Intravital Imaging av Mouse popliteal lymfeknute

Summary

Nylige fremskritt innen to-foton mikroskopi har aktivert sanntid

Abstract

Lymfeknuter (LNS) er sekundære lymfoide organer, som er strategisk plassert over hele kroppen for å tillate fangst og presentasjon av utenlandske antigener fra perifert vev til prime den adaptive immunresponsen. Sidestilt mellom medfødte og ervervede immunresponser, er det LN et ideelt sted å studere immunceller interaksjoner ^1,2. Lymfocytter (T-celler, B-celler og NK-celler), dendrittiske celler (DCS), og makrofager utgjør hoveddelen av benmarg-avledet cellulære elementer av LN. Disse cellene er strategisk plassert i LN for å tillate effektiv overvåking av selvtillit antigener og potensielle utenlandske antigener ^3-5. Den prosessen som lymfocytter vellykket møte beslektet antigener er en gjenstand for intens etterforskning i de senere årene, og innebærer en integrasjon av molekylære kontakter, inkludert antigen reseptorer, adhesjonsmolekyler chemokines og stromale strukturer som fibro-retikulære nettverk ^2,6-12 . Før utviklingen av høyoppløste sanntid fluorescerende in vivo imaging, etterforskere støttet seg på statiske bilder, som bare gir svar om morfologi, plassering og arkitektur. Selv om disse spørsmålene er grunnleggende i vår forståelse av immun celle atferd, ikke begrensningene iboende med denne teknikken ikke tillater analyse for å dechiffrere lymfocytt menneskehandel og miljømessige ledetråder som påvirker dynamisk celle atferd. Nylig har utviklingen av intravital to-foton laser scanning mikroskopi (2P-LSM) har gjort etterforskere for å vise dynamiske bevegelser og vekselvirkninger enkelte celler i løpet av live LNS in situ ^12-16. Spesielt har vi og andre brukt denne teknikken til bildet mobilnettet atferd og interaksjoner innen popliteal LN, hvor den kompakte, tette naturen byr på fordelen av multipleks datainnsamling over et stort vev område med ulike vev sub-strukturer ^11,17-18 . Det jeger viktig å merke seg at denne teknikken gir ekstra fordeler over eksplanterte vev imaging teknikker som krever forstyrrelser av blod, lymfe flyt, og til slutt de cellulære dynamikken i systemet. I tillegg eksplanterte vev har en svært begrenset tidsvindu der vev forblir levedyktig for avbildning etter eksplantering. Med riktig fuktighet og overvåking av dyrets miljøforhold, kan bildebehandling tid bli betydelig lengre med denne intravital teknikken. Her presenterer vi en detaljert metode for å forberede mus popliteal LN for utøvelse av intravital bildebehandling.

Protocol

1. Mus Holder Montering

1. Overlappe cover av en 100-mm glass petriskål på toppen av en 100-mm plast petriskål lokket vendt nedover. Glasset bør være knapt berøre midtpunktet av plast parabolen. Bruke glasset som en sjablong, spore et merke på plast fatet.
2. Bruk en hånd drill (dvs. Dremel) for å fjerne en del av en 100-mm plast rett lokk for å lage en halvmåneformet plattform. Dette halvmåneformede plastlokk vil fungere som en støtte for overkroppen av musen (Figur 1a). Bor to hull på den halvmåneformede lokk til fester gassmaske med en metall vri slips. Fest plastlokk til kanten av glasset petriskål med superlim eller en ekvivalent sterkt lim (Figur 1b).
3. Lim lokkene av to hvelvet-cap PCR rør (kuttet på hengslet) 1 cm fra hverandre på midten av den nederste fatet for å forankre knehasecyste hud klaffer.

