Summary
Burada fare sperm dondurulması için yeni geliştirilen I • Cryo kiti göstermektedir. Sperm ile dondurulmuş çözülmüş İki hücreli evre embriyo gelişimi bu kit kullanımı ile 5 fare suşlarının sürekli geliştirildi. 1.5 yıllık bir dönemde, 49 genetiği değiştirilmiş fare hatları I • Cryo kiti ile sperm dondurulması tarafından arşivlendiği ve daha sonra başarılı IVF tarafından kurtarıldı.
Abstract
Binlerce yeni farelerin genetik yapısı değiştirilmiş (GM) suşları transgenesis ve boşaltma teknolojilerin gelişiyle bu yana oluşturulmuştur. Bu değerli hayvanların çoğu, canlı hayvan olarak sadece acil durumlarda herhangi bir yedekleme planı ile var. Embriyo Kriyoprezervasyon bu yedekleme sağlar, ancak pahalı olduğunu, uzun bir prosedür olması, ve genel olarak, başarı için hayvanların çok sayıda gerektirir. Fare sperm,% 18 raffinose ve% 3 yağsız süt oluşan bir temel dondurucu ajan (CPA) ile başarıyla Kriyoprezerve olabilir keşfinden beri, sperm dondurulması, bu değerli suşları, arşivleme, dağıtım ve kurtarma için kabul edilebilir ve maliyet-etkin bir yöntem haline gelmiştir .
Burada fare sperm dondurulması için yeni geliştirilen I • Cryo kiti göstermektedir. Kendilenmiş farelerin beş yaygın kullanılan suşlar bu kit kullanarak sperm dondurulur ve daha sonra ele geçirilmiştir. Sperm Yüksek koruma oranları (>5 kendilenmiş fare suşlarının bu kit ile dondurulmuş sperm için% 60) ve kontrol (temel EBM) ile karşılaştırıldığında, hızlı progresif motilite (>% 45) görüldü. Sperm IVF sonra iki hücre aşamasında embriyo gelişimi incelendiğinde tüm 5 fare suşlarının sürekli geliştirildi. 1.5 yıllık bir dönemde, 49 GM fare hatları I • Cryo kiti ile sperm dondurulması tarafından arşivlenen ve daha sonra IVF tarafından kurtarıldı.
Protocol
1. Fare sperm dondurulması
- Kriyoprezerve her satırı için, başlamadan önce aşağıdaki hazırlamak.
- 1 kiti CPA 240 l 4-iyi bir yemek, iyi
- Aşağıdaki gibi 15 sperm dondurulması payet
- Şırıngaya yakın pamuk fişi ile 1 ml şırınga 0,25 ml payet bağlayın. Her saman, sonra IVF orta 8 cm (yaklaşık 160 ul), 1 cm hava yükleyin. Payet korunacak hattın adı ile etiketleyin.
- LN 2 derin köpük kutusunda 15 cm olmalıdır. Kapağını kapatın.
- Kriyoprezerve her satırı 2 erkek fareler Euthanize. Fareler, 10 ve 60 haftalık arasında olmalıdır. Her fare vas deferens ile birlikte iki kaudal epididymides çıkarın.
- Önceden hazırlanmış 4-iyi bir çanak (adım 1.1) EBM içeren epididymides yerleştirin.
- Her epididim 5-7 uzunlamasına keser ve nazik olunSperm dışarı itmek için her vas deferens sıkın.
- 3-5 dakika oda sıcaklığında CPA ve epididim karışımı elle hafifçe sallayın. Bu sperm yüzmek için izin verecektir.
- Önceden hazırlanmış saman kullanarak, sperm süspansiyonu 5 mm (yaklaşık 10 ul) aspirat ve ardından havanın 1 cm.
- Toplam 15 payet kadar bu işlemi tekrarlayın. Yük ve en iyi sperm hayatta kalmak için 10 dakika içinde payet mühür.
- Saman her iki tarafında dikkatli mühür ısıtın. Ilk sperm sütun donma spreyi payet yerleştirin.
