in amber ampoules
16 oz. Solo Paper containers with lids The Paper Company SOLOKH16AJ8000
Borosilicate glass scintillation vial with unattached screw cap VWR International 66022-128 20 ml case of 500
Sealed Air Bubble wrap celluar cushioning material VWR International 500018-081 10 foot/roll 0.188 inches thick
Chicken serum Whole blood was collected either from the wing vein or by cardiac puncture from a juvenile chicken. Blood was incubated at 37 °C for 1 h until coagulated and then placed on ice for 30 min. The serum was collected and centrifuged at 3000 x g for 10 min. The resulting supernatant (clarified serum) was collected and stored at -20 °C until use.
Table 4. Table of specific reagents and equipment for hybridization in situ.

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References

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Hibridização<em&gt; In situ</em&gt; Das glândulas salivares, ovários e embriões de mosquitos vetores
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Cite this Article

Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes. J. Vis. Exp. (64), e3709, doi:10.3791/3709 (2012).More

Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes. J. Vis. Exp. (64), e3709, doi:10.3791/3709 (2012).

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