Summary
Aqui demonstramos a recém-desenvolvida I • kit Cryo para mouse criopreservação de esperma. Duas células desenvolvimento embrionário palco com descongelado esperma foi melhorado consistentemente em cinco linhagens de camundongos com a utilização deste kit. Durante um período de 1,5 anos, 49 linhas de camundongos geneticamente modificados foram arquivados por criopreservação de espermatozóides com a Cryo kit • I e mais tarde recuperados com sucesso por fertilização in vitro.
Abstract
Milhares de novos geneticamente modificados (GM) linhagens de camundongos foram criados desde o advento das tecnologias de transgênese e knockout. Muitos desses animais valiosos existem apenas como animais vivos, sem plano de backup em caso de emergência. Criopreservação de embriões pode fornecer esta cópia de segurança, mas é caro, pode ser um processo lento, e geralmente requer um grande número de animais para o sucesso. Desde a descoberta que o esperma do mouse podem ser criopreservados com sucesso com um agente básico crioprotectores (CPA), constituído por rafinose 18% e 3% de leite desnatado, a criopreservação de esperma tornou-se um procedimento aceitável e de baixo custo para arquivamento, distribuição e recuperação dessas cepas valiosa .
Aqui demonstramos um recém-desenvolvido I • kit Cryo para mouse criopreservação de esperma. Esperma de cinco cepas comumente usados de camundongos isogênicos foram congelados utilizando este kit e depois se recuperou. Maior proteção dos rácios de motilidade espermática (>60%) e motilidade progressiva rápida (> 45%) em relação ao controle (básico CPA) foram vistos por esperma congelado com este kit em 5 linhagens de camundongos inbred. Duas células desenvolvimento embrionário palco após a fertilização in vitro com o esperma recuperado foi melhorado de forma consistente em todas as cinco linhagens de camundongos examinados. Durante um período de 1,5 anos, 49 linhas do mouse GM foram arquivados por criopreservação de espermatozóides com a Cryo kit • I e mais tarde recuperado por fertilização in vitro.
Protocol
1. Criopreservação de esperma do mouse
- Para cada linha a ser criopreservados, prepare o seguinte antes de começar.
- Um bem de um prato 4-bem com 240 l de kit CPA
- 15 de esperma palhas de criopreservação da seguinte forma
- Conecte a 0,25 ml palhas para a 1 ml seringas com o tampão de algodão mais próximo à seringa. Em cada palha, carga de 8 cm (aproximadamente 160 L) de meio de fertilização in vitro, em seguida, um centímetro de ar. Rotular os canudos com o nome da linha a ser preservado.
- LN 2 deve ser de 15 cm de profundidade na caixa de espuma. Feche a tampa.
- Euthanize dois camundongos machos de cada linha a ser criopreservados. Ratos deve estar entre 10 e 60 semanas de idade. Remova os dois epidídimos caudal juntamente com o canal deferente de cada rato.
- Coloque o epidídimos no CPA previamente preparado contendo além de um prato 4-bem (passo 1.1).
- 07/05 fazer cortes longitudinais em cada epidídimo e gentilmenteespremer cada vaso deferente para empurrar os espermatozóides para fora.
- Agitar a mistura de CPA e epidídimo com a mão suavemente em temperatura ambiente por 3-5 minutos. Isto permitirá que os espermatozóides de nadar para fora.
- Usando a palha preparada anteriormente, aspirado 5 mm (aproximadamente 10 ml) de suspensão de esperma e depois de 1 cm de ar.
- Repita esse processo com até um total de 15 canudos. De carga e lacre canudos dentro de 10 minutos para a sobrevivência melhor esperma.
- Sele ambos os lados da palha com cuidado. Coloque as palhetas na caixinha de congelamento com a coluna de esperma em primeiro lugar.
- Anexar a pipeta de 1 ml fornecidos como parte do kit para a caixinha para estender a alça. Coloque o recipiente em LN 2 na caixa de espuma através do furo na tampa. Permitir que o recipiente para flutuar verticalmente na LN 2 para 10 minutos.
