Summary
Nitrik oksit (NO) endojen üretimi biyolojik fonksiyonları çok çeşitli düzenler. Bu NO dayalı sinyal bozulması veya düzensizliği birçok insan hastalıkları dahil olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Yöntem NO metabolitleri insan hastalığı için yeni tanısal veya prognostik biyolojik sağlayabilir ilgili ölçmek için.
Abstract
Nitrik oksit (NO) biyolojik sistemler (kan dolaşımında, 1 saniyeden az) 1 derece kısa ömürlü bir iki atomlu serbest radikaldir. NO dahil olmak üzere temel işlevleri düzenleyen, vücudumuzda üretilen en önemli sinyal molekülleri biri olarak ancak kan basıncı, bağışıklık yanıtı ve sinirsel iletişim düzenleme ile sınırlı değildir olabilir. Bu nedenle biyolojik matrisler onun doğru tespiti ve miktar tayini sağlık ve hastalık NO rolünü anlamak için önemlidir. NO gibi kısa bir fizyolojik yarı ömrü ile, NO biyokimya reaksiyon ürünlerinin tespiti için alternatif stratejiler geliştirilmiştir. Çoklu biyolojik bölümlerinde ilgili NO metabolitleri miktarının in vivo açısından NO üretimini, biyoyararlanım ve metabolizması ile değerli bilgiler sağlar. Sadece kan veya plazma gibi tek bir bölme örnekleme her zaman tüm bo doğru bir değerlendirme sağlamak olmayabilirözellikle dokularda, NO durumu dy. Deney hayvanlarında seçin dokuları ile kan karşılaştırmak için yeteneği kadar sağlık ve hastalık NO biyobelirteçlerin tanısal ve prognostik programı gibi temel bilim ve klinik tıp arasındaki uçurumu yardımcı olacaktır. Bu nedenle, belirli ilgi dokulara plazma ya da kan NO durumu ekstrapolasyon artık geçerli bir yaklaşımdır. Sonuç olarak, metotları geliştirmiş ve in vivo deneysel hayvan birden bölümlerinde NO ve NO ile ilgili ürünler / metabolitlerinin saptanması ve miktarının izin hangi geçerliliği devam etmektedir. Ve nitrat (NO 3 -) - nitrit (NO 2) nihai oksidasyona çözünür guanil siklaz (SGC) aktivasyonu NO sentaz tarafından üretim NO biyokimya kurulan paradigması sadece in vivo NO etkilerini bir parçasını temsil edebilir. S-nitrosothi oluşturmak üzere proteini tiyoller, ikincil aminler, ve metaller ile NO ve NO-türevi metabolitlerinin etkileşimiols (RSNOs), N-nitrozaminler (RNNOs) ve nitrosil heme-sırasıyla NO cGMP bağımsız etkilerini temsil eder ve NO SGC aktivasyonu gibi fizyolojik olasılığı kadar önemlidir. Fizyolojisi NO gerçek bir anlayış aynı anda birden fazla bölmeli örnekleme in vivo deneyler türetilmiştir. Nitrik oksit (NO) metodolojisi YOK biyokimya ile ilgili pek çok tartışma ve tartışma karmaşık ve çoğu zaman kafa karıştırıcı bilim ve odak noktasıdır. Yeteneğimizi özellikle üzerine NO menteşeleri içeren yeni mekanizmalar ve sinyal yollarının aydınlatılması, seçici ve hassas tespit ve NO ile ilgili tüm kompleks biyolojik matrisler NO ürünleri ve metabolitleri ölçmek. Burada, bir HPLC ile nitrit ve nitrat hızlı ve duyarlı analiz yöntemi gibi NO moleküler kaynak yanı sıra ile ex vivo olarak belirlemek için kimyasal derivitazation ile in vitro ozon bazlı chemiluminescence kullanarak biyolojik örnekler serbest NO algılanmasıorgan banyosu kasılmaların kâğıda çizilmesi.
