Summary
La production endogène d'oxyde nitrique (NO) réglemente une grande variété de fonctions biologiques. Il est de plus en plus clair que la perturbation ou une dysrégulation de la signalisation du NO base est impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Méthodes de quantification pertinente NO métabolites peuvent fournir de nouveaux biomarqueurs de diagnostic ou de pronostic de la maladie humaine.
Abstract
L'oxyde nitrique (NO) est un diatomique des radicaux libres qui est très courte durée dans les systèmes biologiques (moins de 1 seconde dans le sang circulant) 1. NO peut être considéré comme l'une des molécules les plus importants de signalisation produites dans notre corps, la régulation des fonctions essentielles, y compris mais non limité à la réglementation de la pression artérielle, la réponse immunitaire et de la communication neuronale. Par conséquent sa détection précise et la quantification dans les matrices biologiques est essentielle pour comprendre le rôle du NO dans la santé et la maladie. Avec une telle courte demi-vie physiologique de NO, des stratégies alternatives pour la détection des produits de la réaction de NO biochimie ont été développés. La quantification des métabolites de NO pertinentes dans de multiples compartiments biologiques fournit des informations précieuses en ce qui concerne la production de NO in vivo, la biodisponibilité et le métabolisme. Il suffit de l'échantillonnage d'un seul compartiment tels que le sang ou le plasma ne peut pas toujours fournir une évaluation précise de l'ensemble body pas de statut, en particulier dans les tissus. La capacité de comparer le sang avec les tissus sélectionnés chez les animaux expérimentaux aidera combler le fossé entre la science fondamentale et la médecine clinique dans la mesure où l'utilité diagnostique et pronostique de biomarqueurs dans NO santé et la maladie. Par conséquent, l'extrapolation de plasma ou le sang NO statut à des tissus spécifiques d'intérêt n'est plus une approche valable. En conséquence, les méthodes continuent d'être développés et validés qui permettent la détection et la quantification des produits de NO et NO-connexes / métabolites dans les compartiments d'animaux de laboratoire in vivo. Le paradigme établi de NO biochimie de la production par NO synthases à l'activation de la guanylyl cyclase soluble (GCs) à l'oxydation éventuelle en nitrite (NO 2 -) et le nitrate (NO 3 -) ne peut représenter une partie de NO de effets in vivo. L'interaction des métabolites de NO et de NO dérivé avec les thiols protéiques, des amines secondaires et les métaux pour former S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), et nitrosyle-hème représentent respectivement GMPc-indépendants effets de NO et sont susceptibles aussi importante que l'activation de physiologiquement sGC par NO. Une véritable compréhension de NO dans la physiologie est dérivée à partir d'expériences in vivo d'échantillonnage compartiments multiples simultanément. D'oxyde nitrique (NO) la méthodologie est une science complexe et souvent déroutant et le centre de nombreux débats et de discussion concernant la biochimie NO. L'élucidation des mécanismes nouveaux et les voies de signalisation impliquant pas de charnières sur notre capacité à précisément, de manière sélective et sensible de détecter et de quantifier le NO et NO tous les produits pertinents et de leurs métabolites dans les matrices complexes biologiques. Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse rapide et sensible des nitrites et nitrates par CLHP ainsi que la détection de NO libre dans des échantillons biologiques en utilisant dans la couche d'ozone chimioluminescence in vitro basée à derivitazation chimique pour déterminer la source de NO moléculaire ainsi que ex vivo avecmyographie bain d'organe.
Protocol
1. Prélèvement de sang total
- Recueillir le sang veineux de l'homme ou les animaux de laboratoire dans NEM / EDTA tubes contenant.
- Immédiatement spin down sang dans une centrifugeuse de paillasse à 14300 rcf (force centrifuge relative) pendant 7 minutes pour préparer le plasma et globules rouges à granulés.
- Préparer des échantillons de plasma pour la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) et détection par chimiluminescence (CLD) d'analyse.
HPLC: Ajouter 01h01 volume de méthanol froid au plasma, vortex et centrifuger à 13200 rpm pendant 10 minutes à précipiter les protéines plasmatiques. Recueillir le surnageant pour l'analyse HPLC.
CLD: aliquote d'un échantillon et préincuber avec le sulfanilamide et le chlorure de mercure à nitrosothiols dosage particulier. - Préparer des globules rouges à pellets pour HPLC et analyse CLD.
HPLC: Ajouter 01h04 rouge culot cellulaire à une solution de lyse hypotonique contenant 10 NEM mM, 2,5 mM EDTA et 10 mM de ferricyanure. Vortex à fond et puis ajoutez 01:01 méthanol, vortex et CENTRIFUGEuge à 13200 rpm pendant 10 minutes aux protéines de précipité. Recueillir le surnageant pour l'analyse HPLC.
CLD. Ajouter 01h04 rouge culot cellulaire à une solution de lyse hypotonique contenant 10 mM d'EDTA, 2,5 mM EDTA et 10 mM Ferricyanure. Parties aliquotes dans des tubes contenant du chlorure de mercure et de sulfanilamide pour la détection spécifique de nitrosothiols.
