Summary
2-foton mikroskopi son gelişmeler, gerçek zamanlı sağladı
Abstract
Lenf nodları (LN), stratejik adaptif immün yanıtı asal periferik dokularda yabancı antijenleri yakalama ve sunum için izin vermek için vücutta bulunan ikincil lenfoid organlara. Doğal ve adaptif immün yanıtları arasındaki yan yana, LN, bağışıklık hücre etkileşimleri 1,2 çalışmak için ideal bir yerdir. Lenfositler (T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri), dendritik hücreler (DC), makrofaj, kemik iliği kaynaklı LN hücresel elemanlar toplu oluşmaktadır. Bu hücreler stratejik, öz antijenleri ve potansiyel yabancı antijenlere 3-5 verimli tarama izin LN konumlandırılmıştır. Lenfositler başarıyla soydaş antijen karşı karşıya tarafından son yıllarda yoğun bir araştırma süreci bir konudur ve antijen reseptörleri, adezyon molekülleri, kemokinler ve böyle fibro-retiküler ağ 2,6-12 gibi stromal yapılar da dahil olmak üzere moleküler kişileri bir entegrasyon içerir .
Önce sadece morfoloji, konumu ve mimarisi ile ilgili cevaplar sunuyor in vivo görüntüleme, statik görüntüleme dayanıyordu araştırmacılar, yüksek çözünürlükte gerçek zamanlı floresan gelişimi. Bu soruların immün hücre davranışı anlayışımızın temel olmakla birlikte, bu teknik ile içsel sınırlamaları deşifre lenfosit trafiği ve dinamik hücre davranışını etkileyen çevresel ipuçlarını analiz izin vermez. Son zamanlarda, intravital gelişimi iki-foton lazer tarama mikroskobu (2P-EKK) araştırmacılar, 12-16 yerinde canlı LN içinde dinamik hareketler ve bireysel hücrelerin etkileşimlerini görüntülemek için izin verdi. Özellikle, biz ve diğerleri çeşitli doku alt yapıları 11,17-18 ile kompakt, doğada büyük bir doku alana multipleks veri toplama avantajı sunuyor popliteal LN, içinde görüntü hücresel davranış ve etkileşimler bu tekniği uyguladık . Bu iönemlidir bu tekniğin kan bozulması, lenf akışı ve sistemin eninde sonunda hücresel dinamikleri gerektiren eksplante doku görüntüleme teknikleri üzerine ilave avantajlar sunuyor unutmayın. Ayrıca, eksplante dokuları doku, eksplant sonra görüntüleme için geçerli olmaya devam eden bir zaman çok sınırlı bir pencere var. Hayvan çevre koşullarına uygun hidrasyon ve izleme sayesinde, görüntüleme süresi önemli ölçüde bu intravital tekniği ile uzatılabilir. Burada, gerçekleştirme intravital görüntüleme amacıyla, fare popliteal LN hazırlamak için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır.Protocol
1. Fare Tutucu Meclisi
- Kapak aşağı bakan bir 100-mm plastik Petri kapağı üstüne bir 100-mm cam Petri Overlay. Zorlukla cam, plastik çanak merkez noktası dokunmadan edilmelidir. Cam kullanarak bir şablon gibi, plastik tabak üzerine bir iz iz.
- Bir hilal şeklinde bir platform oluşturmak için bir 100-mm plastik tabak kapağı bir kısmını kaldırmak için bir el matkabı (yani Dremel) kullanın. Bu hilal şekilli plastik kapak fare (Şekil 1a) üst gövde için bir destek olarak hizmet verecek. Hilal şeklinde kapak gaz maskesi bir metal büküm kravat ile güvence altına iki delik delin. Süper yapıştırıcı veya eşdeğer güçlü bir yapıştırıcı (Şekil 1b) kullanarak cam Petri kenarına plastik kapak sabitleyin.
- Tutkal kubbeli iki kapaklı PCR tüpleri (menteşe kesilmiş) 1 cm arayla, popliteal deri flepleri demirlemenin amaç için alt çanağı merkezi kapaklar.