- Mergulhe o canister no LN2. O esperma é agora criopreservados e pode ser movido para longo prazo LN 2 de armazenamento.
- O recipiente não deve ser usado paraa próxima linha até que ele é aquecido à temperatura ambiente.
2. Superovulação do mouse
- Geralmente, o uso camundongos fêmeas jovens da mesma origem que os doadores de esperma.
- Ratos deve ser ~ 12 g (3-4 semanas de idade).
- Realizar uma injeção intraperitoneal com UI de Pregnant mare 10/05 gonadotrofina sérica (PMSG).
- Aguarde 46-48 horas.
- Realizar uma injeção intraperitoneal com UI 10/05 da gonadotrofina coriônica humana (hCG).
- Oócitos colheita h após a injeção de hCG 14-16, conforme descrito abaixo.
3. Recuperação do mouse esperma e fertilização in vitro
- Antes de fertilização in vitro, para cada palha para ser descongeladas, prepare o seguinte e estabilizar pelo menos uma hora em 37 ° C incubadora de CO 2.
- Prato de esperma de incubação: uma placa de Petri 35 milímetros, com uma queda de 90 mL de meio de esperma tratamento (STM) coberto com óleo.
- Corte prato: Para a coleta de oócitos de um máximo de 10 superovulated fêmeas, uma 35 milímetros placa de Petri com 3 ml de meio de fertilização in vitro.
- IVF bem: Para cada grupo de 5 fêmeas superovuladas para fertilização in vitro, um bem de um prato 4 bem com 500 mL de meio de fertilização in vitro (se você estiver usando 10 fêmeas superovuladas, por exemplo, você vai precisar de 2 poços...)
- De lavar loiça: uma 35 milímetros placa de Petri com 3 ml de meio de potássio simplex otimizado (KSOM) para lavar cada poço da placa IVF-4 bem utilizado
- Placa de cultura: um 35 milímetros placa de Petri com 50 mL de meio de gotas KSOM coberto com azeite, para cultura de embriões a partir de cada poço da placa IVF.
- Remover uma palha de LN 2 e coloque em banho-maria a 37 ° C por 2-3 minutos.
- Remover a palha do banho de água e limpe a remover o excesso de água. Fazer o primeiro corte perto da coluna de ar mais próxima primeiro o tampão de algodão. Cortar a palha no meio de fertilização in vitro ainda haverá uma coluna de ar visíveis antes da coluna de esperma.
- Em seguida, corte a ponta do canudo na sEGUNDA coluna de ar, tendo o cuidado de evitar o corte da coluna de esperma. Cortada num ângulo de 45 - isto irá tornar muito mais fácil para aspirar o espermatozóide.
- Aspirar a suspensão de espermatozóides a partir da extremidade distal da palha com uma pipeta de 200 mL.
- Lugar a suspensão de espermatozóides no centro da gota STM e incubar o prato por 45-60 minutos em 37 ° C de 5% CO 2 incubadora.
- Durante a incubação de espermatozóides, dissecar os ovidutos das fêmeas superovuladas no prato de corte. Use uma agulha de 30 g ou uma pinça para arrancar cada oviduto, liberando os complexos cumulus-oócito (COCs). Evite gordura e sangue no meio de fertilização in vitro como sujos mídia faz para as etapas de lavagem extra.
- Depois que todos os ovidutos foram rasgadas, transferir o COCs de 5 mulheres para cada poços de FIV. O número de COCs produzidos por superovulação é muito tensão dependente.
- Coletar 10-15 mL de esperma a partir da periferia da queda STM e fertilizar uma fertilização in vitro bem aproximadamente 14-16 horas pós-inj hCGç ã o. Repita a fertilização para cada bem utilizados. Concentração espermática final será aproximadamente 1 milhão / ml.
