Summary
الإنتاج المحلي للأكسيد النيتريك (NO) ينظم مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية. بات من الواضح بشكل متزايد أن يشارك اضطراب أو dysregulation من لا يشير الى مقرها في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. طرق لقياس ذات الصلة لا يمكن أن توفر رواية الأيضات المؤشرات الحيوية التشخيصية أو النذير عن الأمراض التي تصيب البشر.
Abstract
اكسيد النيتريك (NO) هو حر ثنائي الذرة الراديكالية التي يتم قصيرة للغاية عاش في النظم البيولوجية (أقل من 1 في الثانية في تعميم الدم) 1. ويمكن اعتبار أي واحدة من الجزيئات الأكثر أهمية إشارة المنتجة في الجسم، وتنظيم المهام الأساسية بما في ذلك ولكن لا تقتصر على تنظيم ضغط الدم، واستجابة جهاز المناعة والاتصالات العصبية. ولذلك كشف الدقيق وتقدير في المصفوفات البيولوجية أمر بالغ الأهمية لفهم دور لا في الصحة والمرض. مع مثل هذا نصف الحياة الفسيولوجية قصيرة من أي، تم وضع استراتيجيات بديلة للكشف عن المنتجات رد فعل من NO الكيمياء الحيوية. القياس الكمي للالأيضات NO ذات الصلة في مقصورات بيولوجية متعددة توفر معلومات قيمة في ما يتعلق في الجسم الحي أي إنتاج، الإتاحة الحيوية والتمثيل الغذائي. ببساطة قد أخذ عينات من حجرة واحدة مثل الدم أو البلازما لا توفر دائما إجراء تقييم دقيق لبو كاملدى لا حالة، وخاصة في الأنسجة. والقدرة على المقارنة بين الدم مع أنسجة مختارة في حيوانات التجارب يساعد على سد الفجوة بين العلوم الأساسية والطب السريري بقدر ما فائدة التشخيص والنذير من NO المؤشرات الحيوية في الصحة والمرض. ولذلك، استقراء الوضع NO البلازما أو الدم إلى أنسجة معينة من الفائدة لم يعد صالحا. ونتيجة لذلك، وطرق الاستمرار في تطويرها والتحقق من صحتها والتي تسمح للكشف والتحديد الكمي للمنتجات أو أي من والمتصلة / الأيضات في حجرات متعددة من حيوانات التجارب في الجسم الحي. النموذج المعمول بها NO الكيمياء الحيوية من الإنتاج بواسطة NO synthases إلى تفعيل محلقة غوانيليل قابل للذوبان (SGC) للأكسدة في نهاية المطاف إلى النتريت (NO 2 -) والنترات (NO 3 -) قد لا تمثل سوى جزء من آثار NO في الجسم الحي. تفاعل الأيضات أو أي من والمشتق مع thiols البروتين، والأمينات الثانوية، والمعادن لتشكل S-nitrosothiعملية شريان الحياة (RSNOs)، N-نيتروسامينيز (RNNOs)، وnitrosyl الهيم، وتمثل على التوالي المركب مستقلة آثار NO ومن المرجح بنفس القدر من الأهمية من الناحية الفسيولوجية وتفعيل SGC بواسطة NO. مشتق الفهم الحقيقي للNO في علم وظائف الأعضاء من التجارب المجراة في أخذ العينات حجرات متعددة في وقت واحد. أكسيد النيتريك (NO) المنهجية هو العلم معقدة ومربكة في كثير من الأحيان، والتركيز على كثير من المناقشات والنقاش حول NO الكيمياء الحيوية. وتوضيح آليات جديدة ومسارات الإشارات التي تنطوي على NO يتوقف على قدرتنا على وجه التحديد، بشكل انتقائي وحساسية كشف وتحديد رقم وجميع المعنيين لا توجد منتجات والأيضات في المصفوفات البيولوجية المعقدة. هنا، نقدم طريقة لتحليل سريع وحساس من النتريت والنترات بواسطة HPLC، فضلا عن الكشف عن رقم مجاني في العينات البيولوجية باستخدام الأوزون في التوهج المختبر القائم مع derivitazation كيميائية لتحديد مصدر الجزيئات من NO كذلك المجراة سابقا معجهاز حمام myography.
Protocol
1. كامل الدم كوكتيل
- جمع الدم الوريدي من البشر أو من حيوانات التجارب في NEM / EDTA تحتوي على أنابيب.