2. Fare Hazırlık
3. Cerrahi 4. 2-Foton Görüntüleme Toplama ** . ** Cerrahi Bu prosedür ayrıca, diğer şekillerde, diğer 2P-LSM den intravital görüntüleme için faydalı olabilir. 5. Temsilcisi Sonuçlar Çeşitli dolaşan bağışıklık hücreleri evlatlık transferi sonrasında farklı oranlarda LN alınırlar. CD4 + ve CD8 + lenfositlerin, bu hücreler 2 ila 4 saat sonra 6,17-18, popliteal LN gelen önemli sayıda iv transferinden sonra yüksek endotelyal venül (HEV) dakika ile LN gelmeye başlar. B cel içinls, önemli bir sayı 8 ila 24 saat sonra, 19 birikebilir. Aktif, DC'ler ayak tabanına enjekte 3,11,16-17 drenaj popliteal LN 8 ila 16 saat içinde görünmeye başlar. Şekil 2a diğer önemli yerleri bile olmadan, B hücresi folikül gibi yapılarda 2P-EKK 19 altında görülebilen yuvarlak küresel hücre birikimi ile kolayca ayırt edilebilir olduğunu gösterir. Ubikuitin-GFP splenositlerin (Şekil 2, Ek Videolar 1 ve 2) gibi endojen bir flüoresan raportör kullanarak, bir uyarıcı fizyolojik olmayan koşullarda haftada bir gün için bu lenfosit göçler ve davranışları izleyebilirsiniz. Multi-kanal yüksek hassasiyetli dedektörler sayesinde, birden fazla cep telefonu ortakları 17,19 arasında yapısal bilgilerin yanı sıra etkileşim dinamikleri kapsayan bir multipleks görüntüleme veri elde etmek mümkündür. cerrahi tekniklerin düzgün bir şekilde yürütülen ve çevre koşulları dikkatle izlenmelidir, lymphocytes karakteristik göç hızı, başka 13-14,16 Şekil 2c, 2d ve gösterildiği gibi sergilemesi gerekir. Lenfositler de göç hızı LN uygulanan görüntüleme alt-bölgelere göre farklılık gösterebilir, kan damarları (gemi boyalarının giriş vurgulanır) kadar ek yerlerinden genel görüntü kalitesi (örneğin, uygun sıcaklık kontrolü belirlemenize yardımcı olacaktır , LN, vb minimal travma) 3,6,20. Ek Video 1, Şekil 2 'de anlatıldığı gibi bir fare popliteal LN Zaman aralıklı intravital 2P-LSM görüntüleme. Toplam 1x10 7 lenfositler izole edildi from bir ubikuitin-GFP + donör fare ve C57BL / 6 alıcının fare içinde bir görüntüleme 24 saat önce damardan aktarılmasına adoptively. Xy (750 mm x 750 mm) bir dizi her 20 saniyede tekrarlanan bir xyz görüntüleme yığını (750 mm x 750 mm x 65 mm), floresans görüntüler elde etmek için sabit z yığınlarının (5 mikron adım, 13 adım) üzerinden alındı toplam 60 dakika, hız analizi (Şekil 2c, 2d) için bir xyzt görüntüleme sırası ile sonuçlanır. Çalma hızı = 450x. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Zaman damgası = dk: sn. ek video izlemek için buraya tıklayın . Ek B hücreli folikülü Kilavuz Video 1 görüntüleme dizisi görünümü Yakınlaştırırken - Video 2 T hücre bölgesine sınır. Çalma hızı = 450x. Ölçek çubuğu = 25 mikron. Zaman damgası = dk: sn Cek video izlemek için buraya yalamak.
Şekil 1. Fare popliteal LN Görüntüleme için bir fare sahibinin İnşaat) fare sahibinin montaj Şemalar; b) Temsilcisi intravital fare hazırlanması; c) Tamamlanan fare tutucu grubunu; d) cerrahi maruz kaldıktan sonra popliteal LN görünümleri kapatın.
