Summary
Ici nous démontrons l'nouvellement développé, je • Cryo Kit pour la cryoconservation du sperme de souris. Deux cellules du développement embryonnaire scène avec des spermatozoïdes congelés-décongelés a été améliorée de manière cohérente dans cinq souches de souris à l'utilisation de ce kit. Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme avec le kit I • Cryo et plus tard avec succès récupéré par FIV.
Abstract
Des milliers de nouveaux génétiquement modifiés (OGM) des souches de souris ont été créés depuis l'avènement des technologies de transgénèse et KO. Beaucoup de ces précieux animaux n'existent que comme des animaux vivants, sans plan de sauvegarde en cas d'urgence. Cryoconservation des embryons peuvent fournir ce secours, mais elle est coûteuse, peut être une procédure longue, et nécessite généralement un grand nombre d'animaux pour le succès. Depuis la découverte que le sperme de souris peuvent être cryoconservés avec succès avec un agent de base cryoprotecteurs (CPA), composé de raffinose 18% et 3% de lait écrémé, la cryoconservation du sperme est devenu une procédure acceptable et rentable pour l'archivage, la distribution et la récupération de ces souches précieuses .
Ici nous démontrons une nouvellement développé, je • Cryo Kit pour la cryoconservation du sperme de souris. Le sperme de cinq souches couramment utilisé des souris consanguines ont été gelés en utilisant ce kit et ensuite récupéré. Rapports de protection plus élevé de la motilité des spermatozoïdes (>60%) et la motilité progressive rapide (> 45%) par rapport au contrôle (de base CPA) ont été vus pour sperme congelé avec ce kit de 5 souches de souris consanguines. Deux cellules d'embryons de stade de développement après FIV avec le sperme retrouvé a été améliorée de manière cohérente dans l'ensemble des 5 souches de souris examinées. Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme avec le kit I • Cryo et récupéré plus tard par FIV.
Protocol
1. Cryoconservation du sperme de souris
- Pour chaque ligne d'être cryoconservés, préparer la suivante avant de commencer.
- 1 puits d'un plat 4-bien avec 240 l de kit CPA
- 15 pailles cryoconservation du sperme comme suit
- Connectez l'0,25 ml pailles à l'seringues de 1 ml avec le tampon de coton plus proche de la seringue. Dans chaque paille, charge de 8 cm (environ 160 pi) de moyennes FIV, puis 1 cm d'air. Étiquette les pailles avec le nom de la ligne doit être préservée.
- LN 2 devrait être de 15 cm de profondeur dans la boîte de mousse. Fermez le couvercle.
- 2 euthanasier les souris mâles de chaque ligne pour être cryoconservés. Souris devrait se situer entre 10 et 60 semaines. Retirez les deux épididymes caudales avec le canal déférent de chaque souris.
- Placez les épididymes dans le CPA préalablement préparé contenant bien d'un plat 4-même (étape 1.1).
- Faire 5-7 coupes longitudinales dans chaque épididyme et doucementpresser chaque canal déférent pour pousser le sperme sortir.
- Agiter le mélange de l'ACP et de l'épididyme à la main en douceur à la température ambiante pendant 3-5 minutes. Cela permettra aux spermatozoïdes de nager sur.
- Utilisation de la paille préalablement préparé, aspirer 5 mm (environ 10 pi) de la suspension de spermatozoïdes et ensuite 1 cm d'air.
- Répétez ce processus jusqu'à un total de 15 pailles. Charger et sceller des pailles dans les 10 minutes pour la survie des spermatozoïdes mieux.
- Thermoscellez deux côtés de la paille soigneusement. Placer les pailles dans le bidon de congélation du sperme avec la colonne première.
- Fixer la pipette 1 ml fournie dans le cadre de la trousse à la boîte de prolonger la poignée. Placez la cartouche dans la LN 2 dans la boîte de mousse à travers le trou dans le couvercle. Laisser le réservoir de flotter à la verticale dans la LN 2 pendant 10 minutes.