- تدور على الفور في الدم في جهاز للطرد المركزي في الفوق 14300 إطار التعاون الإقليمي (قوة الطرد المركزي النسبية) لمدة 7 دقائق لإعداد البلازما وكريات الدم الحمراء الخلية.
- تحضير عينات البلازما عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) والكشف عن التوهج (CLD) تحليل.
HPLC: أضف 01:01 حجم من الميثانول الباردة إلى البلازما، ودوامة والطرد المركزي في 13200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق على بروتينات البلازما راسب. جمع طاف للتحليل HPLC.
CLD: قسامة عينة ويحضن مسبقا مع سلفانيلاميد وكلوريد الزئبق إلى nitrosothiols فحص على وجه التحديد. - إعداد أحمر بيليه خلية لHPLC والتحليل CLD.
HPLC: إضافة 1:04 أحمر الخلية بيليه في التوصل إلى حل تحلل منخفض التوتر التي تحتوي على 10 NEM مم، 2.5 مم وEDTA 10 ملي فيري سيانيد. دوامة جيدا ثم قم بإضافة 01:01 الميثانول، ودوامة centrifأويغه في 13200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق على بروتين راسب. جمع طاف للتحليل HPLC.
CLD. إضافة 1:04 أحمر الخلية بيليه في التوصل إلى حل تحلل منخفض التوتر التي تحتوي على 10 ملي EDTA، 2.5 ملم وEDTA 10 ملي فيري سيانيد. عينات قسامة إلى أنابيب تحتوي على كلوريد الزئبق وسلفانيلاميد للكشف محدد من nitrosothiols.
2. استخلاص الأنسجة والتحضير
- لتحديد مستويات أنسجة NO الأيضات، من الضروري أولا لجني الأنسجة الدم مجانا للتحضير عينة على النحو المبين أعلاه. وهناك تبادل الدم الكامل تتم عن طريق غرس العازلة الفسيولوجية خلال قمة البطين الأيسر. وبمجرد إزالة كل الدم، ويمكن بعد ذلك أنسجة من مصلحة أن تحصد.
- التجانس عينات الأنسجة، وإعداد العينات على النحو الموصوف أعلاه لHPLC والتحليل CLD.
3. الأبهر خواتم العزلة عن وظيفة غشائي
أنسجة الجهاز حمام
- وسوف تكون الفئران anesthetized مع ايثر حتى لم تعد تستجيب لأخمص القدمين قرصة، والخضوع لخلع عنق الرحم قبل الجراحة. يتم تنفيذ بضع الصدر للكشف عن الشريان الأورطي الصدري والبطن. يتم إدخال حقنة قياس 25 في قمة البطين الأيسر وperfused خالية من الدم مع الاوكسيجين العازلة هنسلايت كريبس.
- يتم قطع الأذين الأيمن إلى توفير مخرج للدم. وستتم إزالة الشريان الأورطي البطني وتنظيفها من البرانية.
- وسيتم خفض الخواتم الى شرائح طويلة 2 ملم والتي شنت على حمام أنسجة الجهاز أربع قنوات (DMT 720MO، آلات م) استحم في حل العازلة الفسيولوجية.
- تتم المحافظة على حلقات السفينة في الحمامات الجهاز 10 ملم مع عازلة كريبس الاوكسيجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2) في 37 درجة مئوية. يتم وضع واحد ادعاء غرام في كل حلقة الأبهر (المناسبة بداية لتوتر وظيفة حركي الأمثل كما هو محدد في التجارب السابقة). على ثماني قنوات ثماني جسر (Powerlab) والبيانات شراء البرمجيات (الرسم البياني الإصدار 5.2.2) 1إعادة استخدامها لتسجيل جميع القياسات قوة.
- ويسمح للعصابات لكي تتوازن لمدة 80 دقيقة مع عازلة في كل حمام الجهاز تتغير كل 20 دقيقة. بعد موازنة لمدة 80 دقيقة، يضاف 1 فينيليفرين ميكرومتر إلى كل حلقة لتقلص submaximal.
- بعد استقرار، ستضاف ناهض البطانية مثل أستيل لتحديد أي إنتاج ودرجة استرخاء الأوعية. بعد الاستجابة للجرعة إلى أستيل كولين، سيتم تشطف الحمامات وrecontracted ومعالجتها بعد ذلك مع مصدر خارجية من أكسيد النيتريك، نتروبروسيد الصوديوم لتحديد استجابة العضلات الملساء والحصول على قيمة للاسترخاء 100٪.
