Summary
Hier laten we zien de nieuw ontwikkelde I • Cryo-kit voor de muis sperma cryopreservatie. Twee-cellig stadium embryo ontwikkeling met ingevroren-ontdooid sperma werd steeds verbeterd in 5 muizenstammen met het gebruik van deze kit. Over een periode van 1,5 jaar werden 49 genetisch gemodificeerde muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie met de I • Cryo-kit en later met succes teruggevorderd door IVF.
Abstract
Duizenden nieuwe genetisch gemodificeerde (GM) stammen van muizen zijn gemaakt sinds de komst van transgenese en knock-out-technologieën. Veel van deze waardevolle dieren bestaan alleen als levende dieren, zonder back-up plan in geval van nood. Cryopreservatie van embryo's kan deze back-up te bieden, maar is kostbaar, kan een langdurige procedure worden, en over het algemeen vereist een groot aantal dieren voor succes. Sinds de ontdekking dat muis sperma met succes kan worden ingevroren met een basis cryoprotectief agent (CPA), bestaande uit 18% raffinose en 3% afgeroomde melk, is sperma cryopreservatie uitgegroeid tot een aanvaardbare en kosteneffectieve procedure voor het archiveren, verspreiden en herstel van deze waardevolle stammen .
Hier laten we zien een nieuw ontwikkelde I • Cryo-kit voor de muis sperma cryopreservatie. Sperma van vijf veel gebruikte stammen van inteelt muizen werden ingevroren met behulp van deze kit en vervolgens hersteld. Een betere bescherming verhoudingen van beweeglijkheid van de zaadcellen (>60%) en een snelle progressieve motiliteit (> 45%) in vergelijking met de controlegroep (basis CPA) werden gezien voor sperma ingevroren met deze kit in 5 inteelt muizenstammen. Twee cellig stadium embryo ontwikkeling na IVF met de herstelde sperma was consistent verbeterd in alle vijf onderzochte muizenstammen. Over een periode van 1,5 jaar werden 49 GM muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie met de I • Cryo-kit en later teruggevorderd door IVF.
Protocol
1. Muis sperma cryopreservatie
- Voor elke regel te zijn gecryoconserveerd, bereiden de volgende voordat u begint.
- Een goed van een 4-goed schotel met 240 l van de kit CPA
- 15 sperma cryopreservatie rietjes als volgt
- Sluit de 0,25 ml rietjes tot het 1 ml spuiten met de katoenen stekker die het dichtst bij de spuit. In elke stro, load 8 cm (ongeveer 160 pl) van IVF medium, dan 1 cm van de lucht. Label de rietjes met de naam van de lijn te behouden.
- LN 2 moet 15 cm diep in het schuim doos. Sluit het deksel.
- Euthanaseren twee mannelijke muizen van elke regel te worden gecryopreserveerd. Muizen moet tussen 10 en 60 weken oud. Verwijder de twee caudale epididymides samen met de zaadleider van elke muis.
- Plaats de epididymides in de vooraf bereide CPA-bevattende goed van een 4-goed schotel (stap 1.1).
- Maak 5-7 sneetjes die in elke bijbal en voorzichtigknijp elke zaadleider om sperma te duwen.
- Schud de CPA en de bijbal mengsel met de hand zachtjes bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten. Dit zal toelaten om te zwemmen zaadcellen uit.
- Met behulp van de vooraf bereide stro, aspiratie 5 mm (ongeveer 10 ul) van sperma suspensie en vervolgens 1 cm van de lucht.
- Herhaal dit proces met maximaal een totaal van 15 rietjes. Laden en seal rietjes binnen 10 minuten voor de beste zaadcellen overleven.
- Verhit voorzichtig afdichting aan beide zijden van het stro. Leg de rietjes in de bevriezing bus met het sperma kolom eerste.
- Bevestig de 1 ml pipet geleverd als onderdeel van de kit om de bus aan het handvat uit te breiden. Plaats de container in LN 2 in het schuim doos door het gat in het deksel. Laat de bus verticaal zweven in de LN 2 voor 10 minuten.
