Summary
Den endogene produktion af nitrogenoxid (NO) regulerer en lang række biologiske funktioner. Det bliver mere og mere klart, at afbrydelse eller dysregulering af NO baserede signalering er involveret i mange sygdomme hos mennesker. Metoder til at kvantificere relevante INGEN metabolitter kan give nye diagnostiske eller prognostiske biomarkører for human sygdom.
Abstract
Nitrogenoxid (NO) er en toatomigt fri radikal, der er ekstremt kortvarig i biologiske systemer (mindre end 1 sekund i cirkulerende blod) 1. NO kan betragtes som en af de vigtigste signalmolekyler fremstillet i vores krop, regulering væsentlige funktioner, herunder men ikke begrænset til regulering af blodtryk, immunrespons og neural kommunikation. Derfor er det nøjagtig påvisning og kvantificering i biologiske matricer er afgørende for at forstå betydningen af NO i sundhed og sygdom. Med en sådan kort fysiologisk halveringstid af NO, er alternative strategier til påvisning af produkterne fra reaktionen mellem NO biokemi blevet udviklet. Kvantificeringen af relevante NO metabolitter i flere biologiske rum giver værdifuld information med hensyn til in vivo NO produktion, biotilgængelighed og metabolisme. Blot prøvetagning et enkelt rum, såsom blod eller plasma kan ikke altid give en nøjagtig vurdering af hele body NO status, navnlig i væv. Evnen til at sammenligne blod med udvalgte væv i forsøgsdyr vil hjælpe bygge bro mellem grundforskning og klinisk medicin så vidt angår diagnostisk og prognostisk nytte af NO biomarkører i sundhed og sygdom. Derfor ekstrapolation af plasma eller blod NO status til specifikke væv af interesse, er ikke længere en anvendelig metode. Som et resultat fortsat metoder til at blive udviklet og valideret som tillader påvisning og kvantificering af NO og NO-relaterede produkter / metabolitter i flere rum i forsøgsdyr in vivo. Den etablerede paradigme af NO biokemi fra produktionen på ingen synthases til aktivering af opløselig guanylylcyclase (SGC) til en eventuel oxidation til nitrit (NO 2 -) og nitrat (NO 3 -) må kun udgøre en del af NO har virkninger in vivo. Samspillet mellem NO og-afledt metabolitter protein thioler, sekundære aminer, og metaller til dannelse af S-nitrosothioler (RSNOs), N-nitrosaminer (RNNOs) og nitrosyl-hæm henholdsvis repræsenterer cGMP-uafhængige virkninger af NO og sandsynligvis lige så vigtig fysiologisk som aktivering af sGC med NO. En sand forståelse af NO i fysiologi stammer fra in vivo eksperimenter Prøvetagningssonder flere rum samtidig. Nitrogenoxid (NO) metode er et komplekst og ofte forvirrende videnskab og fokus for mange debatter og drøftelser om NO biokemi. Den belysning af nye mekanismer og signalveje, der ikke indebærer afhænger af vores evne til specifikt selektivt og nænsomt detektere og kvantificere NO, og alle relevante Ingen produkter og metabolitter i komplekse biologiske matricer. Her præsenteres en fremgangsmåde til hurtig og følsom analyse af nitrit og nitrat ved HPLC samt påvisning af frit NO i biologiske prøver under anvendelse af in vitro ozon baseret kemiluminescens med kemisk derivitazation at bestemme molekylvægt kilde til NO samt ex vivo medOrganbadet myography.
Protocol
1. Helblod Collection
- Indsaml venøst blod fra mennesker eller fra forsøgsdyr i NEM / EDTA med rør.
- Umiddelbart vågeblus blod i en bordcentrifuge ved 14.300 RCF (relative centrifugalkraft) i 7 minutter for at fremstille plasma og røde blodlegemer pellet.
- Forberede plasmaprøver for højtydende væskekromatografi (HPLC) og kemiluminescens-detektion (CLD) analyse.
HPLC: Tilsæt 01:01 volumen kold methanol til plasma, vortex og centrifugeres ved 13.200 rpm i 10 minutter til udfældning af plasmaproteiner. Indsamle supernatant til HPLC-analyse.
CLD: delprøve en prøve og præinkubere med sulfanilamid og mercurichlorid specifikt assay nitrosothioler. - Fremstille røde cellepellet til HPLC og CLD-analyse.
HPLC: Add 01:04 røde cellepellet til en hypotonisk lysis opløsning indeholdende 10 mM NEM, 2,5 mM EDTA og 10 mM ferricyanid. Vortex grundigt og derefter tilføje 1:1 methanol, vortex og centrifweeks ved 13.200 rpm i 10 minutter til udfældning protein. Indsamle supernatant til HPLC-analyse.
