Summary
여기 마우스 정자 cryopreservation을 위해 새로 개발된 I • Cryo 키트를 보여줍니다. 냉동 - 해동 정자와 두 개의 세포 단계의 배아 개발이 키트의 사용 5 마우스 종자에 지속적으로 개선되었다. 1.5 년 동안, 49 유전자 변형 마우스 라인 전 • Cryo 키트와 정자 cryopreservation에 의해 보관했다 나중에 성공적으로 IVF로 회복되었습니다.
Abstract
마우스의 새로운 유전자 변형 (GM) 종자의 수천 transgenesis와 녹아웃 기술의 출현 이후 개발되었습니다. 이러한 귀중한 동물의 대부분은 긴급의 경우에도 백업 계획, 살아있는 동물로만 존재합니다. 배아의 Cryopreservation이 백업을 제공하지만 비용이 많이 드는 수 긴 절차 수 있으며, 일반적으로 성공을 위해 동물의 많은 요구하실 수 있습니다. 마우스 정자가 성공적으로 18%의 raffinose 3 % 탈지 우유로 구성된 기본 cryoprotective 에이전트 (CPA)와 cryopreserved 수있다는 발견 이후, 정자 cryopreservation는 보관 배포 이러한 귀중한 종자의 복구를 위해 허용하고 비용 효율적인 절차되고있다 .
여기 마우스 정자 cryopreservation을 위해 새로 개발된 I • Cryo 키트를 보여줍니다. 타고난 생쥐 다섯 일반적으로 사용되는 종자의 정자는이 키트를 사용하여 동결 후 회복되었다. 정자 운동성 높은 보호 비율 (>60 %)과 제어 (기본 CPA)에 비해 빠른 진보적인 운동성은 (> 45 %) 5 근친 마우스 변종이 키트와 함께 냉동 정자에 대한 보였다. 복구 정자로 IVF 후 두 세포 단계의 배아 개발은 검사 모든 5 마우스 종자에 지속적으로 개선되었다. 1.5 년 동안, 49 GM 마우스 라인은 I • Cryo 키트와 정자 cryopreservation에 의해 보관했다 나중에 IVF로 회복되었습니다.
Protocol
1. 마우스 정자 cryopreservation
- cryopreserved하는 각 라인에 대한, 시작하기 전에 다음 사항을 준비합니다.
- 키트 CPA의 2백40리터과 4 잘 요리 잘 하나
- 다음과 같이 15 정자 cryopreservation의 빨대
- 주사기에 가장 가까운 면화 플러그 하나 ML 주사기로 0.25 ML 빨대를 연결합니다. 각 짚으로 다음 IVF 매체의 8cm (약 160 μl), 공기의 1cm를로드합니다. 보존하는 라인의 이름으로 빨대를 분류.
- 아까 2 폼 상자에 깊이 15cm해야합니다. 뚜껑을 닫습니다.
- cryopreserved 수 각 라인에서 2 수컷 쥐를 안락사. 마우스는 10 및 60 주 된 사이 여야합니다. 각 마우스의 중이야 deferens과 함께 두 개의 꼬리 epididymides를 제거합니다.
- 이전에 준비한 4 잘 요리 (단계 1.1)의 잘 CPA 함유로 epididymides를 놓습니다.
- 5-7 세로 각 epididymis의 상처와 부드럽게 만들기정자를 밀어 각 중이야의 deferens를 당겨요.
- 3~5분에 대한 실온에서 부드럽게 손으로 CPA와 epididymis 혼합물을 흔들어. 이것은 정자가 수영을하실 수 있습니다.
- 이전에 준비 빨대를 사용하여 정자 서스펜션의 5mm를 (약 10 μl) 대기음 그리고 공기의 1cm.
- 15 빨대 총까지이 과정을 반복합니다. 로드와 최고의 정자 생존을위한 10 분 이내에 빨대를 밀봉.
- 조심스럽게 빨대의 양쪽을 밀봉 가열. 먼저 정자 칼럼과 냉동 용기에 빨대를 놓습니다.
