Summary
Les progrès récents dans la microscopie 2-photons ont permis en temps réel
Abstract
Les ganglions lymphatiques (LNS) sont les organes lymphoïdes secondaires, qui sont stratégiquement situés à travers le corps pour permettre le piégeage et la présentation des antigènes étrangers à partir de tissus périphériques pour amorcer la réponse immunitaire adaptative. Juxtaposé entre innées et adaptatives des réponses immunitaires, la LN est un site idéal pour étudier les interactions cellules immunitaires 1,2. Lymphocytes (cellules T, cellules B et cellules NK), cellules dendritiques) et les macrophages constituent l'essentiel de la moelle osseuse provenant d'éléments cellulaires de la LN. Ces cellules sont stratégiquement positionnés dans le LN pour permettre une surveillance efficace des antigènes du soi et le potentiel des antigènes étrangers 3-5. Le processus par lequel les lymphocytes succès rencontrent des antigènes apparentés est un sujet d'intenses recherches ces dernières années, et implique une intégration des contacts moléculaires, y compris des récepteurs d'antigènes, des molécules d'adhésion, les chimiokines, et les structures du stroma comme le réseau fibro-réticulaire 2,6-12 . Avant le développement de la haute résolution en temps réel fluorescente imagerie in vivo, les enquêteurs comptaient sur l'imagerie statique, ce qui ne propose que des réponses concernant la morphologie, la position et l'architecture. Bien que ces questions sont fondamentales dans notre compréhension du comportement des cellules du système immunitaire, les limites intrinsèques de cette technique ne permet pas l'analyse de déchiffrer le trafic des lymphocytes et des indices environnementaux qui influent sur le comportement dynamique des cellules. Récemment, le développement de intravitale à deux photons microscopie à balayage laser (2P-LSM) a permis aux enquêteurs de voir les mouvements dynamiques et les interactions des cellules individuelles dans les ganglions vivantes en 12-16 in situ. En particulier, nous et d'autres ont appliqué cette technique à un comportement d'image cellulaire et interactions au sein de la poplitée LN, où sa compacte, la nature dense offre l'avantage de multiplex d'acquisition de données sur une zone de tissu avec des tissus divers grande sous-structures 11,17-18 . Il is important de noter que cette technique offre des avantages supplémentaires sur les techniques d'imagerie des tissus explantés, qui exigent la perturbation du sang, circulation de la lymphe, et, finalement, la dynamique cellulaires du système. En outre, les tissus explantés ont une fenêtre de temps très limitée dans laquelle le tissu reste viable pour l'imagerie après explantation. Avec une bonne hydratation et la surveillance des conditions environnementales de l'animal, l'imagerie en temps peut être considérablement étendu avec cette technique intravitale. Ici, nous présentons une méthode détaillée de la préparation de la souris poplitée LN dans le but d'effectuer l'imagerie intravitale.
Protocol
1. Assemblée porte-souris
- Superposez le couvercle d'un plat en verre de 100 mm sur le dessus de Petri de 100 mm couvercle de boîte de Petri en plastique vers le bas. Le verre doit être touchant à peine le point de centre de l'assiette en plastique. Utilisation de la vitre comme un pochoir, tracer une marque sur le plat en plastique.
- Utilisation d'une perceuse à main (c.-à-dermiques) pour enlever une partie d'un couvercle plat de 100 mm plastique pour créer une plate-forme en forme de croissant. Ce couvercle en plastique en forme de croissant se servir de support pour la partie supérieure du torse de la souris (figure 1a). Percez deux trous sur le couvercle en forme de croissant pour assurer le masque à gaz avec une attache en métal. Fixez le couvercle en plastique sur le bord du plat en verre de Petri en utilisant la super glue ou un adhésif de manière équivalente forte (figure 1b).
- Coller les couvercles en forme de dôme de deux tubes PCR bouchon (coupés à la charnière) 1 cm de distance au centre de la cuvette inférieure dans le but de rabats d'ancrage de la peau poplités.
