Summary
Her vil vi demonstrere den nyudviklede I • Cryo-kit til mus sæd nedfrysning. To-celle stadie embryo udvikling med frossen-optøet sæd blev forbedret konsekvent i 5 mus stammer med brugen af dette kit. Over en 1,5 årig periode, var 49 genetisk modificerede mus linjer arkiveres af sædceller nedfrysning med I • Cryo kit og senere succes inddrives ved IVF.
Abstract
Tusindvis af nye genetisk modificerede (GM) stammer af mus er blevet skabt siden indførelsen af transgenese og knockout-teknologier. Mange af disse værdifulde dyr eksisterer kun som levende dyr, uden backup-plan i tilfælde af en nødsituation. Kryopræservering af embryoner kan levere denne backup, men det er dyrt, kan være en langvarig procedure, og generelt kræver et stort antal dyr for succes. Siden opdagelsen af, at musen sædceller med held kan kryopræserveres med en grundlæggende cryoprotective agent (CPA) bestående af 18% raffinose og 3% skummetmælk, er sædceller kryopræservering blevet en acceptabel og omkostningseffektiv procedure for arkivering, distribution og nyttiggørelse af disse værdifulde stammer .
Her viser vi et nyudviklet I • Cryo-kit til mus sæd nedfrysning. Sperm fra fem almindeligt anvendte stammer af indavlede mus blev indefrosset med dette kit og steg derefter. Højere beskyttelse nøgletal af sperm motilitet (>60%) og hurtig progressiv motilitet (> 45%) sammenlignet med kontrolgruppen (grundlæggende CPA) blev anset for sæd frosset med dette sæt i 5 indavlede mus stammer. To celle stadie embryo udvikling efter IVF med den gendannede sæd blev forbedret konsekvent i alle 5 mus undersøgte stammer. Over en 1,5 årig periode, var 49 GM musen linjer arkiveres af sædceller nedfrysning med I • Cryo kit og senere inddrevet ved IVF.
Protocol
1. Mus sæd kryopræservering
- For hver linje, der skal kryopræserveres, forberede følgende, før du begynder.
- 1 boringen af en 4-godt fad med 240 liter kit CPA
- 15 sædceller kryopræservering strå som følger
- Tilslut 0,25 ml strå til 1 ml sprøjter med bomuld stik tættest på sprøjten. I hvert strå, last 8 cm (ca. 160 μl) af IVF medium, derefter 1 cm luft. Mærk sugerør med navnet på den linje, der skal bevares.
- LN 2 skal være 15 cm dybt i skum kassen. Luk låget.
- Aflive 2 hanner mus fra hver linje, der skal kryopræserveres. Mus skal være mellem 10 og 60 uger gammel. Fjern de to caudale bitestikler sammen med vas deferens fra hver mus.
- Placer bitestikler i tidligere udarbejdede CPA-holdige godt af et 4-godt fad (trin 1,1).
- Gør 5-7 langsgående snit i hver bitestiklen og forsigtigtKlem hver sædlederen til at skubbe sæd ud.
- Ryst CPA og bitestiklen blanding med hånden forsigtigt ved stuetemperatur i 3-5 minutter. Dette vil gøre det muligt sædceller til at svømme ud.
- Brug af tidligere udarbejdede halm, aspireres 5 mm (ca. 10 μl) af sædceller suspension og derefter 1 cm luft.
- Gentag denne proces med op til i alt 15 sugerør. Load og forsegle sugerør inden for 10 minutter for bedste sædceller overlevelse.
- Varmeforseglet begge sider af halm omhyggeligt. Sæt sugerør i indefrysning canister med sæden kolonnen først.
- Sæt 1 ml pipette leveres som en del af det kit til at beholderen til at forlænge håndtaget. Placer beholderen i LN 2 i skummet kassen gennem hullet i låget. Lad beholderen til at flyde lodret i LN 2 for 10 minutter.
- Fordyb beholderen i LN2. Den sæd er nu kryopræserveres og kan flyttes til langsigtet LN 2-lagring.
- Beholderen bør ikke anvendes tilden næste linje, indtil det er varmet op til stuetemperatur.
2. Mus superovulation
- Generelt bruger unge hunmus af den samme baggrund som sæddonorer.
- Mus skal være ~ 12 g (3-4 uger).
- Udfør en intraperitoneal injektion med 5-10 IE Gravide mare serum gonadotropin (PMSG).
- Vent 46-48 timer.
- Udfør en intraperitoneal injektion med 5-10 IE humant choriongonadotropin (hCG).
- Harvest oocyter 14-16 timer efter hCG injektion som beskrevet nedenfor.
3. Mus sæd nyttiggørelse og IVF
- Før IVF, for hver halm at blive optøet straks forberede følgende og tempereres i mindst en time i et 37 ° C CO 2 inkubator.
- Sperm inkubation fad: En 35 mm petriskål, med en 90 μl dråbe sperm behandling medium (STM) dækket med olie.
- Cutting fad: For ægcelle indsamling fra et maksimum på 10 superovulated kvinder, en 35 mm petriskål med 3 ml IVF-medie.
- IVF godt: For hver gruppe af 5 superovulated hunner til IVF, en brønd i en 4 godt fad med 500 μl af IVF-mediet (hvis du bruger 10 superovulated hunner, for eksempel, vil du brug for 2 brønde...)