Protocol
1. Tam Kan Toplama
- İnsanlarda veya NEM / EDTA içeren tüplerde deney hayvanları gelen venöz kan toplayın.
- Hemen 7 dakika rcf (göreceli merkezkaç kuvveti) plazma ve kırmızı kan hücre pelletini hazırlamak için 14.300 bir tezgah üstü santrifüj kan aşağı doğru döndürün.
- Yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ve chemilüminesan algılama (CLD) analizi için plazma örnekleri hazırlayın.
HPLC: Plazma, çökelti plazma proteinlerine 10 dakika 13,200 rpm'de vorteks ve santrifüj soğuk metanol 1:1 hacim ekleyin. HPLC analizi için supernatant toplamak.
CLD: kısım özellikle tahlil nitrozo için Sulfanilamide ve cıva klorid ile örnek ve preincubate. - HPLC ve CLD analizi için kırmızı hücre pelletini hazırlayın.
HPLC: 10 mM Milli Ekonomi Modeli'nde, 2.5 mM EDTA ve ferrisiyanür 10 mM içeren bir hipotonik lizis çözüm ekle 01:04 kırmızı hücre pelet. Vortex iyice ve sonra 1:1 metanol, girdap ve centrif ekleyinÇökelti proteine 10 dakika süreyle 13.200 rpm uge. HPLC analizi için supernatant toplamak.
CLD. 10 mM EDTA, 2.5 mM EDTA ve 10 mM ferrisiyanür ihtiva eden bir çözeltiye hipotonik lizis 01:04 kırmızı hücre peleti ekleyin. Tablet örnekleri nitrozo belirli tespiti için Sulfanilamide ve cıva klorid içeren tüplere.
2. Doku Ekstraksiyon ve Hazırlık
- NO metabolitlerinin doku seviyelerini belirlemek için, yukarıda tarif edildiği gibi örneği hazırlamak için kan serbest doku hasat etmek için gerekli olan ilk. Tam kan değişimi sol ventrikül apeks yoluyla fizyolojik tampon beslerken tarafından gerçekleştirilecektir. Tüm kan kaldırıldıktan sonra, ilgi dokular olabilir.
- Doku örnekleri homojenize ve HPLC ile analiz CLD için yukarıda tarif edildiği gibi örnekler hazırlanır.
3. Endotel Fonksiyon için Aort Yüzük İzolasyonu
Doku Organ Banyosu
- Fareler Anest olacaktırartık duyarlı tutam dizilmek ve cerrahi öncesi servikal dislokasyon geçmesi kadar dietil eter ile hetized. Bir torakotomi torasik ve abdominal aorta göstermek için yapılır. Bir 25 gauge şırınga sol ventrikül apeksi içine yerleştirilir ve oksijenli Krebs Henseleit tamponu ile kan serbest perfüze edilmiştir.
- Sağ atrium kan için bir çıkış sağlamak için kesilir. Abdominal aort kaldırıldı ve adventisyanın temizlenecektir.
- Halkalar 2 mm uzunluğunda parçalara kesilmiş ve fizyolojik bir tampon çözeltisi içinde kalmış bir dört-kanallı doku organ banyosu (DMT 720MO, AD Araçlar) üzerine monte edilecektir.
- Damar halkaları 37 ° C'de oksijenli Krebs tampon (95% O 2 ve% 5 CO2) ile 10 ml organ banyosu içinde tutulur Bir gram öngermeli her aort halkası (önceki deneylerde belirlendiği gibi uygun vazomotor işlev için uygun başlangıç gerilimi) üzerine yerleştirilir. Sekiz kanallı sekizlik köprü (Powerlab) ve veri toplama yazılımı (Grafik sürüm 5.2.2) birBütün kuvvet ölçümleri kaydetmek için kullanılır yeniden.
- Yüzüklerin her organ banyosunda tampon 80 dakika her 20 dakikada değişti için dengelenmesi için izin verilir. 80 dk için dengeleme sonra, 1 uM fenilefrin submaksimal kasılması için, her bir halka eklenir.
