Summary
Здесь мы показываем, недавно разработанный я • Крио комплект для криоконсервации спермы мыши. Два-клеточной стадии развития эмбриона с замороженной спермы талой была улучшена последовательно в 5 мышей штаммы с использованием этого комплекта. За 1,5 лет, 49 линий генетически модифицированных мышей были заархивированы спермой криоконсервации с I • Крио комплект, а затем успешно извлечены с помощью ЭКО.
Abstract
Тысячи новых генетически модифицированных (ГМ) линий мышей были созданы с момента появления трансгенез и нокаут технологий. Многие из этих ценных животных существуют только как живых животных, без каких-либо запасной план на случай чрезвычайной ситуации. Криоконсервация эмбрионов может обеспечить эту резервную копию, но требует больших затрат, может быть длительная процедура, и как правило, требуется большое количество животных для достижения успеха. С открытием, что мышь спермой может быть успешно криоконсервированных с основными криопротектор (CPA), состоящий из 18% раффиноза и 3% обезжиренного молока, спермы криоконсервация стала приемлемой и экономически эффективной процедуры для архивирования, распределения и восстановление этих ценных штаммов .
Здесь мы показываем, недавно разработанный я • Крио комплект для криоконсервации спермы мыши. Сперма из пяти часто используемых штаммов инбредных мышей были заморожены с помощью этого комплекта, а затем восстановлен. Высшее защиты отношений подвижность сперматозоидов (>60%) и быстрое прогрессивная подвижность (> 45%) по сравнению с контролем (основной CPA) были замечены на сперму замороженных к этому набору в 5 инбредных линий мышей. Два клеточной стадии развития эмбриона после ЭКО с восстановленных сперма была улучшена последовательно во всех 5 мыши штаммов рассмотрены. За 1,5 лет, 49 линий ГМ-мыши были заархивированы спермой криоконсервации с I • Крио комплект и позже извлечены с помощью ЭКО.
Protocol
1. Криоконсервация спермы мыши
- Для каждой линии, которая будет криоконсервированных, подготовить следующие перед началом.
- 1 скважина 4-а блюдо с 240 л комплекта CPA
- 15 криоконсервации спермы соломинки следующим
- Подключите 0,25 мл соломинки для 1 мл шприцы с ватный тампон ближе всего к шприц. В каждом из соломы, нагрузка 8 см (примерно 160 мкл) среднего ЭКО, то 1 см воздуха. Этикетка соломинки с названием линии должны быть сохранены.
- LN 2 должна быть 15 см глубиной в пене окно. Закрыть крышкой.
- Эвтаназии 2 самцов мышей из каждой строки будет криоконсервированных. Мыши должны быть от 10 до 60 недель. Удалите два хвостовых epididymides вместе с семявыносящих протоков от каждой мыши.
- Место epididymides в ранее подготовленный CPA содержащих также из 4-а блюдо (шаг 1.1).
- Сделайте 5-7 продольные разрезы в каждой придатка яичка и мягкосжать каждый семявыносящих протоков подтолкнуть сперму из.
- Встряхните CPA и придатка смесь вручную осторожно при комнатной температуре в течение 3-5 минут. Это позволит спермы выплыть.
- Использование заранее подготовленный соломы, аспирации 5 мм (примерно 10 мкл) спермы подвески и 1 см воздуха.
- Повторите эту процедуру до в общей сложности 15 соломинку. Загрузка и печать соломинки в течение 10 минут для лучшей спермы выживания.
- Тепло печать с обеих сторон соломы тщательно. Место соломинки в морозильной канистры со спермой колонки в первую очередь.
- Прикрепить 1 мл пипетки предоставляются как часть комплекта для канистру расширить ручкой. Место канистру в LN 2 в пене ящик через отверстие в крышке. Разрешить канистру плавать вертикально в LN 2 в течение 10 минут.
- Погрузитесь в канистру LN2. Сперма теперь криоконсервированных и могут быть перемещены в долгосрочной LN 2 хранения.
- Контейнер не должен использоваться дляСледующая строка, пока она разогревается до комнатной температуры.
2. Мышь суперовуляции
- Как правило, используют молодых самок мышей той же фоне, как доноров спермы.
- Мыши должны быть ~ 12 г (3-4 недель).
- Выполните внутрибрюшинного введения с 5-10 МЕ Беременные кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG).
- Подождите 46-48 часа.
- Выполните внутрибрюшинного введения с 5-10 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).
- Урожай ооцитов 14-16 часов после инъекции ХГЧ, как описано ниже.
3. Мышь восстановления спермы и ЭКО
- Перед ЭКО, для каждого соломы можно размораживать, готовить следующий и равновесие, по крайней мере один час в 37 ° C CO 2 инкубатора.
- Сперма инкубации блюдо: одна 35 мм чашки Петри, с 90 мкл капли спермы лечения среды (СТМ) покрыты маслом.
- Резка блюдо: Для ооцитов коллекцию из более 10 секuperovulated самок, одна 35 мм чашки Петри с 3 мл среды ЭКО.
- ЭКО хорошо: Для каждой группы из 5 superovulated женщин для проведения ЭКО, одну лунку 4 также блюдо с 500 мкл среды ЭКО (если вы используете 10 superovulated женщин, например, вам потребуется 2 скважины...)