- Dompel de bus in de LN2. Het sperma is nu gecryopreserveerd en kan worden verplaatst naar de lange termijn LN 2-opslag.
- De bus mag niet worden gebruikt voorde volgende regel totdat het wordt opgewarmd tot kamertemperatuur.
2. Muis superovulatie
- Algemeen, een gebruik jonge vrouwelijke muizen van dezelfde achtergrond als het sperma donoren.
- Muizen moet worden ~ 12 g (3-4 weken oud).
- Voer een intraperitoneale injectie met 5-10 IE drachtige merrie serum gonadotropin (PMSG).
- Wacht 46 tot 48 uur.
- Voer een intraperitoneale injectie met 5-10 IE humaan choriongonadotrofine (hCG).
- Oogst eicellen 14-16 uur na de hCG-inspuiting zoals hieronder beschreven.
3. Muis sperma herstel en IVF
- Voor IVF, voor elke stro te worden ontdooid, de voorbereiding van de volgende en voor minstens een uur equilibreren in een 37 ° C CO 2 incubator.
- Sperma incubatie gerecht: een 35 mm petrischaal, met een 90 ul druppel sperma behandeling medium (STM) bedekt met olie.
- Cutting gerecht: Voor eicel collectie van maximaal 10 superovulated vrouwtjes, een 35 mm petrischaal met 3 ml van IVF medium.
- IVF goed: Voor elke groep van vijf gesuperovuleerde vrouwen voor IVF, een putje van een 4 goed schotel met 500 pi van IVF medium (indien u gebruik maakt van 10 gesuperovuleerde vrouwen, bijvoorbeeld, moet u twee putten...)
- Wassen gerecht: een 35 mm petrischaal met 3 ml van kalium-simplex geoptimaliseerd medium (KSOM) voor het wassen elk putje van de 4-goed gebruikt IVF schotel
- Cultuur gerecht: een 35 mm petrischaal met 50 ul druppels KSOM medium bedekt is met olie voor embryo cultuur uit elk putje van de IVF-schotel.
- Verwijder een stro van LN 2 en plaats in een 37 ° C waterbad gedurende 2-3 minuten.
- Verwijder het stro van het waterbad en veeg om het overtollige water te verwijderen. Maak de eerste snede dicht bij de eerste kolom lucht het dichtst bij de katoen stekker. Snijd de stro in de IVF-medium zal er nog steeds een luchtkolom zien voordat het sperma kolom.
- Knip dan de uiteinde van het rietje in de sWEEDE luchtkolom, zorg ervoor om te voorkomen dat het snijden van de zaadcellen kolom. Snij bij een 45 hoek - dit maakt het veel gemakkelijker om het sperma zuigen.
- Zuig het sperma schorsing van het distale uiteinde van het rietje met een 200 ul pipet.
- Plaats het sperma suspensie in het centrum van de STM laten vallen en incubeer de schotel voor 45-60 minuten in een 37 ° C 5% CO 2 incubator.
- Tijdens het sperma incubatie, ontleden de eileiders van de gesuperovuleerde vrouwen in de snij-schotel. Gebruik een 30 g naald of pincet aan elke eileider scheuren, het loslaten van de cumulus-complexen eicel (COC's). Vermijd vet en bloed in de IVF-medium als vuile media zorgt voor een extra wasstappen.
- Zodra alle eileiders zijn gescheurd, overdracht van de combinatie-OAC's van vijf vrouwtjes aan elke IVF putten. Het aantal van COC's geproduceerd door superovulatie is zeer afhankelijk van soort.
- Verzamel 10 tot 15 ul van sperma uit de periferie van de STM te laten vallen en bemesten een IVF ook ongeveer 14-16 uur na de hCG injectie. Herhaal dit voor elke bemesting goed gebruikt. Uiteindelijke spermaconcentratie zal ongeveer 1 miljoen / ml.
- Coculture sperma en eicellen gedurende 4-6 uur in een 37 ° C 5% CO 2 incubator.
