Summary
यहाँ हम नव विकसित माउस शुक्राणु cryopreservation के लिए मैं • क्रायो किट प्रदर्शित करता है. दो सेल जमी-thawed शुक्राणु के साथ मंच भ्रूण विकास लगातार इस किट के उपयोग के साथ 5 माउस उपभेदों में सुधार किया गया था. एक 1.5 वर्ष की अवधि के दौरान, 49 आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों शुक्राणु cryopreservation के द्वारा मैं • क्रायो किट के साथ संग्रहीत थे और बाद में सफलतापूर्वक आईवीएफ द्वारा बरामद.
Abstract
नया चूहों आनुवंशिक रूप से संशोधित (जीएम) उपभेदों के हजारों transgenesis और पीटा प्रौद्योगिकियों के आगमन के बाद से बनाया गया है. जीवित पशुओं के रूप में इन मूल्यवान पशुओं के कई केवल आपात स्थिति के मामले में कोई बैकअप योजना के साथ मौजूद हैं. भ्रूण की cryopreservation इस बैकअप प्रदान कर सकते हैं, लेकिन महंगा है, एक लंबी प्रक्रिया हो, कर सकते हैं और आम तौर पर सफलता के लिए पशुओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है. खोज की है कि माउस शुक्राणु सफलतापूर्वक एक बुनियादी cryoprotective एजेंट raffinose 18% और 3% मलाई निकाला दूध के मिलकर (सीपीए) के साथ cryopreserved किया जा सकता है के बाद से, शुक्राणु cryopreservation एक स्वीकार्य और लागत प्रभावी प्रक्रिया के संग्रहण, वितरण और इन मूल्यवान उपभेदों की वसूली के लिए बन गया है .
यहाँ हम एक नव विकसित माउस शुक्राणु cryopreservation के लिए मैं • क्रायो किट प्रदर्शित करता है. जन्मजात चूहों के पांच आमतौर पर इस्तेमाल किया उपभेदों से शुक्राणु इस किट का उपयोग कर जमे हुए थे और तब बरामद. शुक्राणु गतिशीलता के उच्च सुरक्षा अनुपात (>60%) और नियंत्रण (सीपीए बुनियादी) की तुलना में तेजी से प्रगतिशील गतिशीलता (> 45%) 5 जन्मजात माउस उपभेदों में इस किट के साथ जमे हुए शुक्राणु के लिए देखा गया था. बरामद शुक्राणु के साथ दो सेल चरण आईवीएफ के बाद भ्रूण विकास लगातार सभी 5 माउस उपभेदों की जांच में सुधार किया गया था. एक 1.5 वर्ष की अवधि के दौरान, 49 जीएम माउस लाइनों शुक्राणु cryopreservation के द्वारा मैं • क्रायो किट के साथ संग्रहीत थे और बाद में आईवीएफ द्वारा बरामद किया गया.
Protocol
1. माउस शुक्राणु cryopreservation
- प्रत्येक लाइन cryopreserved हो के लिए, शुरुआत से पहले निम्न तैयार करते हैं.
- अच्छी तरह से एक किट सीपीए के 240 एल के साथ एक 4 अच्छी तरह के पकवान
- निम्नानुसार 15 शुक्राणु cryopreservation के तिनके
- 1 सिरिंज के लिए निकटतम कपास प्लग के साथ मिलीलीटर सीरिंज से 0.25 मिलीलीटर तिनके कनेक्ट. प्रत्येक भूसे में, आईवीएफ माध्यम से 8 सेमी (लगभग 160 μl), तो हवा के 1 सेमी लोड. तिनके को संरक्षित किया जा लाइन के नाम के साथ लेबल.
- एल.एन. 2 15 सेमी गहरी फोम बॉक्स में होना चाहिए. ढक्कन बंद करें.
- प्रत्येक cryopreserved हो लाइन से 2 नर चूहों euthanize. चूहे 10 और 60 सप्ताह पुराने के बीच होना चाहिए. प्रत्येक माउस से वीएएस deferens के साथ दो दुम का epididymides निकालें.