2. Mus Forberedelse

1. Anesthetize musa med isofluran (2 til 2,5% for induksjon, 1,5 til 2% for kirurgi / imaging) tilsatt i 1:1 O _2: luft blandingen ved en strømningshastighet på 1L/min bruke en IACUC-godkjent prosedyre. Når musen er bedøvet, sikre en gass maske over nesen med tape. Avgjør om musa er helt bedøves ved manglende respons på tå og / eller hale klyper. Nivået av isofluran kan bli justert tilsvarende for å sikre at dyret er fullt bedøvet, med en jevn, ikke-arbeidet respirasjonsfrekvens mellom 60-80 åndedrag / min.
2. Bruk en elektrisk trimmer for å fjerne hår på høyre bakben og inguinal område av musen.
3. Børst bort løs hår og forsiktig bruk en beskjeden strøk Nair lotion på barbert området med en bomullspinne. Etter ett minutt av første søknad, fjerne Nair og rengjør eksponert hud med en fuktigpapirhåndkle. Kontroller at musen er ren og tørr før du fortsetter.
4. Lag en liten 2 til 3 mm snitt med saks på høyre kne for å avdekke extensor sene.
5. Påfør Vetbond langs midten av musen holderen der musen kropp og ben skal plasserast. Nøye sikre musen på holderen, med høyre kne ned, å eksponere riktig popliteal fossa. Sikre høyre kneet sene med Vetbond i mellom de 2 huden klaff holdere for å hjelpe stabilisere bildebehandling feltet.
6. Strekk og tape armene og venstre ben til den øvre plattformen av holderen.
7. Bruk en vri slips for å sikre gass masken på plass.
8. Plasser holderen under disseksjon mikroskop. LN må forbli helt i ro, uavhengig av pust bevegelse av musen. Derfor må det tas forholdsregler mens du utfører operasjonen for å optimalisere stabiliteten i beinet. Bestemme plasseringen av halen (typisk over hodet) som skal bidra til størststabilitet til høyre beinet og tape halen ned.

3. Kirurgi

1. Mens under disseksjonen omfang, opprettholde mus kroppstemperatur ved hjelp av en varmeovn eller en varmepute. For vellykket avbildning av popliteal LN, er det avgjørende å opprettholde riktig kroppstemperatur hele kirurgi, samt å bevare vev fuktighet ved stadig å bruke varm PBS til eksponert vev.
2. Steriliser huden med Betadine. Ved hjelp av steril saks, lage en midtlinjen snitt gjennom huden på høyre midten kalv, og fortsette å kutte vertikalt opp til den overlegne delen av høyre lår.
3. Lag to horisontale hud snitt på toppen av den vertikale snitt linjen for å lage hud klaffer på hver side.
4. Trekk og lim ned både hud klaffer med Vetbond. Trekke huden stram før søknad Vetbond vil fremme ben stabilitet, men sørg for at huden spenningen ikke occlude blodstrøm (dvs. endringer i vessel farge eller diameter). Fortsett å lime ned andre områder av huden for å sikre stabilitet i benet før utsette LN. Størrelsen på musen vil avgjøre hvor mye ekstra hud er nødvendig for å lim ned. Vanligvis vil større mus krever mer hud å være limt fast til holderen.
5. LN bør ligge innenfor popliteal fossa enten til høyre eller venstre for popliteal venen, avhengig av plassering av musen på holderen. Forsiktig skille LN fra omkringliggende fettvev og muskler ved hjelp av mikro-dissekere pinsett og pinsetter. For å minimere blødning og traumer, bruke splaying teknikker med mikro-dissekere pinsett til egne vev. Nøye utsett popliteal LN uten å risikere integriteten av afferent og efferent blodkar og de afferente lymfekar.
6. For ekstra vev stabilitet, kan en firkantet deksel glass plasseres over den fuktige LN, såvidt berører LN samtidig unngå fartøy okklusjon. Glasset kan være secured med modelleire på hver side av musen.
7. Fluorescerende fargestoffer fartøy av ulike størrelser (f.eks TRITC-dekstran, minimum 70kDa) kan bli innført intravenøst ​​på dette punktet for å hjelpe markere den strukturelle forhold og integritet LN under bildebehandling.