- ويمكن إضافة أي الزبالين إلى الحمام لتوضيح بوضوح الإفراج عن أي تثبيط والاسترخاء السفينة.
4. ممثل النتائج
استعمال ENO-20 HPLC مخصص يوفر وسيلة سهلة لاستخدام أسلوب الإنتاجية العالية للكشف محددة وحساسة من النتريت والنترات فيالمصفوفات البيولوجية. ويرد مبدأ الكشف واللوني الأصلي في الشكل 1. ويمكن استخدام هذا الأسلوب من أجل أي عينة بيولوجية لتحديد النتريت والنترات. كشف القائم CLD من NO الأيضات يتطلب خطوة derivitization كيميائية لتحديد مصدر الجزيئي للNO. يظهر الإعداد تجريبية لdenitrosation الاكسدة في وقت واحد وdenitrosation الاختزالية للكشف عن التوهج في الشكل 2. ويملأ الوعاء رد فعل على اليمين مع فيري سيانيد الهيدروجيني 800mM في برنامج تلفزيوني 7.4 و يتم تعبئة وعاء التفاعل على اليسار مع خليط يوديد / اليود البوتاسيوم في حامض الخليك لتخفيض denitrosation (الشكل 2A). يظهر الإعداد كامل في الشكل 2B. يوضح الشكل 3 المقايسات مجموعة denitrosation المحددة التي يمكن كشف وتحديد النتريت، nitrosothiols، نيتروسامينيز فضلا عن المنتجات الهيم nitrosyl. وكانت هذه الطريقة من قبل descriالسرير والتحقق من صحة 4،5. ويمكن بسهولة هذه التحليلات الكيميائية الحيوية الهامة ذات الارتباط الوثيق الدراسات الفنية في حلقات معزولة الأبهري لتحديد البطانية أي إنتاج في حيوانات التجارب. ويمكن لهذه التجربة الكلاسيكية الدوائي بسهولة ودقة تقييم البطانية أي وظيفة والإنتاج. ويمكن قياس التفاعل السفينة إلى منبهات البطانية مثل أستيل تحديد البطانية مباشرة أي إنتاج التي يمكن بعد ذلك ترتبط المؤشرات الحيوية الكيمياء الحيوية المكتشفة في الدم والأنسجة من حيوانات التجارب. ويرد تمثيل نموذجي للاستجابة إلى جرعة أستيل في الشكل 4. السيطرة على الفئران صحية مع وظيفة بطانة الأوعية الدموية العادية تستجيب لأستيل عن طريق الاسترخاء. الفئران مع اختلال وظيفي البطانية (الفئران الكوليسترول) وتظهر استرخاء انخفاض بسبب انخفاض أي إنتاج لتحفيز نفسه.
تينلدى عودتهم 1. مبدأ الكشف عن النتريت والنترات بواسطة ENO-20، واللوني عينة. (الأعلى) من أسلوب تخطيطي-20 دار الاوبرا الانجليزية القومية من الكشف عن النتريت والنترات. (القاع) chromotogram قياسي من نترات بمول (10) ونترات حقنها ENO-20 (100 ميكرولتر من حل 100 نانومتر من النتريت والنترات). حساسية من 1 نانومتر لكل شاردة مع 100 حجم حقن ميكرولتر. لا تدخل مع البروتين أو الأنواع الملونة.
إعداد شخصية CLD 2. التجريبية باستخدام كل denitrosation الاكسدة التي denitrosation فيري سيانيد والاختزالية التي تستخدم يوديد / اليود مقايسة مع مرحلة اكتشاف الغاز من تطهير غاز أوكسيد النتريك.
الشكل 3. (لوحة أ) كشف التوهج من النتريت، RSNO، RNNO في فحص denitrosation الاختزالية التي كتبها حضن مسبق مع عينة كيميائي مجموعة محددةشركة الكواشف. الطرح من مناطق ذروة تسمح الكشف عن النتريت وRSNOs. (لوحة ب) كشف Chemiluminescent الأنواع الهيم nitrosyl باستخدام الأكسدة حل denitrosation من فيري سيانيد. هذا الأسلوب هو محدد لNO-هيم المنتجات مع عدم وجود تفاعل مع الصليب RSNOs (GSNO أو SNO الألبومين)، أو RNNO (NO-N-بيروليدين والنتروز الألبومين).