- Immergez la cartouche dans le LN2. Le sperme est maintenant cryoconservés et peut être déplacé à long terme LN 2 de stockage.
- La cartouche ne doit pas être utilisé pourla ligne suivante jusqu'à ce qu'il soit réchauffé à la température ambiante.
2. Superovulation souris
- Généralement, l'utilisation de jeunes souris femelles de la même origine que les donneurs de sperme.
- Souris devrait être ~ 12 g (3-4 semaines d'âge).
- Effectuer une injection intrapéritonéale avec UI 5-10 de gonadotrophine de sérum de jument enceinte (PMSG).
- Attendre 46 à 48 heures.
- Effectuer une injection intrapéritonéale avec UI 5-10 de la gonadotrophine chorionique humaine (hCG).
- Récolte ovocytes 14-16 h après l'injection d'hCG comme décrit ci-dessous.
3. La récupération des spermatozoïdes de souris et FIV
- Avant la FIV, pour chaque paillette d'être décongelé, préparer la suivante et s'équilibrer pendant au moins une heure dans un 37 ° C incubateur à CO 2.
- Plat d'incubation de sperme: une boîte de Petri de 35 mm, avec une chute de 90 ul de milieu de traitement du sperme (STM) recouvert d'huile.
- Découpe plat: Pour la collecte des ovocytes à partir d'un maximum de 10 sfemelles uperovulated, une boîte de Petri de 35 mm avec 3 ml de milieu de FIV.
- FIV ainsi: Pour chaque groupe de 5 femelles superovulées pour la FIV, un puits d'un plat bien avec 4 500 pi de milieu de FIV (si vous utilisez 10 femelles superovulées, par exemple, vous aurez besoin de 2 puits...)
- Laver la vaisselle: une boîte de Petri de 35 mm avec 3 ml de simplex de potassium moyenne optimisée (KSOM) pour le lavage dans chaque puits de l'antenne 4-FIV ainsi utilisée
- Boîte de culture: une boîte de Petri de 35 mm avec 50 gouttes ul de milieu KSOM recouvert d'huile pour la culture d'embryons de chaque puits de la parabole de FIV.
- Suppression d'une paille de LN 2 et placer dans un bain à 37 ° C l'eau pendant 2-3 minutes.
- Retirez la paille du bain d'eau et essuyez pour enlever l'excès d'eau. Faire la première coupe à proximité de la colonne de First Air le plus proche du bouchon de coton. Couper la paille au milieu de FIV il y aura encore une colonne d'air visibles avant que la colonne de sperme.
- Ensuite, couper l'extrémité de la paille dans le seuxièmement l'air colonne, en prenant soin d'éviter de couper la colonne de sperme. Couper à un angle de 45 - ce qui rendra beaucoup plus facile à aspirer le sperme.
- Aspirer la suspension de spermatozoïdes à partir de l'extrémité distale de la paille avec une pipette 200 pi.
- Placer la suspension de spermatozoïdes dans le centre de la goutte de la STM et incuber le plat pendant 45-60 minutes dans un 37 ° C CO 2 5% incubateur.
- Durant l'incubation des spermatozoïdes, disséquer les oviductes des femelles superovulation dans le plat de coupe. Utiliser une aiguille de 30 g ou une pince pour arracher chaque oviducte, libérant les complexes cumulus-ovocytes (COC). Évitez les gras et du sang dans les moyennes FIV comme sale des médias fait pour les étapes de lavage supplémentaires.
- Une fois que tous les oviductes ont été arrachés, le transfert du COC à partir de 5 femelles à chaque puits de FIV. Le nombre de COC produite par superovulation est très dépendante de contrainte.
- Recueillir 10-15 ul de sperme de la périphérie de la goutte STM et fertiliser un FIV ainsi d'environ 14-16 heures après l'hCG injection. Répétez la fertilisation pour chaque puits utilisé. Concentration du sperme final sera d'environ 1 million / ml.