4. 2-Photon Imaging Acquisition **

1. Når LN er tilstrekkelig eksponert og stabilitet oppnås, umiddelbart overføre hele musa monteringsholderen på mikroskopet scenen utstyrt med en programmerbar temperatur tilbakemeldinger kontrollert varmepute i en miljømessig mikroskop kammer holdes på 37 ° C. Legg nok steril varmt (37 ° C) PBS eller HBSS å senke LN. Volumet vil variere avhengig av størrelse og plassering av musen. Alternativt kan varm PBS eller HBSS brukes direkte til dissekert LN gjennom en fin glass pipette montert på en peristaltiske pumpe og tapet til kolonnen for nedsenking objektivet målet. Flyten av væsken bør være slik at enstabil vannsøyle kan opprettholdes mellom linsen og vev.
2. Opprettholde PBS eller HBSS temperatur på 37 ° C ved hjelp av en varmepute med en tilbakemelding sonde. En separat temperaturføler skal plasseres i musen holderen for å bekrefte temperaturen på PBS i området 36,5 til 37,5 ° C. En rektal probe kan også brukes til å overvåke kjernen kroppstemperatur på den eksperimentelle musen hele bildebehandling økten.
3. Bruk en epi-lysrør å hjelpe LN plassering under målet. Tilegne fluorescerende image bunker med tidsintervaller som er aktuelle for ønsket mobilnettet interaksjon (typisk 10 sekunder til 1 minutt mellom hver xyz bildestakk).
4. Overvåke statusen til dyret i mikroskopet kammeret ofte ved visuell inspeksjon eller ved å bruke en dyr overvåkingssystem. Avgjør om musa er helt bedøves ved manglende respons på tå og / eller spiker klyper, og en jevn, ikke-arbeidet respirasjonsfrekvens mellom 60-80 breaths / min. Nivået av isofluran kan bli justert tilsvarende for å sikre at dyret er helt bedøvet. Med riktig overvåking og hydrering, kan dyrene bli fotografert i 4-6 timer, eller muligens lenger.
5. Etter bildebehandling eksperimentet, avlive dyret i en CO ₂ kammer ved hjelp IACUC-godkjent dødshjelp protokollen. Dyret bør ikke få lov til å dukke opp fra anestesi før avlivning.

** Det kirurgiske inngrepet kan også være nyttig for andre former for intravital bildebehandling annet enn 2P-LSM.

5. Representative Resultater

Ulike sirkulerende immunceller blir rekruttert til LN på ulike priser etter adoptiv overføring. For CD4 ⁺ og CD8 ⁺ lymfocytter, disse cellene begynner å komme i LN gjennom de høye endotelceller venule (HEV) minutter etter iv overføring med et betydelig antall som ankommer i popliteal LN etter 2 til 4 timer ^6,17-18. For B cells, vil et betydelig antall hope etter 8 til 24 timer ^19. Aktiverte utviklingsland bør begynne å vises i de drenering knehasecyste LN 8 til 16 timer etter footpad injeksjon ^3,11,16-17. Figur 2a viser at selv uten andre landemerker, kan strukturer som B-celle follikler skjelnes enkelt ved det runde sfæriske cellen opphopning synlig under 2P-LSM ^19. Bruke en endogen fluorescerende reporter eksempel ubiquitin-GFP splenocytes (figur 2, supplerende Videos 1 og 2), kan man spore disse lymfocytt vandring og atferd i flere dager opptil en uke under ikke-stimulerende fysiologiske forhold. Med multi-channel høy følsomhet detektorer, er det mulig å få en multiplex tenkelig datasett som omfatter strukturell informasjon samt samhandling dynamikk mellom flere cellulære partnere ^17,19.

Når de kirurgiske teknikkene er riktig utført og de miljømessige forholdene nøye overvåket, lymphocyTES skal fremvise karakteristisk migrasjon hastighet, som demonstrert i figur 2c, 2d og andre steder ^13-14,16. Lymfocytter kan også vise forskjeller i migrasjon hastighet avhengig av sub-regioner av LN gjennomgår bildebehandling, så vil flere landemerker som blodkar (som fremhevet av innføring av fartøyets fargestoffer) bidrar til å bestemme den totale bildekvalitet (dvs riktig temperatur kontroll , minimal traumer til LN, etc.) ^3,6,20.

Figur 1. Bygging av en mus holder for mus popliteal LN Imaging a) Skjematisk av mus monteringsholderen;. B) Representant intravital mus forberedelse, c) Fullført mus monteringsholderen, d) Nærbilde utsikt over popliteal LN etter kirurgisk eksponering.

Figur 2. Migrasjon analyse av GFP + lymfocytteri popliteal LN. (a) 3D øyeblikksbilde tatt fra 2P-LSM avbildning sekvens av popliteal LN i en C57BL / 6 mottaker mus adoptively overført med 1x10 ⁷ GFP ⁺ lymfocytter en dag før bildebehandling. Dash linje betegner grensen av B-celle follikler, (b) Tracks av lymfocytt migrasjon under en time med kontinuerlig avbildning, c) Fordeling av samlet lymfocytt migrasjon hastighet. Mean hastighet = 10,04 ± 4,26 mikrometer / min (totalt 15,125 spor analyserte), d) Differensial cellulær migrasjon hastighet distribusjon av celler som finnes i B-celle hårsekken (åpen bar; bety hastighet = 8.79 ± 3.90 mikrometer / min; totalt 1,525 spor analysert ) og T-celle sone (lukkede barer; bety hastighet = 13,77 ± 5.93 mikrometer / min; totalt 1250 låter analysert). Scale bar = 50 mikrometer.