Şekil 2. GFP + lenfositlerin Göç analizipopliteal LN. (a) 6 / C57BL alıcı fare, popliteal LN 2P-EKK görüntüleme dizisi alınan 3D anlık adoptively öncesi görüntüleme ile 1x10 7 GFP + lenfositlerin 1 gün transfer. Dash çizgi B hücreli köklerinin sınır ifade eder; (b) 1 saat boyunca sürekli görüntüleme lenfosit göç Tracks; genel lenfosit göç hızı c) Dağıtım. Ortalama hız = 10.04 ± 4.26 mm / dak (incelendi 15.125 parça toplam), d) B hücresi folikül hücreleri Diferansiyel hücresel göç hız dağılımı (açık çubuklar; ortalama toplam 1.525 parça incelendi; hız = 8.79 ± 3.90 mm / dak ) ve T hücre bölgesi (kapalı bar, ortalama hız = 13.77 ± 5.93 mikron / dk; toplam analiz 1.250 parçaları). Ölçek çubuğu = 50 mikron.
Discussion
In vivo dinamik hücresel davranış çalışmada artan bir ilgi özellikle situ görüntüleme teknikleri, 2P-EKK, yüksek çözünürlüklü son gelişmeler eşlik etmiştir. Canlı bir farenin popliteal LN 4D görüntüleme tekniği, bağışıklık hücrelerinin undisrupted doku mikro-çevre içinde dinamik davranışı, bu tür analizlere olanak sağlar. Tüm görünür spektrum yayılan birden fazla dedektörleri ile 2P-EKK kullanımı, aynı anda birden fazla hücre popülasyonlarının görüntüleme veri toplama izin verir. Bu şimdi kullanımını, organik floresan hücre boyalarının kullanılarak etiketli farklı hücre popülasyonlarının adoptif transferi ile birleştirilmiş hücre vivo-belirli bir flüoresan raportör fareler (örn. Ubiquitin-EGFP, RFP, ya da-eCFP) kullanımı ile elde edilebilir (örn. KAKE , SNARF-1 ve, LN içinde hücresel mekanizmaları ve işlevini incelemek için Hücre Tracker Turuncu). Farklı izlenir c arasındaki etkileşimler doğrudan gözlem ek olarakell nüfus, multipleks görüntüleme veri kümesi hücre davranış ve işlevi daha aydınlatmak için piyasada bulunan görüntü işleme yazılım programlarını (örneğin Imaris, BitPlane Inc) ile daha fazla analiz geçirebilmektedir. Olanakları geniş bir dizi, bu in vivo ve siliko teknikleri kullanarak hücresel etkileşim mekanizmaları incelemek için var.
Burada açıklanan deneysel yaklaşımın ana sınırlama cerrahi yaklaşım içinde doğasında olan teknik karmaşıklığı. Bu teknikle ilgili anatomi ve kesin bir teknik prosedürleri ve bu protokol gereği becerileri aşina olmak için sıkı bir eğitim gerektirir. Daha da karmaşık hale faktörler LN keşif sırasında doku hasarı en aza indirmek için zorluk, görüntüleme sırasında doku kararlılığını optimize eder ve önce LN termal ve lazer hasarı önlemede ve görüntüleme deney sırasında içerir. Bu faktörlerin biri Tedirgeme optimal daha az lenf neden olacaktırocyte motilite ve bu nedenle görüntüleme verileri analizler sonucunda uygun şekilde yorumlanması ile engel olacaktır.
Disclosures
Yazarlar, ifşa etmek için bir şey gerekmez.
Acknowledgments
Bu çalışma, NCI 1R01CA154656 NIAID 1R21AI092299, Kanser Araştırma Enstitüsü, St. Baldrick Vakfı, Dana Vakfı, Gabrielle Angel Vakfı ve Amerika Hyundai Motors "Umut-on Wheels" Programı hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane, USP | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Nair - hair removal lotion | Nair | ||
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV | |
Heating pad | Watlow | ||
Heating Pad Controller | Watlow | ||
Air and O2 | Airgas | ||
Temperature probe | Harvard Apparatus | ||
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 | |
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 | |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
References
- Bousso, P. T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies. Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).
- Germain, R. N. Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging. Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).
- Huang, A. Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
- Stefanova, I. Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes. Nature. 420, 429-434 (2002).
- Stefanova, I. On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen. Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).
- Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
- Celli, S. Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo. Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).
- Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes. Immunity. 25, 867-869 (2006).
- Worbs, T. CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo. J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).
- Bajenoff, M. byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).
- Mempel, T. R. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- von Andrian, U. H., Mempel, T. R. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).
- Castellino, F. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
- Halin, C. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Qi, H. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science. 312, 1672-1676 (2006).
- Germain, R. N. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).