- Spermatozoïdes et des ovocytes coculture pendant 4-6 heures dans un 37 ° C 5% CO 2 incubateur.
- Laver les embryons avec KSOM un minimum de 2 fois et la culture en gouttes KSOM pour le développement dans un 37 ° C 5% CO 2 incubateur.
- Taux de fécondation in vitro a été calculé que deux embryons au stade de cellules à des ovocytes totale utilisée, après une nuit de culture.
4. Les résultats représentatifs
Le sperme de 5 souches de souris Charles River, consanguins a été gelé. Les rapports de protection sont calculés en divisant les valeurs d'évaluation congelés sperme frais valeurs d'évaluation du sperme. Rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes ont été de 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% pour C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCRL, DBA/2NCrl, et BALB / cAnNCrl, respectivement. Rapports de protection pour la motilité progressive rapide ont été de 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas LCR, FVB / NCRL, DBA/2NCrl, et BALB / cAnNCrl, respectivement (figure 1).
Le taux de fécondation in vitro avec du sperme congelé-décongelé ont été de 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% et 26,2% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCRL, DBA/2NCrl, et BALB / cAnNCrl, respectivement (figure 2) .
Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme. Ces lignes ont ensuite été récupéré avec succès (tel que défini par les chiots nés vivants) par FIV en quatre souches femelles (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 et 129Sv) (Fig. 3).
Figure 1. Les rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes et la motilité progressive rapide chez la souris
Figure 2. Fécondation in vitro avec du sperme congelé-décongelé chez la souris
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Figure 3. Fécondation in vitro avec du sperme congelé-décongelé dans des souris transgéniques
Discussion
Depuis 1990, le protocole de sperme base de gel en utilisant le raffinose 18% et 3% de lait écrémé a été prouvé fiable dans de nombreuses souches de souris et un grand nombre de lignées de souris ont été cryoconservés 1,2,3,4,5,6,7. Les principales causes de dommages aux cellules du sperme pendant le processus de congélation et de décongélation ont été associés à la formation de glace et de 8,9 espèces réactives de l'oxygène 10. La supplémentation avec piégeurs de radicaux libres, tels que des acides aminés, et les agents réducteurs, tels que monothioglycérol, dans le milieu de congélation a été étudiée et prouvée d'augmenter substantiellement le taux de FIV avec du sperme congelé-décongelé dans des souches consanguines y compris les C57BL / 6 11,6.
Dans le présent protocole, nous avons développé un nouveau I • Cryo kit pour la cryoconservation du sperme de souris en optimisant le CPA avec base disponibles dans le commerce des antioxydants et les inhibiteurs de la glace et en modifiant le point de congélation du sperme et la procédure de FIV. Rapports de protection de la motilité des spermatozoïdes(> 60%) et la motilité progressive rapide (> 45%) ont été observés pour les spermatozoïdes à partir de cinq souches de souris consanguines congelés avec le kit I • Cryo. Le taux de 2-cellules stade embryonnaire de développement avec du sperme congelé-décongelé en 5 souches de souris consanguines a été nettement améliorée par rapport à celui avec base CPA 11,6.
En utilisant la trousse, l'utilisateur crée une suspension de spermatozoïdes du sperme concentré par congélation de 2 hommes pour chaque ligne. En seulement 15 pailles de congélation le processus est rapide, facile et occupe moins d'espace de stockage pour l'entreposage à court ou à long terme. La plupart du temps, des lignées de souris peuvent être récupérées par le dégel seulement 1 ou 2 pailles.
Disclosures
Les auteurs sont des employés de Charles River, le fabricant de ce kit.
Acknowledgments
La recherche présentée ici a été soutenue par Charles River. Les auteurs sont très reconnaissants à l'Modèles génétiquement modifiés et le groupe Services et le personnel de l'embryologie pour les soins des animaux et l'injection d'hormones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
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