- 1 ml pipet kolu uzatmak için spreyi kitinin bir parçası olarak sağlanan takın. LN 2 teneke kutu kapağı delikten köpük kutusuna yerleştirin. 10 dakika için LN 2 dikey float spreyi izin verin.
- LN2 spreyi bırakın. Sperm Kriyoprezerve ve uzun vadeli LN 2 depolama taşınmış olabilir.
- Spreyi kullanılmamalıdırbir sonraki satıra kadar oda sıcaklığına kadar ısıtılır.
2. Fare süperovulasyon
- Genel olarak, genç dişi farelerde sperm vericisi olarak aynı arka plan kullanın.
- Fare ~ 12 g (yaş 3-4 hafta) olmalıdır.
- Hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG) 5-10 IU ile bir intraperitoneal gerçekleştirin.
- 46-48 saat bekleyin.
- 5-10 IU insan koryonik gonadotropin (hCG) ile bir intraperitoneal gerçekleştirin.
- HCG enjeksiyonu sonrasında aşağıda açıklandığı gibi Hasat oosit 14-16 saat.
3. Fare sperm ve IVF
- IVF önce çözülmüş olması için her saman için, en az bir saat için 37 ° C CO 2 inkübatör aşağıdaki hazırlamak ve dengelenmesi.
- Sperm inkübasyon çanak: bir 35 mm Petri kabında 90 ul bir damla yağ ile kaplı sperm tedavi orta (STM).
- Kesme çanak: Yumurta toplama için en fazla 10 snuperovulated kadın, 3 ml IVF orta ile 35 mm Petri kabında.
- IVF: IVF için 5 süperovulasyon kadın, IVF orta 500 ul (.. 10 süperovulasyon kadın kullanıyorsanız, örneğin, 2 kuyu gerekecektir) ile 4 sıra çanak iyi bir her grup için
- Kullanılan 4-iyi IVF çanak her iyi yıkamak için 3 ml potasyum simpleks optimize orta (KSOM) ile bulaşık bir 35 mm Petri kabı:
- Kültür çanak: 50 IVF yemeğin her kuyudan petrol embriyo kültürü ile kaplı KSOM orta ul damla bir 35 mm Petri kabında.
- LN 2 ile saman ve 2-3 dakika 37 ° C su banyosunda yer çıkarın.
- Su banyosu saman çıkarın ve fazla suyu kaldırmak için silin. İlk kesilen pamuk fiş en yakın ilk hava sütunu yakın olun. Hala bir hava sütunu sperm sütun önce görünür olacaktır IVF orta saman kesin.
- Sonra saman s ucuecond hava sütun, sperm sütun kesme önlemek için dikkatli olmak. 45 açıyla Kes - Bu sperm aspire çok daha kolay hale getirecek.
- 200 ul pipet ile saman distal ucundan sperm süspansiyonu aspire.
- STM damla merkezi sperm süspansiyonu yerleştirin ve 45-60 dakika boyunca 37 ° C% 5 CO 2 inkübatör inkübe çanak.
- Sperm inkübasyon sırasında, kesme çanak içine süperovulasyon kadın siyon hatası teşrih. Cumulus-oosit kompleksleri (COC) bırakmadan, her yumurtalık gözyaşı 30 g iğne veya forseps kullanın. IVF orta kirli medya, ekstra yıkama adımlar için yapar gibi yağ ve kan kaçının.
- Bir kez tüm siyon hatası yıkılarak, 5 kadın her IVF kuyuları Kombine oral kontraseptif aktarın. Süperovulasyon tarafından üretilen kombine oral kontraseptif sayısı çok bağımlı süzün.
- STM damla çevreden sperm 10-15 ul toplayın ve bir IVF döller de yaklaşık 14-16 saat hCG injection. Her bir kuyunun kullanılan gübreleme tekrarlayın. Final sperm konsantrasyonu yaklaşık 1 milyon / ml olacaktır.
- 4-6 saat 37 ° C% 5 CO 2 inkübatör Coculture sperm ve oosit.
- Embriyoların gelişimi için 37 ° C% 5 CO 2 inkübatör KSOM damla en az 2 kez ve kültür KSOM ile yıkayın.
