Summary
A produção endógena de óxido nítrico (NO) regula uma grande variedade de funções biológicas. Está se tornando cada vez mais claro que a ruptura ou desregulagem de sinalização NO base está envolvida em muitas doenças humanas. Os métodos para quantificar relevante metabólitos podem fornecer novos biomarcadores de diagnóstico ou de prognóstico para a doença humana.
Abstract
O óxido nítrico (NO) é um radical livre diatômico que é extremamente curta duração em sistemas biológicos (menos de 1 segundo no sangue circulante) 1. NO pode ser considerada uma das moléculas de sinalização mais importantes produzidos no nosso corpo, regulando as funções essenciais, incluindo mas não limitado a regulação da pressão arterial, a resposta imune e comunicação neural. Portanto, sua detecção precisa e quantificação, em matrizes biológicas é crucial para entender o papel do NO na saúde e na doença. Com tal meia vida um curto fisiológica de NO, estratégias alternativas para a detecção dos produtos de reacção de NO bioquímica têm sido desenvolvidos. A quantificação dos metabólitos do NO relevantes em vários compartimentos biológicos fornece informação valiosa no que diz respeito ao método in vivo a produção de NO a biodisponibilidade, e metabolismo. Basta provar um único compartimento, tais como sangue ou plasma nem sempre pode fornecer uma avaliação precisa do bo todody NO estado, particularmente em tecidos. A possibilidade de comparar o sangue com tecidos selecionados em animais de experimentação ajudará a ponte entre a ciência básica ea medicina clínica, na medida do utilitário de diagnóstico e prognóstico de NO biomarcadores na saúde e na doença. Portanto, a extrapolação do plasma ou do sangue para os tecidos estado NO específicos de interesse não é mais uma abordagem válida. Como resultado, os métodos de continuar a ser desenvolvido e validado que permitem a detecção e quantificação de NO e NO-produtos afins / metabolitos em múltiplos compartimentos de animais experimentais in vivo. O paradigma estabelecido de NO bioquímica da produção de NO sintases a ativação de guanilato ciclase solúvel (GCs) à oxidação eventual a nitrito (NO 2 -) e nitrato (NO 3 -) pode representar apenas parte de NO de efeitos in vivo. A interacção de metabolitos de NO e NO-derivada com tióis proteicos, aminas secundárias, e metais para formar S-nitrosothióis (RSNOs), N-nitrosaminas (RNNOs), e nitrosilo-heme representam respectivamente cGMP-independentes efeitos de NO e são susceptíveis tão importante como fisiologicamente activação de sGC pelo NO. Uma compreensão verdadeira de NO na fisiologia é derivado a partir de experiências in vivo de amostragem compartimentos múltiplos simultaneamente. O óxido nítrico metodologia (NO) é uma ciência complexa e muitas vezes confuso e o foco de muitos debates e discussão sobre NO bioquímica. A elucidação de novos mecanismos e vias de sinalização envolvendo NÃO depende de nossa capacidade de, especificamente, de forma seletiva e sensível detectar e quantificar todas as informações relevantes e NÃO NO produtos e metabólitos em matrizes biológicas complexas. Aqui, nós apresentamos um método para a análise rápida e sensível de nitrito e nitrato por HPLC, bem como a detecção de NO livre em amostras biológicas utilizando in vitro de quimioluminescência ozono com base com derivitazation química para determinar a fonte molecular de NO, bem como ex vivo comMiografia banho de órgãos.
Protocol
1. Coleta de Sangue Total
- Coletar sangue venoso de humanos ou de animais experimentais em ELm / tubos contendo EDTA.
- Imediatamente girar sangue em uma centrífuga de bancada a 14.300 rcf (força centrífuga relativa) por 7 minutos para o preparo do plasma e dos glóbulos vermelhos pelota.
- Preparar amostras de plasma para cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e detecção por quimioluminescência (CLD) análise.
HPLC: Adicionar 01:01 volume de metanol frio para o plasma, vortex e centrifugar a 13.200 rpm durante 10 minutos para precipitar as proteínas plasmáticas. Recolher o sobrenadante para análise por HPLC.
Cale: alíquota de uma amostra e pré-incubar com sulfanilamida e cloreto mercúrico a nitrosotióis especificamente ensaio. - Prepare células vermelhas do pellet para HPLC e análise CLD.
HPLC: 01:04 Adicionar vermelho pellet celular a uma solução de lise hipotónico contendo 10 mM de NEM, 2,5 mM de EDTA e 10 mM de ferricianeto. Vortex completamente e em seguida, adicione 1:1 metanol, vórtice e centrifEGD em 13.200 rpm durante 10 minutos para a proteína precipitado. Recolher o sobrenadante para análise por HPLC.
