Summary
在这里，我们展示了新开发的我•小鼠精子冷冻保存冷冻套件。使用本试剂盒在5个小鼠品系，两个解冻的精子细胞阶段胚胎发育的持续改善。超过1.5年期间，49转基因小鼠精子冷冻保存归档与我•低温套件，后来通过试管婴儿成功收回。
Abstract
转基因和基因敲除技术问世以来，已经创建了新的转基因（GM）株小鼠的数千。许多这些珍贵的动物只存在于活的动物，没有在紧急情况下的备份计划。胚胎冷冻保存，可以提供这样的备份，但费用昂贵，可以是一个漫长的过程，一般需要大量的动物成功。由于小鼠的精子，可以成功地与基本cryoprotective代理（CPA）的18％的棉子糖和3％脱脂牛奶组成冻存发现，精子冷冻保存已经成为一个可以接受的和具有成本效益的过程，归档，分发和回收这些珍贵的菌株。
在这里，我们展示了新开发的我•小鼠精子冷冻保存冷冻套件。从五个常用株近交系小鼠的精子被冻结使用这种试剂盒，然后恢复。精子活力更高的保护率（>看到这种试剂盒在5近交系小鼠品系冷冻精子60％）和快速进步的活力（> 45％）相比，控制（基本注册会计师）。一直在研究所有5个鼠标株两细胞阶段胚胎试管婴儿后恢复精子的发展进行了改进。超过1.5年期，49通用鼠标线精子冷冻保存归档与我•低温套件，后来通过体外受精收回。
Protocol
1。小鼠精子冷冻保存
- 对于每个冻存线，准备开始之前以下。
- 1以及一个240升的试剂盒注册会计师4以及菜
- 15精子冷冻保存如下吸管
- 将0.25毫升吸管1毫升注射器，用注射器最接近的棉塞。在每个稻草，装入8厘米的试管培养基（约160μL），那么1厘米的空气。标签与行的名称被保留的救命稻草。
- 2号法律公告应该是15厘米深的泡沫箱。关闭盖子。
- 安乐死从被冷冻保存的每行2个雄性小鼠。小鼠应在10和60周龄之间。取出两个尾鳍从每个鼠标输精管附睾。
- 放入先前准备好的含注册会计师以及4盘（步骤1.1）的附睾。
- 请在每个附睾5-7纵向切割，轻轻地挤压每个输精管推精子。
- 动摇手工注册会计师和附睾的混合物在室温下轻轻地为3-5分钟。这将使精子游出。
- 使用先前准备好的稻草，吸精子悬液5毫米（约10μL），然后1厘米的空气。
- 重复这个过程中，共15个秸秆。装入密封最好的精子存活10分钟内的秸秆。
- 热封的秸秆双方认真。第一次与精子列放置在冷冻罐的吸管。
- 将1毫升吸管罐来延长处理套件的一部分提供。在泡沫箱，通过盖子上的孔放置在液氮罐。允许罐浮在LN 2，垂直为10分钟。
- 沉浸在液氮罐。精子冷冻保存，可以转移到长期的液氮存储。
- 不应该被用于罐下一行，直到它被加热到室温。
2。小鼠超数排卵
- 一般来说，年轻的雌性小鼠的精子捐献者使用相同的背景。
- 小鼠应〜12克（年龄3-4周）。
- 执行与腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）5-10 IU。
- 等待46-48小时。
- 执行与腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）5-10 IU。
- 收获的卵母细胞14-16 h后注射HCG如下所述。
3。小鼠精子复苏和试管婴儿
- 试管婴儿之前，为每个要解冻的秸秆，准备以下至少一小时在37℃CO 2培养箱平衡。
- 精子孵化盘：35毫米培养皿中，用90μL的精子处理液油覆盖（STM）的下降。
- 切割菜：对于卵母细胞的收集最多10秒uperovulated女性，一个35毫米的Petri碟3毫升试管培养基。
- 试管婴儿：对于每个组超排5位女性的试管婴儿，试管培养基500μL（如果您使用的是10超排的女性，例如，你将需要2井。）4以及菜
- 洗衣机洗涤每孔4以及用于体外受精菜盘：3毫升的钾单纯优化培养基（KSOM）一个35毫米的培养皿
- 培养皿：一个35毫米的Petri涵盖了从每个试管婴儿菜以及胚胎培养油的KSOM培养基50μL滴的菜。
- 从2号法律公告中取出的秸秆和地方在37℃水浴2-3分钟。
- 从水浴中取出的秸秆和擦拭以除去多余的水分。请首次下调接近最近的棉塞的第一个空气柱。削减在试管培养基稻草，仍然会出现精子列前可见一个空气柱。