2. Extraction de tissus et de préparation
- Pour déterminer les niveaux tissulaires de NO métabolites, il est d'abord nécessaire de récolter le tissu sanguin gratuit pour la préparation des échantillons comme décrit ci-dessus. Un échange de sang complet aura lieu par infusion tampon physiologique par le sommet du ventricule gauche. Une fois que tout le sang est retiré, les tissus d'intérêt peut alors être récoltés.
- Homogénéiser les échantillons de tissus et de préparer des échantillons comme décrit ci-dessus pour HPLC et analyse CLD.
3. Aortique isolement Anneaux pour la fonction endothéliale
Bain d'organes de tissus
- Souris sera anesthetized avec de l'éther diéthylique jusqu'à ne répondent plus aux pieds de pincement, et subissent dislocation cervicale avant l'intervention chirurgicale. Une thoracotomie est réalisée afin d'exposer l'aorte thoracique et abdominale. Seringue de calibre 25 est inséré dans l'apex du ventricule gauche et perfusé libre du sang oxygéné avec Krebs Henseleit tampon.
- L'oreillette droite est découpée pour fournir une sortie pour le sang. Aorte abdominale sera démonté et nettoyé de l'adventice.
- Anneaux sera coupé en 2 mm de longs segments et monté sur un bain à quatre voies des tissus des organes (DMT 720MO, instruments AD) baignent dans une solution tampon physiologique.
- Anneaux de navires sont maintenus dans des bains d'organes de 10 ml avec tampon de Krebs oxygénée (95% d'O 2 et 5% de CO 2) à 37 ° C. Un précontrainte gramme est placé sur chaque anneau aortique (échéant de départ pour la tension fonction vasomotrice optimale telle que déterminée dans des expériences précédentes). Un enfant de huit canaux octal pont (Powerlab) et d'acquisition de données du logiciel (version graphique 5.2.2) unere utilisé pour enregistrer toutes les mesures de force.
- Les anneaux sont autorisés à s'équilibrer pendant 80 minutes avec le tampon dans chaque bain d'organe changé toutes les 20 min. Après équilibration pendant 80 min, 1 uM phényléphrine est ajouté à chaque anneau de la contraction sous-maximale.
- Après stabilisation, agoniste endothéliale tels que l'acétylcholine seront additionnés pour déterminer la production de NO et le degré de relaxation des vaisseaux. Après la dose-réponse à l'acétylcholine, bains seront rincés et réembauché, puis traitée avec une source exogène de l'oxyde nitrique, le nitroprussiate de sodium afin de déterminer la réactivité du muscle lisse et d'obtenir une valeur pour 100% détente.
- NO charognards peuvent être ajoutés au bain pour illustrer clairement la libération de NO inhibition et de la relaxation des vaisseaux.
4. Les résultats représentatifs
Utilisez de l'ENO-20 HPLC dédiée fournit une méthode facile à utiliser à haut débit pour la détection spécifique et sensible des nitrites et nitrates dans lesmatrices biologiques. Le principe de détection et un chromatogramme d'origine est représenté sur la figure 1. Cette méthode peut être utilisée pour n'importe quel échantillon biologique pour déterminer les nitrites et les nitrates. CLD de détection basée sur de NO métabolites nécessite une étape de dérivatisation chimique pour déterminer la source moléculaire de la NO. Le montage expérimental pour dénitrosation oxydatif simultanée et dénitrosation réductrice pour le détecteur de chimiluminescence est illustré à la figure 2. La cuve de réaction sur la droite est rempli avec du ferricyanure 800mm dans du PBS pH 7,4 et la cuve de réaction sur la gauche est rempli de l'iodure de potassium / iode mélange dans l'acide acétique pour dénitrosation réduction (Figure 2A). L'ensemble du montage est montré dans la figure 2B. La figure 3 illustre des essais du groupe dénitrosation spécifiques qui permettent de détecter et de quantifier les nitrites, nitrosamines nitrosothiols, ainsi que des produits hème nitrosyle. Cette méthode a déjà été descrilit et validé 4,5. Ces analyses biochimiques importantes peuvent facilement être mis en corrélation avec les études fonctionnelles sur des anneaux aortiques isolés pour déterminer la production de NO endothélial chez les animaux expérimentaux. Cette expérience classique pharmacologique peut facilement et d'évaluer avec précision endothéliale fonction NO et la production. Mesure la réactivité vasculaire aux agonistes endothéliales tels que l'acétylcholine peut déterminer directement la production de NO endothélial qui peuvent ensuite être corrélée avec des biomarqueurs biochimiques détectés dans le sang et les tissus des animaux de laboratoire. Une représentation typique d'un dose-réponse à l'acétylcholine est montré dans la figure 4. Souris témoins sains avec la fonction endothéliale normale répondre à l'acétylcholine par la détente. Souris avec dysfonction endothéliale (souris hypercholestérolémiques) montrent la relaxation réduite en raison de la production de NO réduit au même stimulus.