CLD. Adicionar 01:04 vermelho pellet celular a uma solução de lise hipotónico contendo 10 mM de EDTA, 2,5 mM de EDTA e 10 mM de ferricianeto. Partes alíquotas para tubos contendo cloreto de sulfanilamida e mercúrico para a detecção específica de nitrosotióis.
2. Extração de Tecidos e Preparação
- Para determinar os níveis de tecido de metabólitos, é primeiro necessário para colher tecido sanguíneo livre para a preparação da amostra, como descrito acima. Uma troca de sangue completo terá lugar através da infusão de tampão fisiológico através do vértice do ventrículo esquerdo. Uma vez que todo o sangue é removido, os tecidos de interesse pode então ser colhido.
- Homogeneizar amostras de tecido e preparar amostras como descrito acima para HPLC e análise CLD.
3. Isolamento anéis de aorta para a função endotelial
Banho de órgãos de tecido
- Ratos será Anesthetized com éter dietílico até já não respondem ao toe pitada, e passam por deslocamento cervical antes da cirurgia. Um toracotomia é realizada para expor aorta torácica e abdominal. Uma seringa de calibre 25 é inserido no ápice do ventrículo esquerdo e perfundidos livre de sangue oxigenado com tampão de Krebs Henseleit.
- O átrio direito é cortado para proporcionar uma saída para o sangue. Aorta abdominal será removido e limpo de adventícia.
- Anéis irá ser cortado em segmentos longos 2 mm e montado sobre um banho de órgãos de quatro canais de tecido (DMT 720MO, instrumentos ad) banhadas em solução de tampão fisiológico.
- Anéis de vasos são mantidos em banhos de órgãos de 10 ml com tampão de Krebs oxigenada (95% de O2 e 5% de CO 2), a 37 ° C. Um grama pretensão é colocado em cada anel aórtico (tensão de partida apropriado para a função vasomotora óptima, tal como determinado em experiências anteriores). Um oito canais octal ponte (Powerlab) e de aquisição de dados de software (Gráfico versão 5.2.2) umaestá acostumado a gravar todas as medidas de força.
- Os anéis são deixadas equilibrar durante 80 minutos com o tampão em cada banho de órgãos mudado cada 20 min. Após o equilíbrio por 80 min, 1 mM de fenilefrina é adicionado a cada anel para a contração submáxima.
- Após estabilização, agonista endotelial como a acetilcolina será adicionado para determinar a produção de NO e grau de relaxamento do vaso. Após a resposta à dose para a acetilcolina, banhos serão lavadas e recontracted e depois tratada com uma fonte exógena de óxido nítrico, nitroprussiato de sódio para determinar a resposta do músculo liso e para obter um valor para o relaxamento de 100%.
- NO scavengers pode ser adicionado ao banho para ilustrar claramente libertação de NO e de inibição de relaxamento do vaso.
4. Os resultados representativos
A utilização do ENO-20 dedicado HPLC fornece um método mais fácil de usar com rendimento elevado para a detecção específica e sensível de nitrito e nitrato namatrizes biológicas. O princípio de detecção e um cromatograma original é mostrada na Figura 1. Este método pode ser usado para qualquer amostra biológica para a determinação de nitrito e nitrato. Detecção baseada em CLD de metabólitos do requer um passo de derivatização química para determinar a fonte molecular do NO. A configuração experimental para desnitrosação oxidativo simultânea e desnitrosação redutiva para o detector de quimioluminescência é mostrado na Figura 2. O vaso de reacção do lado direito é preenchido com ferricianeto de 800mm em PBS pH 7,4 e do vaso de reacção do lado esquerdo é preenchido com a mistura de iodeto / iodeto de potássio em ácido acético para desnitrosação redução (Figura 2A). Toda a configuração é mostrada na Figura 2B. A Figura 3 ilustra ensaios de grupos específicos desnitrosação que podem detectar e quantificar nitrito, nitrosotióis, nitrosaminas, bem como produtos de heme nitrosilo. Este método tem sido previamente descricama e validado 4,5. Estas análises bioquímicas importantes pode facilmente ser correlacionada com os estudos funcionais em anéis de aorta isolados para determinar a produção de NO endotelial em animais experimentais. Este experimento clássico farmacológico pode facilmente e com precisão avaliar a função endotelial de NO e de produção. Medindo reactividade vaso aos agonistas endoteliais, tais como a acetilcolina pode determinar directamente a produção de NO endotelial que pode então ser correlacionada com os biomarcadores bioquímicos detectados no sangue e nos tecidos dos animais experimentais. Uma representação típica de uma resposta à dose para a acetilcolina é mostrado na Figura 4. Camundongos de controle saudáveis com função endotelial normal responder a acetilcolina, relaxando. Os ratos com disfunção endotelial (ratos hipercolesterolêmicos) mostram relaxamento reduzida devido à redução da produção ao mesmo estímulo.