- पहले से तैयार 4 अच्छी तरह से एक डिश (1.1 कदम) की अच्छी तरह से सीपीए युक्त में epididymides रखें.
- प्रत्येक अधिवृषण में 5-7 अनुदैर्ध्य कटौती और धीरे सेप्रत्येक वीएएस deferens निचोड़ शुक्राणु बाहर धक्का.
- सीपीए और अधिवृषण मिश्रण को हाथ से धीरे से 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिलाएँ. यह शुक्राणु बाहर तैरने की अनुमति देगा.
- पहले से तैयार भूसे का प्रयोग, शुक्राणु निलंबन के 5 मिमी (लगभग 10 μl) महाप्राण (व्यंजन) और फिर हवा के 1 सेमी.
- कुल 15 तिनके का साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ. लोड और सबसे अच्छा शुक्राणु अस्तित्व के लिए 10 मिनट के भीतर सील तिनके.
- भूसे के दोनों पक्षों को ध्यान मुहर हीट. शुक्राणु स्तंभ के साथ ठंड कनस्तर में तिनके पहले रखें.
- 1 मिलीलीटर कनस्तर संभाल विस्तार करने के लिए किट के भाग के रूप में प्रदान विंदुक संलग्न. ढक्कन में छेद के माध्यम से कनस्तर में 2 एल.एन. फोम बॉक्स में रखें. 2 एल.एन. में खड़ी कनस्तर 10 मिनट के लिए नाव की अनुमति दें.
- LN2 में कनस्तर विसर्जित कर दिया. शुक्राणु अब और cryopreserved दीर्घकालिक एल.एन. 2 भंडारण के लिए ले जाया जा सकता है.
- कनस्तर के लिए नहीं किया जाना चाहिएअगली पंक्ति जब तक कमरे के तापमान पर गरम है.
2. माउस superovulation
- आम तौर पर, शुक्राणु दाताओं के रूप में एक ही पृष्ठभूमि के युवा मादा चूहों का उपयोग करें.
- चूहे ~ 12 ग्राम (उम्र के 3-4 सप्ताह) होना चाहिए.
- गर्भवती घोड़ी सीरम gonadotropin (PMSG) के 5-10 आइयू के साथ एक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन.
- 46-48 घंटे रुको.
- मानव chorionic gonadotropin (एचसीजी) के 5-10 आइयू के साथ एक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन.
- हार्वेस्ट oocytes एचसीजी इंजेक्शन के बाद 14-16 घंटे के रूप में नीचे वर्णित है.
3. माउस शुक्राणु वसूली और आईवीएफ
- आईवीएफ से पहले, प्रत्येक के लिए thawed हो पुआल के लिए, निम्नलिखित को तैयार करने और कम से कम एक घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में संतुलित करना .
- शुक्राणु उपचार (एसटीएम) मध्यम तेल के साथ कवर के एक 90 μl बूंद के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश, शुक्राणु ऊष्मायन पकवान.
- पकवान काटना: 10 एस की एक अधिकतम से oocyte संग्रह के लिएuperovulated महिलाओं, आईवीएफ माध्यम से 3 मिलीलीटर के साथ 35 मिमी पेट्री डिश.
- आईवीएफ अच्छी तरह से: आईवीएफ के लिए 5 superovulated महिलाओं, एक 4 आईवीएफ माध्यम से 500 μl. अगर आप 10 superovulated महिलाओं का उपयोग कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, आप दो कुओं की आवश्यकता होगी के साथ अच्छी तरह से पकवान की अच्छी तरह से एक के प्रत्येक समूह के लिए
- पोटेशियम सिंप्लेक्स के 3 मिलीग्राम अनुकूलित मध्यम (KSOM) के साथ आईवीएफ 4 अच्छी तरह से इस्तेमाल किया पकवान की प्रत्येक अच्छी तरह से धोने के लिए एक 35 मिमी पेट्री डिश: डिश धुलाई
- संस्कृति पकवान: KSOM आईवीएफ डिश के प्रत्येक अच्छी तरह से भ्रूण संस्कृति के लिए तेल के साथ कवर के माध्यम से 50 μl बूंदों के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश.