Supplemental Video 1. Time-lapse intravital 2P-LSM avbildning av en mus popliteal LN som beskrevet i figur 2. Totalt 1x10 ⁷ lymfocytter ble isolert from en ubiquitin-GFP + donor mus og adoptively overført intravenøst ​​inn i en C57BL / 6 mottaker mus 24 timer før bildebehandling. En rekke xy (750 mikrometer x 750 mm) fluorescens bildene ble tatt gjennom fast z stabler (5 mikrometer trinn, 13 trinn) å gi en xyz avbildning stack (750 mikrometer x 750 mikrometer x 65 mm), som ble gjentatt hvert 20. sekund til sammen 60 minutter, noe som resulterer i en xyzt tenkelig sekvens for fart analyse (Tall 2c, 2d). Avspillingshastigheten = 450x. Scale bar = 50 mikrometer. Tidsangivelse = min: sek. Klikk her for å se supplerende video .

Supplemental Video 2 Zoomet-i lys av den bildebehandling sekvensen i Supplemental Video 1 på B celle hårsekken -. T-celle sone grensen. Avspillingshastigheten = 450x. Scale bar = 25 mikrometer. Tidsangivelse = min:. Sek Cslikke her for å se supplerende video.

Discussion

Nylige fremskritt i høy oppløsning i situ imaging teknikker, særlig 2P-LSM, har blitt ledsaget av en økende interesse for studiet av dynamiske mobilnettet oppførsel in vivo. Den 4D avbildningsteknikk på popliteal LN av en live mus tillater slike analyser i den dynamiske oppførselen til immunceller innenfor uforstyrret vev mikro-miljø. Bruken av 2P-LSM med flere detektorer som dekker hele synlige spekteret tillater simultan avbildning datainnsamling av flere celle populasjoner. Dette kan nå oppnås gjennom bruk av in vivo celle-spesifikke fluorescerende reporter mus (f.eks ubiquitin-eGFP,-RFP eller-eCFP) kombinert med bruk av adoptive overføring av differensielt merket celle populasjoner ved bruk av organiske fluorescerende fargestoffer celle (f.eks CFSE , SNARF-1, og Cell Tracker Orange) for å undersøke cellulære mekanismer og funksjon i LN. I tillegg til direkte observasjon av samspill mellom ulikt spores cell populasjoner, kan multipleks tenkelig datasett gjennomgå ytterligere analyse med kommersielt tilgjengelige bildebehandlingsmotoren programmer (f.eks Imaris, BitPlane Inc.) til ytterligere belyser celle atferd og funksjon. Et bredt spekter av muligheter som finnes for å studere cellulære mekanismer samhandling med disse in vivo og i silico teknikker.

Den viktigste begrensningen av eksperimentell tilnærming som beskrives her er den tekniske kompleksiteten som ligger i kirurgi tilnærming. Denne teknikken krever hardtrening for å bli kjent med relevant anatomi og de presise tekniske prosedyrer og ferdigheter som kreves av denne protokollen. Ytterligere kompliserende faktorer er vanskeligheten i å minimere vevskade under LN leting, optimalisere vev stabilitet under bildebehandling, og hindre termisk og laser skade på LN før og under bildebehandling eksperimentering. Perturbasjon til noen av disse faktorene vil føre til mindre enn optimal lymfeocyte motilitet og vil derfor forstyrre riktig tolkning av resulterende imaging dataanalyser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-773-60
Vetbond	3M	1469SB
Nair - hair removal lotion	Nair
PBS, 1X	Cellgro	21-040-CV
Heating pad	Watlow
Heating Pad Controller	Watlow
Air and O2	Airgas
Temperature probe	Harvard Apparatus
Tweezers Dumont #5	World Precision Instruments, Inc.	14101
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved	World Precision Instruments, Inc.	14141
Scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish	Corning	70165-102
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish	Corning	430167
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution)	Purdue Products L.P.	NDC 67618-150-08