- 손잡이를 연장 용기에 키트의 일부로 제공 제 1 ML의 피펫을 첨부합니다. 뚜껑에있는 구멍을 통해 거품 상자에 아까 2 용기를 놓으십시오. 10 분 후면 2 세로 부동에게 용기를 허용합니다.
- LN2에 용기를 담가. 정자는 현재 cryopreserved되고 장기 에선이 스토리지로 이동하실 수 있습니다.
- 용기는 사용하지 않아야다음 라인은 그 때까지 실내 온도 예열합니다.
2. 마우스 superovulation
- 일반적으로 정자 기증자와 같은 배경의 젊은 여성 생쥐를 사용합니다.
- 마우스는 ~ 12g (세 3-4주)하여야한다.
- 임신 암말 혈청 gonadotropin (PMSG)의 50-10 IU와 intraperitoneal 주사를 수행합니다.
- 46-48시간 기다립니다.
- 인간 chorionic gonadotropin (hCG)의 50-10 IU와 intraperitoneal 주사를 수행합니다.
- 아래에 설명된대로 hCG 주사 후 수확 oocytes가 14-16 H.
3. 마우스 정자 복구 및 IVF
- IVF 전에 해동하는 각 빨대에 대해, 37 ° C CO 2 배양기에서 적어도 한 시간 동안 다음을 준비하고 평형.
- 정자의 배양 접시 하나 35mm 페트리 접시, 기름으로 덮여 정자 치료 매체 (STM)의 90 μl 드롭과 함께.
- 접시를 절단 : oocyte 컬렉션 10 s의 최대의uperovulated 여성, IVF 매체 3 ML 하나의 35mm 페트리 접시.
- IVF 잘 : IVF 5 superovulated 여성, IVF 미디어 500 μl (... 당신은 10 superovulated 암컷을 사용하는 경우, 예를 들어, 2 우물이 필요합니다)와 함께 4 잘 요리 잘 한 각 그룹에 대한
- 사용하는 4 잘 IVF 요리의 각 잘 세척을위한 칼륨 단순 3 ML 최적화된 미디어 (KSOM) 하나의 35mm 페트리 접시 : 접시를 세척
- 문화 요리 : IVF 요리의 각 우물에서 배아 문화의 기름으로 덮여 KSOM 매체 50 μl 방울 한 35mm 페트리 접시.
- 후면 2 밀짚 후 2-3 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에서 장소를 제거합니다.
- 물 목욕에서 짚을 제거하고 여분의 물을 제거하는 닦아냅니다. 면화 플러그 가까운 최초의 공기 열에 가까운 첫 번째 절개를합니다. 여전히 정자 칼럼 전에 보이는 공기 칼럼있을 것입니다 IVF 미디어에서 짚을 잘라.
- 다음의에서 빨대의 끝을 잘라econd 공기 열, 정자 열을 절단되지 않도록주의하고. 45 각도로 절단 - 이것은 정자를 대기음하는 것이 훨씬 쉽게됩니다.
- 200 μl pipettor와 빨대의 말초 끝에서 정자 현탁액을 기음.
- STM 드롭의 중심에있는 정자 현탁액을 놓고 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 45~60분을위한 요리를 품어.
- 정자 보육 동안 절단 접시에 superovulated 여성의 oviducts을 해부하다. 적운 - oocyte의 단지 (COCs)를 발표, 각 수란관를 조각조각 30g 바늘이나 집게를 사용합니다. 더러운 미디어가 추가 세척 단계를 만들면서 IVF 미디어의 지방과 혈액을 피하십시오.
- 일단 모든 oviducts가 찢어진되었습니다, 5 암컷에서 각 IVF 우물에 COCs을 전송. superovulation에 의해 만들어진 COCs의 수는 매우 의존 변형입니다.
- STM 드롭의 주변에서 정자의 10-15 μl를 수집 한 IVF 거름을 잘 약 14-16시간은 hCG inj을 게시ection. 각 잘 사용에 대한 수정을 반복합니다. 최종 정자 농도는 약 1,000,000 / ML 것입니다.
- 37 ° C 5% CO 2 배양기에서 4~6시간에 대한 Coculture의 정자와 oocytes.