- Co-cultura de esperma e ovócitos para 4-6 horas a 37 ° C de 5% incubadora de CO 2.
- Lavar os embriões com KSOM um mínimo de 2 vezes e cultura em gotas KSOM para o desenvolvimento de um 37 ° C de 5% incubadora de CO 2.
- Taxa de fertilização in vitro foi calculada como dois embriões de células estágio de oócitos total utilizada após cultura durante a noite.
4. Resultados representante
Esperma de cinco Charles cepas puras Rio rato foi congelado. Relações de proteção são calculadas dividindo-se os valores de avaliação do esperma congelado por valores nova avaliação do esperma. Razões de protecção da mobilidade do esperma foram 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% para C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, respectivamente. Relações de proteção para a motilidade progressiva rápida foram 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% em C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, respectivamente (Fig. 1).
As taxas de fertilização in vitro com os espermatozóides congelados e descongelados foram 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% e 26,2% em C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, respectivamente (Fig. 2) .
Durante um período de 1,5 anos, 49 linhas do mouse GM foram arquivados por criopreservação de esperma. Estas linhas foram mais tarde recuperados com sucesso (como definido pela filhotes nascidos vivos) por FIV em 4 cepas do sexo feminino (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 e 129Sv) (Fig. 3).
Figura 1. Rácios de Proteção da motilidade espermática e motilidade progressiva rápida em Ratos
Fertilização Figura 2. In Vitro com esperma congelado-descongelado em Ratos
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Figura 3. Fertilização in vitro com esperma congelado-descongelado em camundongos GM
Discussion
Desde 1990, o protocolo de congelamento de esperma básica usando rafinose 18% e 3% de leite desnatado provou ser confiável em muitas cepas de camundongos e um grande número de linhas do mouse foram criopreservados 1,2,3,4,5,6,7. As principais causas de danos às células de esperma durante o congelamento e descongelamento processo têm sido associados com a formação de gelo 8,9 e espécies reativas de oxigênio 10. Suplementação com varredores de radicais livres, tais como aminoácidos e agentes redutores, tais como monotioglicerol, no meio de congelamento foi investigada e comprovada para aumentar substancialmente a taxa de fertilização in vitro com os espermatozóides congelados e descongelados em linhagens puras, incluindo a C57BL / 6 11,6.
No protocolo atual, que desenvolveu um novo I • Cryo kit de criopreservação de esperma do mouse através da otimização do CPA básica com antioxidantes comercialmente disponíveis e bloqueadores de gelo e modificando o congelamento de espermatozóides e procedimento de fertilização in vitro. Razões de protecção da motilidade espermática(> 60%) e motilidade progressiva rápida (> 45%) foram observados para o esperma de cinco linhagens de camundongos inbred congelados com a Cryo • Eu kit. O 2-célula estágio taxa de desenvolvimento do embrião com esperma congelado-descongelado em 5 linhagens de camundongos inbred foi marcadamente melhorado em comparação ao que, com base CPA 11,6.
Ao utilizar o kit, o usuário cria uma suspensão de espermatozóides concentrado por congelamento de esperma 2 machos para cada linha. Por apenas 15 canudos de congelamento do processo é rápido, fácil e ocupa menos espaço de armazenamento para o armazenamento de curto ou longo prazo. Na maioria das vezes, as linhas do mouse podem ser recuperados por descongelamento apenas 1 ou 2 canudos.
Disclosures
Os autores são funcionários da Charles River, o fabricante deste kit.
Acknowledgments
A pesquisa aqui apresentada foi apoiada por Charles River. Os autores são muito gratos ao Modelos Geneticamente Modificadas e grupo de serviços e os funcionários Embriologia para cuidar dos animais e injeção de hormônio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPA | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| STM | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River Laboratories | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | EMD Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon BD | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nalge Nunc international | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson, Inc. | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR international | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| hCG | Intervet Inc. | ||
| PMSG | EMD Millipore | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD Biosciences | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
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