2. Préparation de la souris
3. Chirurgie 4. 2-Photon Imaging Acquisition ** ** Cette procédure chirurgicale peut aussi être utile pour d'autres formes d'imagerie intravitale autre que 2P-LSM. 5. Les résultats représentatifs Diverses cellules immunitaires circulantes sont recrutés à la LN à des taux différents suivant le transfert adoptif. Pour CD4 + et CD8 + lymphocytes, ces cellules commencent à arriver dans la LN dans les hautes endothéliales veinules (HEV) minutes après le transfert iv avec un nombre substantiel qui arrivent dans la LN poplitée après 2 à 4 heures 6,17-18. Pour cel Bls, un nombre important s'accumulent au bout de 8 à 24 heures 19. PED activés devraient commencer à apparaître dans les drainant poplités LN 8 à 16 heures après l'injection du coussinet plantaire 3,11,16-17. La figure 2a montre que, même sans autres repères, des structures telles que les follicules de cellules B peuvent être discernées facilement par l'accumulation de cellules sphériques ronde visible sous 2P-LSM 19. L'utilisation d'un journaliste endogène fluorescent tel que les splénocytes ubiquitine-GFP (figure 2, Vidéos supplémentaires 1 et 2), on peut suivre ces migrations lymphocytes et les comportements pour les jours jusqu'à une semaine dans des conditions non-stimulation des conditions physiologiques. Avec des détecteurs multicanaux à haute sensibilité, il est possible d'acquérir un ensemble de données d'imagerie multiplex qui englobe l'information structurelle ainsi que la dynamique d'interaction entre les multiples partenaires cellulaires 17,19. Lorsque les techniques chirurgicales sont correctement exécutées et les conditions environnementales soigneusement contrôlée, lymtes doit présenter la vitesse de migration caractéristique, comme le montre la figure 2c, 2d et ailleurs 13-14,16. Les lymphocytes peuvent également présenter des différences dans la vitesse de migration en fonction des sous-régions de l'imagerie LN objet, points de repère afin supplémentaires telles que les vaisseaux sanguins (comme l'a souligné par l'introduction de colorants navires) vous aidera à déterminer la qualité d'image globale (à savoir le contrôle de température appropriée , un traumatisme minime à LN, etc) 3,6,20. Vidéo supplémentaire 1. Time-lapse intravitale 2P-LSM imagerie d'un LN souris poplitée comme décrit dans la figure 2. Un total de 1x10 7 lymphocytes ont été isolés enom une souris ubiquitine-GFP + et des bailleurs de fonds transférés par voie intraveineuse adoptive dans une souris receveuse C57BL / 6 24 heures avant l'imagerie. Une série de xy (750 mm x 750 um) des images en fluorescence ont été prises par le biais fixe z piles (5 étapes um, 13 étapes) pour obtenir une pile XYZ Imaging (750 mm x 750 mm x 65 um), qui a été répétée toutes les 20 secondes pour un total de 60 minutes, ce qui entraîne une séquence d'imagerie pour l'analyse xyzt vitesse (figures 2c, 2d). La vitesse de lecture = 450x. Échelle = 50 microns. Horodatage = min: sec. Cliquez ici pour visionner la vidéo supplémentaire . Vidéo supplémentaire 2 zoom-en vue de la séquence d'imagerie en vidéo supplémentaire 1 au niveau du follicule des cellules B -. Frontière T zone de cellule. La vitesse de lecture = 450x. Échelle = 25 um. Horodatage = min: sec. Clécher ici pour visionner la vidéo supplémentaire. 
Figure 1. Construction d'un titulaire de la souris pour souris poplitée Imaging LN a) Schéma de montage porte-souris;. B) la préparation de la souris Représentant intravitale; c) Assemblée Terminé porte-souris; d) gros plans de la LN poplitée après l'exposition chirurgicale. 