CLD. Tilsættes 01:04 røde cellepellet til en hypotonisk lysis opløsning indeholdende 10 mM EDTA, 2,5 mM EDTA og 10 mM ferricyanid. Alikvote prøver til rør indeholdende sulfanilamid og mercurichlorid til specifik påvisning af nitrosothioler.
2. Tissue udvinding og forarbejdning
- For at bestemme vævs niveauer af NO metabolitter, er det nødvendigt først at høste blod gratis væv til prøveforberedelse, som beskrevet ovenfor. En fuld blod udvekslingen vil finde sted ved at tilføre fysiologisk buffer gennem spidsen af venstre ventrikel. Når alle blodet fjernes, kan væv af interesse derefter høstes.
- Homogeniseres vævsprøver og fremstille prøver som beskrevet ovenfor til HPLC og CLD-analyse.
3. Aorta Ringe Isolering for endotelfunktion
Væv Organbadet
- Mus vil være Anesthetized med diethylether indtil der ikke længere reagerer på tå pinch og undergå cervikal dislokation før kirurgi. En torakotomi udføres for at blotlægge torakale og abdominale aorta. En 25 gauge sprøjte sættes ind i toppen af venstre ventrikel og perfunderet fri for blod med oxygeneret Krebs Henseleit-puffer.
- Det højre atrium skæres for at tilvejebringe en udgang for blod. Abdominale aorta fjernes og renses for adventitia.
- Ringe vil blive skåret i 2 mm lange segmenter og monteret på et fire-kanals væv organbad (DMT 720MO, AD Instruments) badet i en fysiologisk bufferopløsning.
- Fartøjets ringe holdes i 10 ml organbade med oxygeneret Krebs-puffer (95% O2 og 5% CO2) ved 37 ° C. Et gram forspænding er placeret på hver aortaringen (passende udgangsmateriale spænding for optimal vasomotorisk funktion som bestemt i de foregående eksperimenter). En otte-kanals oktal bro (Powerlab) og data-erhvervelse software (figur-version 5.2.2) enigen bruges til at registrere alle kraftmålinger.
- Ringene er lov til at ækvilibrere i 80 minutter med buffer i hver organbad ændret hver 20 min. Efter ækvilibrering i 80 min, 1 uM phenylephrin tilsat til hver ring for submaksimal kontraktion.
- Efter stabilisering vil endothelial agonist, såsom acetylcholin sættes til bestemmelse af NO-produktion og graden af beholderen afslapning. Efter dosis respons på acetylcholin, vil bade skylles og recontracted og derefter behandlet med en exogen kilde til nitrogenoxid, natriumnitroprussid at bestemme reaktionsevne af glat muskulatur og for at få en værdi på 100% afslapning.
- NO scavengers kan tilsættes til badet klart illustrere frigivelse af NO og inhibering af beholderen afslapning.
4. Repræsentative resultater
Anvendelse af ENO-20 dedikerede HPLC giver en nem at bruge high throughput metode til specifik og følsom detektion af nitrit og nitrat ibiologiske matricer. Princippet om detektering og en original kromatogram er vist i fig 1. Denne fremgangsmåde kan anvendes til ethvert biologisk prøve til bestemmelse af nitrit og nitrat. CLD-baserede påvisning af NO metabolitter kræver et kemisk derivatisering trin for at bestemme den molekylære kilden af NO. Forsøgsopstillingen til samtidig oxidativ denitrosering og reduktiv denitrosering for kemiluminescens detektor er vist i figur 2. Reaktionsbeholderen på højre er fyldt med 800 mM ferricyanid i PBS pH 7,4, og reaktionsbeholderen til venstre er fyldt med kaliumiodid / iod blandingen i eddikesyre til reduktion denitrosering (figur 2A). Den samlede opstilling er vist i figur 2B. Figur 3 illustrerer specifikt for gruppe denitrosering assays, der kan detektere og kvantificere nitrit og nitrosothioler, nitrosaminer samt nitrosylchlorid hæm produkter. Denne fremgangsmåde er tidligere beskreseng og valideret 4,5. Disse vigtige biokemiske analyser kan let korreleres med funktionelle studier på isolerede aortaringe at bestemme endotel NO-produktion hos forsøgsdyr. Dette klassiske farmakologiske eksperiment kan nemt og præcist at vurdere endotel Ingen funktion og produktion. Målebeholderen reaktivitet til endotelceller agonister, såsom acetylcholin kan direkte at bestemme endothelial NO-produktion, som derefter kan korreleres med biokemiske markører påvises i blod og væv af forsøgsdyrene. En typisk fremstilling af en dosis respons på acetylcholin er vist i figur 4. Raske kontrolpersoner mus med normale endotelfunktion reagere acetylcholin ved at slække. Mus med endotel dysfunktion (hyperkolesterolemiske mus) viser reduceret relaksation på grund af reduceret produktion af NO til det samme stimulus.