- Стиральная блюдо: одна 35 мм чашки Петри с 3 мл калия простого оптимизированный среды (KSOM) для промывки каждую лунку 4-хорошо ЭКО блюдо использоваться
- Культура блюдо: одна 35 мм чашки Петри с 50 мкл капли KSOM среды покрыты маслом для культивирования эмбрионов из каждой лунки этого блюда ЭКО.
- Удалить из соломы LN 2 и место в 37 ° С на водяной бане 2-3 минут.
- Удалить соломы с водяной бани и протереть, чтобы удалить лишнюю воду. Сделайте первый срезаны близко к первой колонке воздуха ближайшее ватный тампон. Вырезать соломы в среднесрочной ЭКО еще будет столб воздуха обнаружены до начала спермы колонке.
- Затем вырежьте конце соломы сecond столб воздуха, соблюдая осторожность, чтобы избежать сокращения спермы колонке. Вырезать под углом 45 - это будет сделать намного легче для аспирации спермы.
- Аспирацию спермы отстранение от дистального конца соломы с 200 мкл пипетки.
- Место спермы суспензии в центре STM падение и инкубировать блюдо в течение 45-60 минут при 37 ° C 5% СО 2 инкубатора.
- Во время инкубации спермы, рассекать яйцеводов из superovulated женщин в резки блюдо. Используйте иглу 30 г или щипцами рвать каждый яйцевод, выпустив кучево-ооцитов комплексов (КОК). Избегайте жира и крови в среде ЭКО как грязным средств массовой информации делает дополнительные шаги для стирки.
- После того как все яйцеводы были оторваны, передача КОК из 5 сук каждому ЭКО скважин. Число КОК производства суперовуляции очень штамм зависимыми.
- Сбор 10-15 мкл спермы от периферии STM падение и удобрять один ЭКО также около 14-16 часов после ХГЧ Injперегиба. Повторите оплодотворения для каждой скважины используются. Конечная концентрация сперматозоидов будет примерно 1 млн / мл.
- Спермы и ооцитов Coculture в течение 4-6 часов при 37 ° C 5% СО 2 инкубатора.
- Промыть эмбрионы с KSOM минимум в 2 раза и культуры в каплях KSOM для развития в 37 ° C 5% СО 2 инкубатора.
- ЭКО ставка была рассчитана как два клеточной стадии эмбрионов из общего ооциты использовать после ночной культуры.
4. Представитель Результаты
Сперма от 5 Charles River мыши инбредных линий были заморожены. Защита коэффициенты рассчитываются путем деления величины оценки замороженных сперматозоидов свежим значений оценки спермы. Защита отношения подвижность сперматозоидов была 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% для C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl и BALB / cAnNCrl, соответственно. Защита отношения для быстрого прогрессивная подвижность была 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% в C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl и BALB / cAnNCrl, соответственно (рис. 1).
ЭКО ставки с замороженной спермы талой были 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% и 26,2% в C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl и BALB / cAnNCrl, соответственно (рис. 2) .
За 1,5 лет, 49 линий ГМ-мыши были заархивированы спермой криоконсервации. Эти строки были позже успешно восстановлен (как определено в живых щенков родившихся) по ЭКО в 4-х женских штаммов (C57BL / 6, BALB / с, DBA / 1 и 129Sv) (рис. 3).
Рисунок 1. Защита коэффициенты подвижности сперматозоидов и быстрая прогрессивная подвижность у мышей
Рисунок 2. Экстракорпоральное оплодотворение с Frozen-талого спермы у мышей
3713fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Экстракорпоральное оплодотворение с Frozen-талого спермы у мышей GM
Discussion
С 1990 года основной протокол замораживания спермы, используя 18% раффиноза и 3% обезжиренного молока было доказано, надежный во многих штаммов мышей и большое количество мышей линии были криоконсервированных 1,2,3,4,5,6,7. Основными причинами повреждения сперматозоидов во время замораживания и размораживания процесса были связаны с образованием льда 8,9 и активных форм кислорода 10. Дополнение с свободных радикалов, таких как аминокислоты, и восстановители, такие как monothioglycerol, в морозильной среды исследовано и доказано, существенно увеличить скорость ЭКО с замороженными талой спермы в инбредных линиях, включая C57BL / 6, 11,6.
В настоящее время протокол, мы разработали новую I • Крио комплект для криоконсервации спермы мыши за счет оптимизации основных CPA с имеющимися в продаже антиоксидантов и льда блокаторы и, изменив замораживания спермы и процедуры ЭКО. Защита отношения подвижность сперматозоидов(> 60%) и быстрое прогрессивная подвижность (> 45%) были замечены на сперму из пяти инбредных линий мышей с замороженными я • Крио комплект. 2-клеточной стадии развития эмбриона скорости с замороженной спермы в талой 5 мышей инбредных линий была заметно улучшилась по сравнению с основными CPA 11,6.
При использовании комплект, пользователь создает концентрированную суспензию сперматозоидов путем замораживания спермы от 2 кобеля для каждой линии. По только замораживания 15 соломинки процесс происходит быстро, легко и занимает меньше места для краткосрочного или длительного хранения. В большинстве случаев, мыши линии могут быть извлечены с помощью оттаивания только 1 или 2 соломинку.
Disclosures
Авторы являются сотрудниками Charles River, создатель этого комплекта.
Acknowledgments
Исследования, представленные здесь была поддержана Charles River. Авторы весьма признательны генной инженерии модели и услуги группы и сотрудников эмбриологии для ухода за животными и гормональной инъекции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