Figueure 1. Principe de la détection des nitrites et nitrates par ENO-20 et chromatogramme de l'échantillon. (Haut) Schéma de ENO-20 méthode de détection pour les nitrites et les nitrates. (En bas) chromotogram standard de 10 pmol nitrite et de nitrate injecté dans ENO-20 (100 pi de solution à 100 nM des nitrites et nitrates). Sensibilité de 1 nM pour chaque anion avec un volume de 100 ul d'injection. Aucune interférence avec les protéines ou les espèces colorées.
Figure 2. CLD dispositif expérimental utilisant à la fois dénitrosation oxydatif par dénitrosation ferricyanure et réductrice en utilisant l'iodure / iode test avec détection en phase gazeuse de gaz d'oxyde nitrique purgé.
Figure 3. (Groupe A) une détection par chimiluminescence du nitrite, RSNO, RNNO dans le dosage dénitrosation réductrice par préincubation échantillon avec le groupe chemic spécifiqueAl réactifs. Soustraction des aires des pics de permettre la détection de nitrite et RSNOs. (Groupe B) de détection par chimioluminescence des espèces hème nitrosyle aide d'une solution de ferricyanure de dénitrosation oxydatif. Cette méthode est spécifique pour le NO-hème produits avec aucune réactivité croisée avec RSNOs (GSNO ou SNO-albumine), ou RNNO (NO-pyrrolidine et la N-nitroso-albumine).
Figure 4. Bain Ex vivo organe sur des anneaux aortiques isolés fournit une mesure directe de la production de NO endothélial qui peuvent ensuite être corrélée avec des biomarqueurs biochimiques détectés par HPLC et le CLD. Cette figure illustre la relaxation réduite chez les souris présentant une dysfonction endothéliale due à une diminution la production de NO.
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Discussion
Les méthodes décrites ici pour la quantification des métabolites de NO pertinentes dans de multiples compartiments biologiques permettra d'empreintes digitales de NO biologie dans la santé et la maladie qui peut être corrélée avec les mesures fonctionnelles de NO par l'endothélium. Ces méthodes nécessitent une préparation simple échantillon avec un potentiel d'adaptation pour un débit élevé. La quantité relative de ces molécules peuvent aider à comprendre la production de NO et de son devenir métabolique dans un certain nombre de modèles expérimentaux de la maladie et même des échantillons de série provenant de patients humains. Il ya beaucoup de pièges pour détecter des biomarqueurs basés sur NO et de nombreuses méthodes analytiques produire artificiellement certains de ces produits au cours de la préparation des échantillons. Comptabilité minutieuse de nitrite dans des échantillons biologiques est essentielle en raison de sa réactivité avec les thiols 6 cystéine et la formation artéfactuelle de nitrosothiols 7. CLD méthodes fondées sur de détection spécifiques de nitrite dans des conditions anaérobies dans les conduire àdes résultats cohérents en raison de l'activité de certains enzymes nitrite réductase dans les différents compartiments biologiques 8. Toutes les méthodes décrites ici sont bien documentées et validées, et prendre en considération les étapes d'éliminer ou de réduire les artefacts de 9. Nous allons décrire les étapes critiques nécessaires pour éviter les artefacts. Ce dépistage à compartiments multiples de NO métabolites aidera à identifier les biomarqueurs pertinents qui peuvent avoir une utilité diagnostique ou pronostique chez les humains et permet ensuite à l'élaboration de méthodes normalisées qui peuvent être utilisés dans la clinique ou au laboratoire pour analyse standard. La reconnaissance récente d'un cycle de l'azote de l'homme selon lequel nitrates et des nitrites sont réduits à NO par une circulation enterosalivary de nitrate 10,11 ouvre désormais la possibilité d'utiliser la salive comme un biomarqueur potentiel pour aucun statut dans certaines maladies. À ce jour, NO quo n'est pas une partie de la chimie du sang standard utilisé systématiquement à des fins de diagnostic chez les patients. Thest est choquant étant donné la nature critique de NO de nombreux processus pathologiques. En fin de compte, déterminer les niveaux de ces biomarqueurs liés par NO facile à utiliser et peut-être secondaires lit rapide au point de soins de tests après la validation adéquate sera un véritable témoignage de leur rôle dans la médecine moléculaire. Il est prudent à ce stade de la concentration des efforts et combiné dans le domaine afin de valider et de développer un dosage standard et précise pour déterminer le statut NO dans des modèles animaux pour la validation chez l'homme. Les méthodes décrites dans ce protocole permettra aux autres d'adopter rapidement une méthode de consensus pour de telles mesures.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Hong Jiang, Ph.D. et Deepa Parathasarthy, MPH, le BDS pour l'assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23030 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 | |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 | |
| Autosampler | Alcott | ||
| DMT Myograph | ADInstruments | ||
| PowerLab | ADInstruments | ||
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
References
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