Figure 1. Princip for detektion af nitrit og nitrat ved ENO-20 og prøve kromatogram. (Top) Skematisk af ENO-20 metode til påvisning for nitrit og nitrat. (Nederst) Standard chromotogram 10 pmol nitrit og nitrat injiceres ENO-20 (100 ul 100 nM opløsning af nitrit og nitrat). Følsomhed af 1 nM for hver anion med 100 ul injektionsvolumen. Ingen interferens med protein eller farvede arter.
Figur 2. CLD forsøgsopstilling ved hjælp af både oxidativ denitrosering af ferricyanid og reduktiv denitrosering med iodid / jod assay med gasfase påvisning af renset nitrogenoxid gas.
Figur 3. (Panel A) kemiluminescensdetektion nitrit, RSNO, RNNO i reduktiv denitrosering assay ved prøven præinkubering med gruppespecifikt chemical reagenser. Subtraktion af toparealer tillader detektion af nitrit og RSNOs. (Panel B) kemiluminescens-detektion af nitrosylchlorid hæm art efter oxidativ denitrosering opløsning af ferricyanid. Denne fremgangsmåde er specifik for NO-hæm produkter uden krydsreaktivitet med RSNOs (GSNO eller SNO-albumin) eller RNNO (NO-pyrrolidin og N-nitroso-albumin).
Figur 4. Ex vivo organbad på isolerede aortaringe tilvejebringer et direkte mål for endotel NO-produktion, der derefter kan korreleres med biokemiske markører påvises ved HPLC og CLD. Denne figur illustrerer reduceret afslapning hos mus med endotel dysfunktion på grund af nedsat NO-produktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De her beskrevne metoder til kvantificering af de relevante NO metabolitter i flere biologiske rum vil tillade fingeraftryk af NO biologi i sundhed og sygdom, der kan korreleres med funktionelle målinger af NO ved endotel. Disse metoder kræver simpel prøveforberedelse med potentiale for tilpasning til high throughput. Den relative mængde af disse molekyler kan hjælpe med at forstå produktionen af NO og dens metaboliske skæbne i en række eksperimentelle modeller for sygdom og endda serielle prøver fra humane patienter. Der er mange faldgruber i opdage NO baserede biomarkører og mange analysemetoder kunstigt producerer nogle af disse produkter under forberedelsen. Omhyggelig regnskab af nitrit i biologiske prøver er kritisk på grund af dets reaktivitet med cystein thioler 6 og kunstig dannelse af nitrosothioler 7. CLD baserede metoder til specifik påvisning af nitrit under anaerobe betingelser føre til ikonsistente resultater på grund af aktiviteten af specifikke nitritreductase enzymer i forskellige biologiske rum 8. Alle de her beskrevne metoder er veldokumenterede og validerede og tage hensyn til foranstaltninger for at fjerne eller reducere artefakter 9. Vi vil beskrive kritiske nødvendige skridt for at undgå artefakter. Denne multi-kammer screening af NO metabolitter vil hjælpe med at identificere relevante biomarkører, der kan have diagnostisk eller prognostisk anvendelighed i mennesker og vil muliggøre udvikling af standardiserede fremgangsmåder, der kan anvendes i klinikken eller i standard laboratorieanalyse. Den nylige anerkendelse af et menneske kvælstofkredsløbet hvorved nitrat og nitrit reduceres til NO med en enterosalivary cirkulation af nitrat 10,11 åbner nu op for mulighederne for at anvende spyt som en potentiel biomarkør for ingen status i visse sygdomme. Til dato Ingen status er ikke en del af standarden blodkemi bruges rutinemæssigt til diagnostiske formål i patienter. Ther er chokerende får kritiske natur af NO mange sygdomsprocesser. I sidste ende, at bestemme niveauer af disse NO relaterede biomarkører ved let at bruge og måske hurtig sengen side point-of-care analyser efter tilfredstillende validering vil være en reel hyldest til deres rolle i molekylær medicin. Det er klogt på dette tidspunkt for koncentrerede og kombinerede indsats på at validere og udvikle en standard og præcis analyse til bestemmelse ingen status i dyremodeller til validering hos mennesker. De metoder, der beskrives i denne protokol vil tillade andre til hurtigt at vedtage en konsensus metode for sådanne målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Hong Jiang, Ph.D. og Deepa Parathasarthy, MPH, BDS for teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23030 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 | |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 | |
| Autosampler | Alcott | ||
| DMT Myograph | ADInstruments | ||
| PowerLab | ADInstruments | ||
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
References
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
- Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
- Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
- Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
- Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
- Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