- Was de embryo's met KSOM een minimum van 2 keer en cultuur in KSOM druppels voor ontwikkeling in een 37 ° C 5% CO 2 incubator.
- IVF werd berekend als twee cellig stadium embryo's uit eicellen van het totaal gebruikte na een nacht cultuur.
4. Representatieve resultaten
Sperma van 5 Charles River muis inteeltstammen was bevroren. Bescherming van ratio's zijn berekend door het ingevroren sperma beoordeling waarden door vers sperma beoordeling waarden. Bescherming verhoudingen van beweeglijkheid van de zaadcellen was 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% voor C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, en BALB / cAnNCrl, respectievelijk. Bescherming van ratio's voor een snelle progressieve motiliteit was 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, en BALB / cAnNCrl, respectievelijk (afb. 1).
De IVF-tarieven met ingevroren-ontdooide zaadcellen waren 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% en 26,2% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, en BALB / cAnNCrl, respectievelijk (Fig 2) .
Over een periode van 1,5 jaar werden 49 GM muis lijnen gearchiveerd door sperma cryopreservatie. Deze lijnen werden later met succes teruggevonden (zoals gedefinieerd door levende jongen geboren) door IVF in 4 vrouwelijke stammen (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 en 129Sv) (afb. 3).
Figuur 1. De bescherming Ratio van de beweeglijkheid van de zaadcellen en de snelle progressieve motiliteit in Muizen
Figuur 2. In Vitro Fertilisatie met Frozen-ontdooid sperma in Muizen
3713fig3.jpg "/>
Figuur 3. In vitro fertilisatie met Frozen-ontdooid sperma in GM Muizen
Discussion
Sinds 1990 is de basis sperma invriezen protocol met behulp van 18% raffinose en 3% afgeroomde melk is betrouwbaar gebleken in vele stammen van muizen en een groot aantal van de muis lijnen zijn gecryopreserveerd 1,2,3,4,5,6,7. De belangrijkste oorzaken van schade aan zaadcellen tijdens het invriezen en ontdooien proces zijn geassocieerd met ijsvorming 8,9 en reactieve zuurstof species 10. Suppletie met vrije radicalen, zoals aminozuren, en reductiemiddelen, zoals monothioglycerol, in het bevriezen medium werd onderzocht en bewezen dat IVF-tarief aanzienlijk te verhogen met ingevroren-ontdooid sperma in inteeltstammen inclusief de C57BL / 6 11,6.
In het huidige protocol, ontwikkelden we een nieuwe I • Cryo-kit voor de muis sperma cryopreservatie door het optimaliseren van de basis-CPA met commercieel verkrijgbare anti-oxidanten en ijs blokkers en door het wijzigen van het sperma invriezen en IVF procedure. Bescherming verhoudingen van beweeglijkheid van de zaadcellen(> 60%) en een snelle progressieve motiliteit (> 45%) werden gezien voor het sperma van vijf inteelt muizenstammen bevroren met de I • Cryo kit. De 2-cellig stadium embryo ontwikkeling tarief met ingevroren-ontdooid sperma in vijf muizen inteeltstammen werd aanzienlijk verbeterd in vergelijking met die met basis CPA 11,6.
Bij het gebruik van de kit, creëert de gebruiker een geconcentreerde sperma schorsing door bevriezing sperma van 2 mannen voor elke lijn. Door alleen het bevriezen 15 rietjes het proces is snel, eenvoudig en neemt minder opslagruimte voor korte of lange-termijn opslag. De meeste tijden, kan de muis lijnen worden teruggevorderd door ontdooien slechts 1 of 2 rietjes.
Disclosures
De auteurs zijn medewerkers van Charles River, de maker van deze kit.
Acknowledgments
Het hier gepresenteerde onderzoek werd ondersteund door Charles River. De auteurs zijn het meest dankbaar voor de genetisch gemanipuleerde modellen en Services groep en de Embryologie personeel voor verzorging van dieren en hormoon injectie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