- 2 एल.एन. से पुआल और 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह निकालें.
- पुआल को पानी के स्नान से निकालें और अतिरिक्त पानी निकालने पोंछ. पहले कपास प्लग पास पहले हवा स्तंभ के करीब काट बनाओ. आईवीएफ माध्यम पुआल है वहाँ अभी भी एक हवा शुक्राणु स्तंभ के पहले दिखाई स्तंभ हो जाएगा कट.
- तो एस में पुआल के अंत में कटौतीecond हवा स्तंभ, शुक्राणु स्तंभ काटने से बचने के सावधान किया जा रहा है. एक 45 कोण पर कट - यह बहुत आसान करने के लिए शुक्राणु महाप्राण (व्यंजन) कर देगा.
- भूसे के बाहर का अंत से एक 200 μl pipettor के साथ शुक्राणु निलंबन महाप्राण (व्यंजन).
- एसटीएम बूंद के केंद्र में शुक्राणु निलंबन प्लेस और 45-60 मिनट के लिए ° 5 सी% सीओ 2 इनक्यूबेटर 37 में पकवान सेते हैं.
- शुक्राणु ऊष्मायन के दौरान, काटने पकवान में superovulated महिलाओं की oviducts टुकड़े करना. 30 ग्राम सुई या संदंश का प्रयोग करें प्रत्येक oviduct आंसू मेघपुंज oocyte परिसरों (COCs) जारी. और आईवीएफ माध्यम के रूप में गंदा मीडिया अतिरिक्त धोने चरणों के लिए बनाता है में वसा रक्त से बचें.
- एक बार जब सभी oviducts फाड़ा गया है, और 5 महिलाओं से प्रत्येक आईवीएफ कुओं COCs हस्तांतरण. COCs superovulation द्वारा उत्पादित की संख्या बहुत निर्भर तनाव है.
- एसटीएम ड्रॉप की परिधि से शुक्राणु की 10-15 μl लीजिए और एक आईवीएफ खाद अच्छी तरह से लगभग 14-16 घंटे एचसीजी inj पोस्टection. प्रत्येक अच्छी तरह से इस्तेमाल के लिए निषेचन दोहराएँ. Final शुक्राणु एकाग्रता लगभग 1 मिलियन मिलीग्राम / हो जाएगा.
- Coculture और एक 37 ° 5 सी% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 4-6 घंटे के लिए शुक्राणु oocytes .
- KSOM 2 बार और संस्कृति के विकास के लिए एक 37 ° 5 सी% सीओ 2 इनक्यूबेटर में KSOM बूंदों में एक न्यूनतम के साथ भ्रूण धो लें .
- आईवीएफ की दर कुल रातोंरात संस्कृति के बाद इस्तेमाल किया oocytes के बाहर दो सेल मंच भ्रूण के रूप में गणना की गई.
4. प्रतिनिधि परिणाम
5 चार्ल्स नदी माउस जन्मजात उपभेदों से शुक्राणु जम गया था. संरक्षण अनुपात ताजा शुक्राणु मूल्यांकन मूल्यों से जमे हुए शुक्राणु मूल्यांकन मूल्यों को विभाजित करके गणना कर रहे हैं. शुक्राणु गतिशीलता के संरक्षण अनुपात 60.2%, 81.3%, 78.6%, 66.5%, C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl FVB / NCrl, DBA/2NCrl, और / BALB cAnNCrl के लिए 61.0%, क्रमशः थे. तेजी से प्रगतिशील गतिशीलता के लिए संरक्षण अनुपात 47.3%, 69.4%, 57.0%, 52.8%, C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas में 54.1% थे CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, और / BALB cAnNCrl, क्रमशः (चित्र 1).