الشكل 4. سابق حمام الجهاز المجراة في حلقات معزولة الأبهري يوفر مقياسا مباشرا لإنتاج NO البطانية التي يمكن بعد ذلك ترتبط المؤشرات الحيوية الكيمياء الحيوية الكشف عنها بواسطة HPLC وCLD. ويبين هذا الشكل الاسترخاء انخفض في الفئران مع اختلال وظيفي البطانية بسبب انخفاض أي إنتاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفت وسائل هنا للحصول على القياس الكمي للالأيضات NO ذات الصلة في مقصورات بيولوجية متعددة تسمح لأخذ البصمات من لا علم الاحياء في الصحة والمرض التي يمكن أن ترتبط مع القياسات الفنية للNO من قبل البطانة. هذه الأساليب تتطلب إعداد نموذج بسيط مع إمكانية للتكيف مع لإنتاجية عالية. لا يمكن للكمية النسبية لهذه الجزيئات تساعد في فهم إنتاجية لا ومصيره التمثيل الغذائي في عدد من نماذج تجريبية من المرض وحتى المسلسل عينات من المرضى من البشر. هناك كثير من المزالق في الكشف عن المؤشرات الحيوية لا يستند إلى والأساليب التحليلية العديد من إنتاج مصطنع بعض من هذه المنتجات خلال إعداد عينة. المحاسبة حذرا من النتريت في العينات البيولوجية أمر بالغ الأهمية نظرا إلى التفاعل مع thiols السيستين (6) وتشكيل مصطنعة من nitrosothiols 7. المنهجيات القائمة على CLD للكشف محدد من النتريت في الظروف اللاهوائية تؤدي إليه فيتتفق النتائج نظرا لنشاط معين من الانزيمات اختزال النتريت في مقصورات البيولوجية المختلفة 8. موثقة توثيقا جيدا كل من الأساليب المذكورة هنا، والتحقق من صحة، وتأخذ في الاعتبار اتخاذ خطوات للقضاء على أو الحد من القطع الاثرية 9. سنقوم بشرح الخطوات الحاسمة الضرورية لمنع الاعمال الفنية. وهذا الفرز مقصورة متعددة من NO الأيضات مساعدة في تحديد المؤشرات الحيوية ذات الصلة التي قد تكون لها فائدة تشخيصية أو النذير في البشر، وسيسمح ذلك لتطوير أساليب موحدة والتي يمكن استخدامها في عيادة الطبيب أو للتحليل المخبري القياسية. الاعتراف الأخير لدورة النيتروجين الإنسان حيث يتم تخفيض النترات والنتريت إلى NO قبل تداول enterosalivary من نترات 10،11 يفتح حتى الآن إمكانية استخدام اللعاب والعلامات البيولوجية المحتملة لوضع NO في بعض الأمراض. حتى الآن أي حالة ليست جزءا من كيمياء الدم القياسية المستخدمة عادة لأغراض التشخيص في المرضى. الويثير الدهشة نظرا للطبيعة الحرجة للمرض وجود أية عمليات كثيرة. في النهاية، ومستويات تحديد هذه المؤشرات الحيوية ذات الصلة NO بواسطة سهل الاستخدام وسريع ربما جانب السرير نقطة من الرعاية المقايسات بعد التحقق من صحة الكافية ستكون شاهدا حقيقيا على دورها في الطب الجزيئي. فإنه من الحكمة في هذه المرحلة لبذل جهود مركزة ومجتمعة في هذا المجال للتحقق من صحة وتطوير فحص القياسية ودقة لتحديد NO وضع في النماذج الحيوانية للمصادقة عليها في البشر. سوف الأساليب المبينة في هذا البروتوكول السماح للآخرين لتبني بسرعة وسيلة لتوافق هذه القياسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر هونغ جيانغ، دكتوراه وديبا Parathasarthy، ميلا في الساعة، خدمات تنمية الأعمال التجارية للمساعدة التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23030 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 | |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 | |
| Autosampler | Alcott | ||
| DMT Myograph | ADInstruments | ||
| PowerLab | ADInstruments | ||
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
References
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
- Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
- Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
- Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
- Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
- Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