- Vask fad: En 35 mm petriskål med 3 ml af kalium simplex optimeret medium (KSOM) til vask hver brønd af de 4-såvel IVF brugt fad
- Kultur fad: En 35 mm petriskål med 50 μl dråber KSOM medium dækket med olie til embryo kultur fra hvert hul i IVF fad.
- Tag et sugerør fra LN 2 og sted i en 37 ° C vandbad i 2-3 minutter.
- Fjern halmen fra vandbadet, og tør at fjerne overskydende vand. Gør det første snit tæt på den første luft kolonne nærmest bomuld stikket. Skær halm i IVF-medie vil der stadig være en luft spalte synlig før sædcellerne kolonne.
- Derefter skæres i slutningen af halm i Second luft kolonne, være omhyggelig med at undgå at skære sæden kolonne. Skær med en 45 vinkel - dette vil gøre det meget lettere at aspirere sæden.
- Aspirer sæden suspension fra den distale ende af halm med en 200 μl pipettor.
- Placer sæd suspension i midten af STM drop og inkuber fadet i 45-60 minutter i et 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- I løbet af sæd inkubation, dissekere det Æggelederne af superovulated hunner ind i skærende fad. Brug en 30 g kanyle eller pincet til at rive hver æggelederen, slippe cumulus-ægget komplekser (p-piller). Undgå fedt og blod i IVF-medie som beskidt medier gør for ekstra vask trin.
- Når alle Æggelederne er blevet revet, overførsel af p-piller fra 5 hunner til hver IVF brønde. Antallet af p-piller produceret af superovulation er meget pres afhængig.
- Saml 10-15 μl af sæd fra periferien af STM drop og befrugte en IVF vel ca 14-16 timer efter hCG injfdeling. Gentag befrugtning for brugte hver brønd. Endelige koncentration af sædceller vil være omkring 1 mio / ml.
- Coculture sæd og oocytter i 4-6 timer i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Vask embryoner med KSOM mindst 2 gange og kultur i KSOM dråber for udvikling i et 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- IVF sats blev beregnet som to celler trin embryoner ud af det samlede æg anvendes efter natten kultur.
4. Repræsentative resultater
Sperm fra 5 Charles River musen indavlede stammer var frosset. Beskyttelse nøgletal er beregnet ved at dividere frossen sæd vurdering værdier ved frisk sæd vurdering værdier. Beskyttelse nøgletal af sperm motilitet var 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% for C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl og BALB / cAnNCrl, hhv. Beskyttelse nøgletal for hurtigt fremadskridende motilitet var 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% i C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl og BALB / cAnNCrl, henholdsvis (figur 1).
IVF-satser med frosne optøet sæd var 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% og 26,2% i C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl og BALB / cAnNCrl, henholdsvis (Fig 2) .
Over en 1,5 årig periode, var 49 GM musen linjer arkiveres af sædceller nedfrysning. Disse linjer blev senere succes inddrives (som defineret af levendefødte unger) ved IVF i 4 kvindelige stammer (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 og 129Sv) (Figur 3).
Figur 1. Beskyttelse nøgletal for spermiemotilitet og hurtigt fremadskridende motilitet i Mus
Figur 2. In vitro-befrugtning med frossen-optøet Sperm i Mus
3713fig3.jpg "/>
Figur 3. In vitro-befrugtning med frossen-optøet sæd i GM Mus
Discussion
Siden 1990 har den grundlæggende sædceller fryse-protokollen ved hjælp af 18% raffinose og 3% skummetmælk blevet bevist pålidelig i mange stammer af mus og et stort antal mus linjer er blevet kryopræserveres 1,2,3,4,5,6,7. De hyppigste årsager til skader på sædceller i løbet af nedfrysning og optøning processen har været forbundet med isdannelse 8,9 og reaktive ilt arter 10. Tilskud af frie radikaler skraldemanden, som aminosyrer og reducerende stoffer, såsom monothioglycerol, i indefrysning medium blev undersøgt og bevist at øge IVF sats med frossen-optøet sæd i indavlede stammer herunder C57BL / 6 11,6.
I den foreliggende protokol, udviklede vi en ny I • Cryo-kit til musen sæd nedfrysning ved at optimere de grundlæggende CPA med kommercielt tilgængelige antioxidanter og is-blokkere, og ved at ændre sæd nedfrysning og IVF procedure. Beskyttelse nøgletal af sperm motilitet(> 60%) og hurtig progressiv motilitet (> 45%) sås for sæd fra fem indavlede mus stammer frosset med I • Cryo kit. Den 2-celle stadie embryo udvikling sats med frossen-optøet sæd i 5 mus indavlede stammer blev markant forbedret i forhold til, at med de grundlæggende CPA 11,6.
Ved brug af kit, skaber brugeren en koncentreret sæd suspension ved at fryse sæd fra 2 hanner for hver linje. Ved kun at fryse 15 sugerør processen er hurtigt, nemt og optager mindre lagerplads i kortere eller længere tids opbevaring. De fleste gange, kan musen linjer kan inddrives ved optøning kun 1 eller 2 sugerør.
Disclosures
Forfatterne er ansat i Charles River, skaberen af dette kit.
Acknowledgments
Forskningen præsenteres her blev støttet af Charles River. Forfatterne er mest taknemmelig for, at gensplejsede Modeller og Service gruppen og embryologi personale til pasning af dyr og hormon injektion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