जमी-thawed शुक्राणु के साथ आईवीएफ दर 55.7%, 26.4%, 87.3%, 87.8% और C57BL/6NCrl में 26.2%, 129S2/SvPasCrl FVB / NCrl, DBA/2NCrl, और / BALB cAnNCrl, क्रमशः (चित्र 2) .
एक 1.5 वर्ष की अवधि के दौरान, 49 जीएम माउस लाइनों शुक्राणु cryopreservation के द्वारा संग्रहीत किया गया. इन लाइनों के बाद सफलतापूर्वक 4 महिला उपभेदों में आईवीएफ (6 / C57BL, BALB / ग, DBA / 1 और 129Sv) (चित्र 3) द्वारा बरामद किया गया (रहते जन्म पिल्ले द्वारा परिभाषित के रूप में).
चित्रा 1 शुक्राणु और चूहे में रैपिड प्रगतिशील गतिशीलता गतिशीलता के संरक्षण अनुपात.
चित्रा 2. चूहे में जमे हुए शुक्राणु-thawed के साथ में इन विट्रो निषेचन
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चित्रा 3 फ्रोजन-thawed जीएम चूहे में शुक्राणु के साथ इन विट्रो निषेचन में
Discussion
1990 के बाद से, बुनियादी शुक्राणु ठंड raffinose 18% और 3% मलाई निकाला दूध का उपयोग प्रोटोकॉल चूहों के कई उपभेदों में किया गया है विश्वसनीय सिद्ध और माउस लाइनों की एक बड़ी संख्या है 1,2,3,4,5,6,7 cryopreserved किया गया है. ठंड और विगलन प्रक्रिया के दौरान शुक्राणु कोशिकाओं को नुकसान का प्रमुख कारण बर्फ 8,9 गठन और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 10 के साथ संबद्ध किया गया है. ऐसे एमिनो एसिड के रूप में मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने वालों, और कम करने के एजेंट, monothioglycerol जैसे ठंड माध्यम से, के साथ पूरकता की जांच की और काफी जमी जन्मजात उपभेदों में thawed C57BL / 11,6 6 सहित शुक्राणु के साथ आईवीएफ की दर में वृद्धि सिद्ध किया गया था.
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम माउस शुक्राणु cryopreservation के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antioxidants और बर्फ ब्लॉकर्स के साथ बुनियादी सीपीए अनुकूलन और शुक्राणु ठंड और आईवीएफ प्रक्रिया को संशोधित करके एक नया मैं • क्रायो किट विकसित की. शुक्राणु गतिशीलता के संरक्षण अनुपात(> 60%) और तेजी से प्रगतिशील गतिशीलता (> 45%) मैं • क्रायो किट के साथ जमे हुए पांच जन्मजात माउस उपभेदों से शुक्राणु के लिए देखा गया था. 2 सेल 5 माउस जन्मजात उपभेदों में जमी thawed शुक्राणु के साथ मंच भ्रूण विकास दर स्पष्ट रूप से बुनियादी सीपीए 11,6 के साथ की तुलना में सुधार हुआ है.
किट का उपयोग कर, उपयोगकर्ता प्रत्येक पंक्ति के लिए 2 पुरुषों से ठंड शुक्राणु द्वारा एक केंद्रित शुक्राणु निलंबन बनाता है. केवल ठंड 15 तिनके तक की प्रक्रिया तेजी से आसान है, और कम या लंबी अवधि के भंडारण के लिए कम भंडारण अंतरिक्ष occupies. सबसे अधिक बार, माउस लाइनों केवल 1 या 2 तिनके विगलन द्वारा बरामद किया जा सकता है.
Disclosures
लेखक चार्ल्स नदी, इस किट के निर्माता के कर्मचारी हैं.
Acknowledgments
यहाँ प्रस्तुत शोध चार्ल्स नदी द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों के सबसे अनुवांशिक इंजीनियर मॉडल और सेवा समूह जानवरों की देखभाल और हार्मोन इंजेक्शन के लिए और भ्रूणविज्ञान स्टाफ के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
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