- Stabilize edildikten sonra, bu tür asetilkolin olarak endotelial agonist damar gevşemesi NO üretimini ve derecesi belirlemek üzere eklenir. Asetilkolin için doz yanıt sonra, hamamlar nitrik oksit, düz kas yanıt belirlemek için ve% 100 rahatlama için bir değer almak için nitroprussid dışsal kaynağı ile yıkanır ve recontracted ve daha sonra ele alınacaktır.
- NO temizleyiciler açıkça damar rahatlama ve NO inhibisyonu serbest göstermek için banyo eklenebilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
ENO-20 özel HPLC kullanımı, nitrit ve nitrat spesifik ve duyarlı, yüksek verimlilik yöntemi kullanımı kolay sağlarbiyolojik matrisler. Algılama ve orijinal bir kromatogramıdır ilkesine Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu yöntem, nitrit ve nitrat belirlenmesi için herhangi bir biyolojik numune için kullanılabilir. NO metabolitlerinin CLD tabanlı algılama NO moleküler kaynağını belirlemek için bir kimyasal derivitization adım gerektirir. Kemilüminesans detektörü için eşzamanlı oksidatif denitrosation ve indirgeyici denitrosation için deney düzeneği Şekil 2 'de gösterilmiştir. Sağda Reaksiyon kabı PBS pH 7.4 'de 800mm ferrisiyanür ile doldurulur ve sol tepkime kabına redüksiyon denitrosation için asetik asit (Şekil 2A) potasyum iyodür / iyot karışımı ile doldurulur. Tüm kurulum Şekil 2B 'de gösterilmiştir. Şekil 3 grubunun spesifik denitrosation nitrit algılamak ve sayısal olarak deneyler, nitrozo, nitrozaminler gibi nitrosil heme ürünler göstermektedir. Bu yöntem, daha önce tarif olmuşturyatak ve 4,5 doğrulandı. Bu önemli biyokimyasal analizler kolayca endotel deney hayvanlarında NO üretimini belirlemek için izole aort halkaları üzerinde fonksiyonel çalışmalar ile korele edilebilir. Bu klasik farmakolojik deney kolayca ve doğru endotel fonksiyonu ve üretim NO değerlendirebilir. Gibi asetilkolin gibi endotelyal agonistlere damar reaktivitesi Ölçme doğrudan sonra deney hayvanlarının kan ve doku tespit biyokimyasal belirteçler ile korele edilebilir endotelyal NO üretimini belirleyebilirsiniz. Asetilkolin için bir doz-yanıt tipik bir temsilini Şekil 4 'de gösterilmiştir. Normal endotel fonksiyonu ile sağlıklı kontrol fareleri rahatlatarak asetilkolin yanıt. Endotel disfonksiyonu ile Fare (hiperkolesterolemik fareler) aynı uyarana NO üretimi azalır dolayı daha az rahatlama gösterir.
Incirure 1. ENO-20 ve örnek kromatogram tarafından nitrit ve nitrat saptama ilkesi. Nitrit ve nitrat için algılama ENO-20 yöntemi (Üst) Şematik. (Alt) 10 pmol nitrit ve nitrat standart chromotogram ENO-20 (nitrit ve nitrat 100 nM çözümü 100 ul) enjekte edildi. 100 ul her bir enjeksiyon hacmi ile anyon için 1 nM duyarlılığı. Proteini veya renkli türleri ile hiçbir müdahale.
Tasfiye nitrik oksit gaz gaz faz algılama ile iyodür / iyot testi kullanılarak ferrisiyanür ve indirgeyici denitrosation tarafından hem oksidatif denitrosation kullanarak Şekil 2. CLD deney düzeneği.
Şekil 3. (Panel A) grubu belirli Chemic ile örnek preinkübasyon tarafından indirgeyici denitrosation tayininde nitrit Kemilüminesans algılama, RSNO, RNNOal reaktifler. Pik alanlarının Çıkarma nitrit ve RSNOs algılanmasını sağlar. Ferrisiyanür oksidatif denitrosation çözeltisi kullanılarak nitrosil heme türlerinin (panel B) Chemiluminescent tespiti. Bu yöntem, RSNOs (GSNO ya SNO-albümini), ya da RNNO (NO-pirolidin ve N-nitrozo-albümini) ile bir çapraz reaktivitesi olan NO-heme ürünler için özel.