- IVF oranı gece kültürden sonra kullanılan toplam oositlerin iki hücre sahne olan embriyolar gibi hesaplanmıştır.
4. Temsilcisi Sonuçlar
5 Charles Nehri fare kendilenmiş suşlarının sperm donduruldu. Koruma oranları taze sperm değerlendirmesi değerleri ile dondurulmuş sperm değerlendirme değerleri bölünmesiyle hesaplanır. Sperm Koruma oranları sırasıyla% 60.2,% 81.3,% 78.6,% 66.5,% 61.0 'C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl FVB / NCrl, DBA/2NCrl ve BALB / cAnNCrl. Hızlı progresif motilite için koruma oranları% 47.3,% 69.4,% 57.0,% 52.8,% 54.1 C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl ve sırasıyla BALB / cAnNCrl (Şekil 1).
Dondurulmuş çözülmüş sperm ile tüp bebek oranı% 55.7,% 26,4,% 87.3,% 87.8 ve C57BL/6NCrl yılında sırasıyla 26.2%, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl DBA/2NCrl ve BALB / cAnNCrl (Şekil 2) .
1.5 yıllık bir dönemde, 49 GM fare hatları sperm dondurulması tarafından arşivlenir. Bu satırlar, daha sonra başarılı IVF (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 ve 129Sv), 4 kadın suşları (Şekil 3) (canlı doğan yavrular tarafından tanımlandığı gibi) ele geçirilmiştir.
Şekil 1: Fareler ve Sperm Hareketliliği Hızlı Aşamalı Motilite Koruma Oranları
Farelerde Dondurulmuş çözülmüş Sperm Şekil 2. In Vitro Fertilizasyon
3713fig3.jpg "/>
Şekil 3. GM Farelerde Dondurulmuş çözülmüş Sperm ile in vitro fertilizasyon
Discussion
1990 yılından bu yana,% 18 raffinose ve% 3 yağsız süt kullanarak temel sperm dondurma protokol farelerin birçok suşları güvenilir kanıtlanmış ve çok sayıda fare hatları 1,2,3,4,5,6,7 Kriyoprezerve edilmiştir . Donma ve çözülme süreci sırasında sperm hücrelerinin zarar görmesi başlıca nedenleri, buz oluşumu 8,9 ve reaktif oksijen türlerinin 10 ile ilişkili olduğu var. Dondurucu bir ortamda böyle bir monotiyogliserol olarak amino asitler gibi serbest radikal temizleyiciler ve indirgeyici ajanlar, takviyesinin araştırılmalı ve C57BL / 6 11,6 kendilenmiş suşları dahil olmak üzere donmuş-çözülmüş sperm ile tüp bebek oranı önemli ölçüde artırmak için kanıtlanmış oldu.
İşbu Protokol, piyasada bulunan antioksidanlar ve buz blokerleri ile temel EBM optimize ederek, sperm dondurma ve IVF işlemi değiştirerek fare sperm dondurulması için yeni bir I • Cryo kiti geliştirdi. Sperm Koruma oranları(>% 60) ve hızlı progresif motilite (>% 45) I • Cryo kiti ile dondurulmuş beş kendilenmiş fare suşlarının sperm görüldü. 5 fare kendilenmiş suşları dondurulmuş çözülmüş sperm ile 2-hücreli aşamasında embriyo gelişimi oranı temel EBM 11,6 ile kıyasla belirgin bir şekilde düzeldi.
Kiti kullanılarak, kullanıcının her bir hat için 2 erkek dondurma sperm tarafından konsantre bir sperm süspansiyonu oluşturur. Sadece dondurulması 15 payet olarak süreci hızlı, kolay ve kısa ya da uzun süreli depolama için daha az depolama alanı kaplar. Çoğu kez, fare hatları sadece 1 veya 2 payet çözülme tarafından kurtarıldı.
Disclosures
Yazarlar Charles River, bu kit üreticisi çalışanları.
Acknowledgments
Burada sunulan araştırma, Charles River tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, hayvan bakımı ve hormon enjeksiyonu için Genetiği Modeller ve Hizmetler grubu ve Embriyoloji personeli için çok teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