Figure 2. L'analyse des migrations de GFP + lymphocytesdans la LN poplitée. (a) aperçu 3D prises de la séquence d'imagerie 2P-LSM de l'LN poplitée dans une souris receveuse C57BL / 6 adoptive transféré avec 1x10 7 lymphocytes + 1 jour avant la GFP à l'imagerie. Ligne Dash désigne la frontière des follicules de cellules B; (b) Titres de la migration des lymphocytes au cours de 1 heure de l'imagerie en continu; c) Distribution de la vitesse de migration globale des lymphocytes. Vitesse moyenne = 10,04 ± 4,26 um / min (total de 15,125 pistes analysées), d) Différentiel distribution cellulaire vitesse de migration des cellules présentes dans le follicule des cellules B (open bars; la vitesse moyenne = 8,79 ± 3,90 um / min; total 1.525 pistes analysées ) et des lymphocytes T zone (barres fermées; la vitesse moyenne = 13,77 ± 5,93 um / min; total de 1.250 titres analysés). Échelle = 50 microns.
Discussion
Les progrès récents en haute résolution dans les techniques d'imagerie in situ, en particulier 2P-LSM, ont été accompagnées par un intérêt croissant pour l'étude du comportement dynamique cellulaire in vivo. La technique d'imagerie 4D sur le LN poplitée d'une souris direct permet de telles analyses dans le comportement dynamique des cellules immunitaires dans le tissu sans perturbation micro-environnement. L'utilisation de 2P-LSM avec des détecteurs multiples s'étendant tout le spectre visible permet simultanée de collecte de données d'imagerie de populations de cellules multiples. Cela peut maintenant être atteint grâce à l'utilisation des cellules in vivo spécifiques souris rapporteurs fluorescents (par exemple l'ubiquitine-eGFP,-DP, ou-ECFP) combiné avec l'utilisation du transfert adoptif de populations de cellules marquées de façon différentielle en utilisant des cellules fluorescentes colorants organiques (p. ex CFSE , Snarf-1, et Cell Tracker Orange) d'examiner les mécanismes cellulaires et de la fonction au sein de la LN. En plus de l'observation directe des interactions entre différentielle suivi cpopulations aune, le jeu de données d'imagerie multiplexe peut subir une analyse plus approfondie avec les programmes d'imagerie disponibles dans le commerce de logiciels de traitement (par exemple Imaris, Bitplane Inc) pour élucider le comportement des cellules et la fonction. Un large éventail de possibilités existe pour étudier les mécanismes d'interaction cellulaire en utilisant ces in vivo et in silico techniques.
La principale limitation de l'approche expérimentale décrite ici est la complexité technique inhérente à l'approche chirurgicale. Cette technique nécessite une formation rigoureuse de se familiariser avec l'anatomie pertinente et les procédures précises et des compétences techniques requises par le présent protocole. Facteurs compliquant encore, la difficulté à minimiser les dommages des tissus lors de l'exploration LN, l'optimisation de la stabilité des tissus lors de l'imagerie, et la prévention des blessures thermique et laser à la LN avant et pendant l'expérimentation d'imagerie. Perturbation de l'un de ces facteurs se traduira par moins-que-optimale lymphatiquemotilité ocyte et donc d'interférer avec une interprétation correcte des données d'imagerie résultant des analyses.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des subventions de NCI 1R01CA154656, le NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, Fondation Saint-Baldrick, Dana Foundation, Gabrielle Angel Foundation, et Hyundai Motors of America "Hope-sur-roues» du programme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Nair - hair removal lotion | Nair | ||
| PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV | |
| Heating pad | Watlow | ||
| Heating Pad Controller | Watlow | ||
| Air and O2 | Airgas | ||
| Temperature probe | Harvard Apparatus | ||
| Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
| Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| Cover of 100x20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 | |
| Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 | |
| Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
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