- 37 ° C 5% CO 2 배양기에서 개발 KSOM의 방울에 2 회 문화 KSOM 최소 배아를 씻으십시오.
- IVF 속도는 밖으로 야간 문화 이후에 사용되는 총 oocytes의 두 세포 단계의 배아로 계산되었다.
4. 대표 결과
5 찰스 리버 마우스 근친 계통에서 정자가 냉동했습니다. 보호 비율은 신선한 정자 평가 가치에 의해 냉동 정자 평가 가치를 나누어 계산됩니다. 정자 운동성의 보호 비율은 각각 60.2 %, 81.3 %, 78.6 %, 66.5 %, C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl 및 BALB / cAnNCrl에 대한 61.0 %, 있었다. 빠른 진보 운동성에 대한 보호 비율은 47.3 %, 69.4 %, 57.0 %, 52.8 %, C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas에서 54.1 % 있었다 CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, 각각 BALB / cAnNCrl (그림 1).
냉동 - 해동 정자로 IVF 요금은 55.7 %, 26.4 %, 87.3 %, 87.8 % 각각 26.2 C57BL/6NCrl에서 % 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl 및 BALB / cAnNCrl, (그림 2)되었습니다 .
1.5 년 동안, 49 GM 마우스 라인 정자 cryopreservation에 의해 보관되었습니다. 이 라인은 나중에 성공적으로 네 여성의 종자에서 IVF (C57BL / 6, BALB / C, DBA / 1 129Sv) (그림 3)에서 (로 태어나 살고 새끼에 의해 정의된) 복구되었습니다.
그림 1. 마우스의 정자 운동성 및 신속한 프로 그레시브 운동성의 보호 비율
마우스에서 냉동 - 해동 정자와 함께 그림 2.에서는 시험 관내 수정
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그림 3. GM의 마우스에서 냉동 - 해동 정자와 체외 수정을의
Discussion
1990 년 이후 18 %의 raffinose 3 % 탈지 우유를 사용하여 기본적인 정자 동결 프로토콜은 마우스의 여러 변종에 신뢰성이 입증되었으며 마우스 라인의 다수는 1,2,3,4,5,6,7를 cryopreserved되었습니다. 동결 융해 과정 동안 정자 세포 손상의 주요 원인은 얼음 형성 8,9 및 반응 산소 종의 10과 관련된되었습니다. 냉동 매체 등 monothioglycerol 등의 아미노산과 같은 자유 라디칼 청소부, 그리고 감소 에이전트, 함께 보완은 조사와 크게 C57BL / 6 11,6 포함하여 근친 계통에서 냉동 - 해동 정자로 IVF 속도를 증가 입증되었습니다.
현재 프로토콜에서, 우리는 상용 산화 억제제와 얼음 차단제와 함께 기본 CPA를 최적화하여하고 정자 동결 IVF 절차를 수정하여 마우스 정자 cryopreservation을위한 새로운 I • Cryo 키트를 개발했습니다. 정자 운동성의 보호 비율(> 60 %) 및 신속한 프로 그레시브 운동성은 (> 45 %) I • Cryo 키트 냉동 오 근친 마우스 종자의 정자에 대한 보였다. 5 마우스 근친 계통에서 냉동 - 해동 정자와 함께 2 - 세포 배아 단계 개발 속도는 현저하게 기본 CPA 11,6과 그에 비해 향상되었다.
키트를 사용하여, 사용자는 각 라인 2 남성의 냉동 정자로 정자 집중 서스펜션을 만듭니다. 단 냉동 15 빨대으로 과정이 빠르고, 쉽고, 단기 또는 장기 저장을위한 더 적은 저장 공간을 차지합니다. 대부분의 시간은, 마우스 라인은 1 개 또는 2 개 빨대를 해동하여 복구할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 찰스 리버,이 키트의 제조 업체의 직원입니다.
Acknowledgments
여기에 제시 연구는 찰스 강에 의해 지원되었다. 저자는 동물 보호와 호르몬 주사를위한 유전자 조작 모델 및 서비스 그룹과 발생학 직원에게 가장 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
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