Şekil 4. Izole aort halkaları üzerinde ex vivo organ banyosu sonra HPLC ve CLD tarafından tespit biyokimyasal belirteçler ile korele edilebilir endotelyal NO üretimini doğrudan bir ölçü sağlar. Bu rakam NO üretiminin azalması nedeniyle endotel disfonksiyonu ile farelerde azalmış rahatlama gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yöntemleri çoklu biyolojik bölümlerinde ilgili NO metabolitlerinin ölçümü için burada açıklanan endotelde NO fonksiyonel ölçümleri ile korele edilebilir sağlık ve hastalık NO biyoloji parmak izi için izin verecektir. Bu yöntemler, yüksek verimlilik için uyum potansiyeli olan basit örnek hazırlama gerektirir. Bu moleküllerin miktarı nispi hastalığın deneysel modellerinde ve insan hastalarda bile seri örnekleri arasında bir sayı, NO üretimini ve metabolik akıbeti anlamak yardımcı olabilir. Yapay numune hazırlama sırasında bu ürünlerin bazı üretmek NO bazlı biyolojik ve birçok analitik yöntemlerin belirlenmesinde birçok tuzaklar vardır. Biyolojik örneklerde nitrit dikkatli muhasebe nedeniyle sistein tiyoller 6 ve nitrozo 7 artefakt oluşumu ile reaktivite için çok önemlidir. Anaerobik koşullarda nitrit belirli tespiti için CLD tabanlı metodolojileri yolfarklı biyolojik bölmeleri 8 belirli nitrit redüktaz enzim aktivitesine bağlı tutarlıdır sonuçlanır. Burada anlatılan yöntemlerin tümü iyi belgelenmiş ve onaylanmış ve eserler 9 ortadan kaldırmak veya azaltmak için göz önünde adımlar vardır. Biz eserler önlemek için gerekli kritik adımları anlatacağız. NO metabolitleri Bu çok bölmeli tarama insanlarda tanı veya prognostik yardımcı olabilir ve daha sonra klinikte veya standart laboratuar analizi için kullanılan standart yöntemlerin gelişmesi için olanak sağlayacak ilgili biyolojik belirlenmesine yardımcı olacaktır. Nitrat ve nitrit nitrat 10,11 bir enterosalivary sirkülasyonu ile NO indirgenir sayede bir insan azot döngüsünün son tanınması artık bazı hastalıklarda NO durumu için potansiyel bir belirteç olarak tükürük kullanarak potansiyel açılır. NO durumu Bugüne kadar hastalarda tanı amacıyla rutin olarak kullanılan standart kan kimyası bir parçası değildir. ThNO birçok hastalık sürecinin kritik doğası nedeniyle şok olduğu edilir. Sonuçta, kolay bu NO ilgili biyobelirteçlerin belirlenmesi düzeyde kullanmak için ve yeterli doğrulama sonra belki de hızlı yatakta yan nokta-bakım testleri moleküler tıp rollerini gerçek bir kanıtı olacaktır. İnsanlarda doğrulama için hayvan modellerinde NO statüsünün belirlenmesi için bir standart ve doğru tahlil doğrulamak ve geliştirme alanında yoğun ve birleşik çabaları bu noktada isabetli olmuştur. Bu protokolün açıklanan yöntemler diğerleri hızla bu ölçümler için bir uzlaşma yöntemini benimsemeye sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Hong Jiang, doktora teşekkür etmek istiyorum ve Deepa Parathasarthy, MPH, teknik yardım için BDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23030 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 | |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 | |
| Autosampler | Alcott | ||
| DMT Myograph | ADInstruments | ||
| PowerLab | ADInstruments | ||
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
References
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
- Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
- Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
- Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
- Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
- Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