- 然后切的秸秆年底在Second空气柱，小心，以避免削减精子列。在一个45度角的切割 - 这将使它更容易吸出精子。
- 从末端的秸秆用200μL移液器吸精子悬液。
- 广场中心的STM下降精子悬液，在37℃，5％的CO 2培养箱中孵育45-60分钟的菜。
- 在精子孵育，解剖切割菜的超排女性输卵管。使用30克针或镊子撕每个输卵管的卵丘卵母细胞复合体（卵母细胞）释放。避免脏媒体额外的洗涤步骤，使得在体外受精中的脂肪和血液。
- 一旦所有的输卵管已被撕裂，转让的卵母细胞，女5例，每个试管婴儿井。通过超数排卵产生的卵母细胞的数量是非常应变依赖。
- 收集从周边的STM下降10-15μL精子和受精之一试管婴儿约14-16小时后绒毛膜促性腺激素注射ection。每口井使用重复施肥。最后精子浓度将约1万个/毫升。
- 共培养精子和卵母细胞在37℃5％ 二氧化碳培养箱中培养4-6小时。
- 洗净的胚胎，KSOM一个最低的2倍和文化发展的KSOM滴在37℃5％二氧化碳培养箱。
- 两种细胞阶段的胚胎，培养过夜后使用总卵母细胞体外受精率计算。
4。代表性的成果
从5查尔斯河小鼠近交系的精子被冻结。保护比率的计算方法，新鲜精子评估值除以冷冻精子的评估值。精子活力的保护率分别为60.2％，81.3％，78.6％，66.5％，61.0％，129S2/SvPasCrl，FVB / NCrl，DBA/2NCrl和BALB / cAnNCrl C57BL/6NCrl，分别。快速进展蠕动的保护率分别为47.3％，69.4％，57.0％，52.8％，54.1％，129S2/SvPas C57BL/6NCrl CRL，FVB / NCrl，DBA/2NCrl，和BALB / cAnNCrl，分别（图1）。
冻融精子体外受精率分别为55.7％，26.4％，87.3％，87.8％和26.2％C57BL/6NCrl，129S2/SvPasCrl，FVB / NCrl DBA/2NCrl，和BALB / cAnNCrl，分别为（图2） 。
超过1.5年期间，49通用鼠标线是由精子冷冻保存归档。这些生产线后来被成功回收（定义活幼仔出生）试管婴儿在女4株（C57BL / 6，BALB / C中，DBA / 1和129Sv）（图3）。
图1的小鼠的精子活力和快速运动力的保护率。
图2。冻融小鼠精子体外受精
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图3。冻融在转基因小鼠的精子在体外授精
Discussion
自1990年以来，基本精子冷冻协议，使用18％的棉子糖和3％脱脂牛奶已被证明是可靠的小鼠多株和大量的鼠标线已冻存1,2,3,4,5,6,7。已与冰的形成8,9和活性氧10的损害精子细胞在冻融过程中的主要成因。补充自由基清除剂，如氨基酸，还原剂，如monothioglycerol在冻结介质，进行了调查，证明大幅提高冻融精子包括在近交系C57BL / 6 11,6的体外受精率。
在本议定书中，我们开发了一个新的I•冷冻试剂盒小鼠精子冷冻保存，通过优化与市售的抗氧化剂和冰阻滞剂的基本注册会计师和修改精子冷冻和体外受精过程。精子活力的保护率（> 60％）和快速进步的活力（> 45％），分别从5个近交系小鼠株，与我•低温套件冷冻精子。的2 -细胞期胚胎解冻精子在5小鼠近交系的发展速度明显提高相比，与注册会计师的基本 11,6 。
用户在使用试剂盒，由冷冻精子的每一行从2男性集中的精子悬液。只冻结15吸管的过程是快速，简便，占地少短期或长期存储的存储空间。大多数时候，鼠标线可以恢复解冻只有1或2个秸秆。
Disclosures
作者查尔斯河，该试剂盒的制造商的员工。
Acknowledgments
这里介绍的研究得到了查尔斯河。作者是基因工程模型和服务组，动物保健和激素注射胚胎的工作人员非常感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
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