FigoA Figura 1. Princípio da detecção de nitrito e nitrato por ENO-20 e cromatograma da amostra. (Top) Esquema de ENO-20 método de detecção de nitrito e nitrato. (Inferior) chromotogram padrão de 10 pmol de nitrito e nitrato injectado ENO-20 (100 uL de solução 100 nM de nitrito e nitrato). Sensibilidade de 1 nM para cada anião com 100 ul volume de injecção. Não há interferência com a proteína ou espécies coloridas.
Figura 2. Configuração CLD experimental usando tanto desnitrosação oxidativo por desnitrosação ferricianeto e redutora usando iodeto / iodo ensaio com detecção de fase gasosa de gás de óxido nítrico purgado.
Figura 3. (Painel A) de detecção de quimioluminescência de nitrito, RSNO, RNNO no ensaio desnitrosação redutora por pré-incubação da amostra com o grupo de chemic específicoai reagentes. Subtração das áreas dos picos permitir a detecção de nitrito e RSNOs. (Painel B) de detecção quimioluminescente de espécies heme nitrosilo usando solução de ferricianeto de desnitrosação oxidativo. Este método é específico para o NO heme-produtos sem reactividade cruzada com RSNOs (GSNO ou SNO-albumina), ou RNNO (NO-pirrolidina e N-nitroso-albumina).
Figura 4. Ex banho de órgãos in vivo em anéis de aorta isolados fornece uma medida directa da produção de NO endotelial que pode então ser correlacionada com os biomarcadores bioquímicos detectados por HPLC e CLD. Esta figura ilustra o relaxamento reduzido nos ratinhos com disfunção endotelial devido à diminuição da produção de NO.
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Discussion
Os métodos descritos aqui para a quantificação de metabólitos do NO relevantes em vários compartimentos biológicos permitirá para o fingerprinting de NO biologia na saúde e na doença que podem ser correlacionados com as medições funcionais de NO pelo endotélio. Estes métodos requerem preparação de amostras simples, com potencial de adaptação para a produção elevada. A quantidade relativa destas moléculas pode ajudar a compreender a produção de NO e sua transformação metabólica num certo número de modelos experimentais de doença e mesmo amostras seriadas de pacientes humanos. Existem muitas armadilhas na detecção de biomarcadores NÃO base e muitos métodos analíticos produzir artificialmente alguns desses produtos durante a preparação da amostra. Contabilidade cuidadosa de nitrito em amostras biológicas é crítica devido à sua reactividade com tióis de cisteína 6 e formação de artefatual de nitrosotióis 7. CLD metodologias de base para a detecção específica de nitrito sob condições anaeróbicas em levar aresultados consistentes, devido à actividade de enzimas específicas redutase de nitrito em diferentes compartimentos biológicos 8. Todos os métodos aqui descritos estão bem documentados e validado e ter em consideração os passos para eliminar ou reduzir os artefactos 9. Iremos descrever as etapas críticas necessárias para evitar artefatos. Este rastreio em vários compartimentos de metabólitos do irá ajudar na identificação de biomarcadores relevantes que podem ter utilidade para diagnóstico ou prognóstico em seres humanos e permitirá então que para o desenvolvimento de métodos normalizados que podem ser utilizados na clínica ou para a análise de laboratório padrão. O reconhecimento recente de um ciclo de nitrogênio humano pelo qual nitrato e nitrito são reduzidos a NO por uma circulação enterosalivary de nitrato de 10,11 agora abre a possibilidade para usar saliva como biomarcador potencial para NO estado em certas doenças. Até à data não estado não faz parte da química do sangue padrão utilizado rotineiramente para fins de diagnóstico em pacientes. Thestá é chocante dada a natureza crítica de nenhum processo de muitas doenças. Em última instância, determinar os níveis desses biomarcadores NO relacionados por fácil de usar e laterais cama talvez rápida ponto-of-care ensaios após validação adequada será um verdadeiro testamento de seu papel na medicina molecular. É prudente neste momento de esforço concentrado e combinado no campo para validar e desenvolver um teste padrão e precisa para determinar o status NO em modelos animais para a validação em seres humanos. Os métodos descritos neste protocolo vai permitir que outros a adoptar rapidamente um método de consenso para tais medições.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Hong Jiang, Ph.D. e Deepa Parathasarthy, MPH, BDS para a assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23030 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 | |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 | |
| Autosampler | Alcott | ||
| DMT Myograph | ADInstruments | ||
| PowerLab | ADInstruments | ||
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
References
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